CN105567851A - 一种与糖尿病相关的分子标志物 - Google Patents

一种与糖尿病相关的分子标志物 Download PDF

Info

Publication number
CN105567851A
CN105567851A CN201610112211.3A CN201610112211A CN105567851A CN 105567851 A CN105567851 A CN 105567851A CN 201610112211 A CN201610112211 A CN 201610112211A CN 105567851 A CN105567851 A CN 105567851A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
diabetes
krt23
chip
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610112211.3A
Other languages
English (en)
Inventor
肖枫
杨承刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201610112211.3A priority Critical patent/CN105567851A/zh
Publication of CN105567851A publication Critical patent/CN105567851A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种与糖尿病相关的分子标志物，I型糖尿病患者血液中的KRT23基因呈高表达，通过检测患者血液中KRT23基因的表达水平可以判断患者是否患有I型糖尿病或患I型糖尿病的概率。本发明提供了一种特异、灵敏的实现I型糖尿病早期诊断的手段。

Description

一种与糖尿病相关的分子标志物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种与糖尿病相关的分子标志物。
背景技术
糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的常见、多发病，其患病率随着人民生活水平的提高、人口老龄化和生活方式的改变迅速增加。据世界卫生组织(WHO)估计，全球目前有超过1.5亿糖尿病患者，到2025年这一数字将增加一倍。我国现有糖尿病患者3千万，居世界第2位。糖尿病已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，对社会和经济带来沉重的负担，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。根据WHO和国际糖尿病联盟(IDF)专家组的建议，糖尿病可分为I型、II型、其他特殊类型及妊娠糖尿病四种。研究表明，I型糖尿病占糖尿病总发病人数的7％～10％，且近年来该病的发病率呈逐年上升趋势。
糖尿病患者常伴有各种并发症或伴随症，糖尿病使前列腺癌以外的所有部位癌症的发生风险增加30％。在美国，亚洲受试者已知比非亚洲受试者有更高的患癌风险，特别是患肝癌和胃癌。这些癌症发展的倾向可能与外界致癌物质和由高血糖，高血脂和肾衰竭引起的异常代谢环境之间的相互作用有关。此外，糖尿病患者或有患糖尿病风险的个体有极高的患心血管疾病的风险，原因是代谢环境的变化包括氧化应激、轻度炎症、血管钙化和贫血，增加了血管损伤的风险。
糖尿病的病因和发病机制较为复杂，至今尚未完全明了。目前认为I型糖尿病是一种在遗传与环境相互作用下，以T细胞介导的特异性胰岛β细胞自身免疫性破坏为主要发病机制的一种疾病。I型糖尿病具有多基因遗传背景，易感性十分复杂，疾病的发生是多种基因相互作用、相互影响的结果。
近年来，随着对I型糖尿病相关基因的研究日趋深入，尽管已报道了一些与I型糖尿病的发生发展相关的基因，但是临床上并没有有效的基因标志物来诊断糖尿病，因此发现一种特异性的I型糖尿病标志物应用于临床诊断具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与I型糖尿病相关的分子标志物-KRT23基因。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测KRT23基因表达水平的产品在制备诊断I型糖尿病工具中的应用。
进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测KRT23基因及其表达产物的表达水平以诊断I型糖尿病的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增KRT23基因的引物；所述用实时定量PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增KRT23基因的引物；所述用免疫检测诊断I型糖尿病的产品包括：与KRT23蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断I型糖尿病的产品包括：与KRT23基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断I型糖尿病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KRT23蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KRT23基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述用实时定量PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括的一对特异扩增FAN1基因的引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
进一步，所述诊断产品包括芯片和/或试剂盒；其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。所述基因检测试剂盒包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增KRT23基因和管家基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。
本发明提供了一种诊断I型糖尿病的工具，所述工具能够通过检测KRT23基因的表达水平来诊断I型糖尿病。
进一步，上面所述工具包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KRT23基因转录水平的针对KRT23基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的KRT23蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KRT23基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KRT23蛋白的特异性抗体。其中，所述基因检测试剂盒可用于检测包括KRT23基因在内的多个基因(例如，与I型糖尿病相关的多个基因)的表达水平；所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括KRT23蛋白在内的多个蛋白质(例如与I型糖尿病相关的多个蛋白质)的表达水平；所述基因芯片可用于检测包括KRT23基因在内的多个基因(例如，与I型糖尿病相关的多个基因)的表达水平；所述蛋白质芯片可用于检测包括KRT23蛋白在内的多个蛋白质(例如与I型糖尿病相关的多个蛋白质)的表达水平；通过将多个与I型糖尿病的标志物同时检测，可大大提高I型糖尿病诊断的准确率。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
进一步，上面所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测KRT23基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对KRT23基因的引物和/或探针。
进一步，所述扩增KRT23基因的引物对序列包括正向引物SEQIDNO.3和反向引物SEQIDNO.4。
用于诊断I型糖尿病的样本来源包括但不限于血液、组织、尿液、唾液、脊髓液等。在本发明的具体实施方案中，用于诊断I型糖尿病的样本来源是血液。
本发明中与KRT23基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明中所述KRT23蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述KRT23蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KRT23蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。
在本发明的上下文中，“KRT23基因”包括人KRT23基因以及人KRT23基因的任何功能等同物的多核苷酸。KRT23基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中KRT23基因(NC_000017.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，KRT23基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：
(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述KRT23基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。
本发明的KRT23基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达KRT23的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
在本发明的上下文中，KRT23基因表达产物包括人KRT23蛋白以及人KRT23蛋白的部分肽。所述KRT23蛋白的部分肽含有与I型糖尿病相关的功能域。
“KRT23蛋白”包括KRT23蛋白以及KRT23蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括KRT23蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人KRT23的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，KRT23蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述KRT23蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质，提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是KRT23蛋白的融合蛋白。对于与KRT23蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留KRT23蛋白的生物学活性即可。
本发明的KRT23蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留KRT23蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了KRT23基因表达与I型糖尿病的发生发展相关，通过检测受试者血液中KRT23的表达水平，可以判断受试者是否患有I型糖尿病、或者判断受试者是否存在患有I型糖尿病的风险，使得诊断更及时、更特异、更灵敏，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
附图说明
图1显示高通量测序法检测KRT23基因在II型糖尿病患者中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测KRT23基因在I型糖尿病患者中的表达情况。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与I型糖尿病相关的基因标志物
1、样品收集
各收集10例健康人血液和I型糖尿病患者血液样本，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备及质量分析
2.1RNA样品的制备
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中；
2)收集血细胞：3000rpm离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；
3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物；
4)3000rpm离心5min；
5)重复步骤3)、4)两次(共三次)；
6)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认一下BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μlRNA裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；
7)加350μlRNA稀释液，颠倒混合3-4次；
8)置于70℃水浴中3min；
9)室温下13000g离心10min；
10)将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；
11)向澄清裂解液中加入200μl95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；
12)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，确认一下RNAWashSolution已用乙醇稀释，加600μlRNA洗涤液于离心柱装配体，13000g离心1min；
13)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；
14)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μlDNA酶终止缓冲液(确认已加入乙醇)，13000g离心1min；
15)加入600μlRNA洗涤液(已加入乙醇)，13000g，离心1min；
16)清空收集管，向离心柱内加入250μlRNA洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min；
17)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于-70℃。
2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3RNA样品的质量分析(AgilentTechnologies2100Bioanalyzer)
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28SrRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
3、高通量转录组测序
3.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3.3差异表达基因的检测
将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果如图1所示，KRT23基因在I型糖尿病患者血液中的表达量显著高于健康人的表达量。
实施例2QPCR测序验证KRT23基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择KRT23基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择I型糖尿病患者血液和健康人血液各70例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
(1)取总RNA2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀；70℃水浴；5min后立即冰浴2-3min；
(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV200U/μl，补无核酶水至25μl；
(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV；
(4)-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中KRT23基因和β-actin基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
KRT23基因：
正向引物为5’-GTCAATGTGAAGGTGGAT-3’(SEQIDNO.3)；
反向引物为5’-GCTCATATTCTTGTCTCATATC-3’(SEQIDNO.4)。
β-actin基因：
正向引物为5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’(SEQIDNO.5)；
反向引物为5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’(SEQIDNO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃30s)×42个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图2所示，与健康人血液相比，KRT23基因在I型糖尿病患者血液中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测KRT23基因表达水平的产品在制备诊断I型糖尿病工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测KRT23基因的表达水平以诊断I型糖尿病的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增KRT23基因的引物；所述用实时定量PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增KRT23基因的引物；所述用免疫检测诊断I型糖尿病的产品包括：与KRT23蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断I型糖尿病的产品包括：与KRT23基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断I型糖尿病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KRT23蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KRT23基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括的一对特异扩增FAN1基因的引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片和/或试剂盒；其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。
6.一种诊断I型糖尿病的工具，其特征在于，所述的工具能够通过检测样本中KRT23基因的表达水平来诊断I型糖尿病。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测KRT23基因转录水平的试剂包括针对KRT23基因的引物和/或探针。
9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述扩增KRT23基因的引物对序列包括正向引物SEQIDNO.3和反向引物SEQIDNO.4。
10.根据权利要求5-9任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。
CN201610112211.3A 2016-02-29 2016-02-29 一种与糖尿病相关的分子标志物 Pending CN105567851A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610112211.3A CN105567851A (zh) 2016-02-29 2016-02-29 一种与糖尿病相关的分子标志物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610112211.3A CN105567851A (zh) 2016-02-29 2016-02-29 一种与糖尿病相关的分子标志物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105567851A true CN105567851A (zh) 2016-05-11

Family

ID=55878467

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610112211.3A Pending CN105567851A (zh) 2016-02-29 2016-02-29 一种与糖尿病相关的分子标志物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567851A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105969897A (zh) * 2016-07-21 2016-09-28 中国人民解放军第四军医大学 一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒及lncRNA-H19的应用
CN106011288A (zh) * 2016-07-27 2016-10-12 北京泱深生物信息技术有限公司 多发性骨髓瘤诊治标志物及其应用
CN108949965A (zh) * 2018-08-22 2018-12-07 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Snp标志物在ii型糖尿病诊断中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102317786A (zh) * 2007-04-18 2012-01-11 特提斯生物科学公司 糖尿病相关性生物学标记物及其使用方法
CN104073556A (zh) * 2014-05-20 2014-10-01 宁波大学 一种辅助诊断糖尿病的检测试剂盒及其使用方法
CN104520707A (zh) * 2012-05-24 2015-04-15 欧尔本生物科技有限责任公司 糖尿病生物标记物
CN105274223A (zh) * 2015-10-20 2016-01-27 张君 早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102317786A (zh) * 2007-04-18 2012-01-11 特提斯生物科学公司 糖尿病相关性生物学标记物及其使用方法
CN104520707A (zh) * 2012-05-24 2015-04-15 欧尔本生物科技有限责任公司 糖尿病生物标记物
CN104073556A (zh) * 2014-05-20 2014-10-01 宁波大学 一种辅助诊断糖尿病的检测试剂盒及其使用方法
CN105274223A (zh) * 2015-10-20 2016-01-27 张君 早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KARIN BIRKENKAMP-DEMTRÖDER等: "Keratin23 (KRT23) Knockdown Decreases Proliferation and Affects the DNA Damage Response of Colon Cancer Cells", 《PLOS ONE》 *
ZHANG J S等: "Homo sapiens keratin 23 (KRT23) mRNA, complete cds", 《GENBANK DATABASE》 *
ZHANG JS等: "Keratin 23 (K23), a novel acidic keratin, is highly induced by histone deacetylase inhibitors during differentiation of pancreatic cancer cells", 《GENES, CHROMOSOMES & CANCER》 *
冯晓燕等: "1型糖尿病免疫诊断标志物的研究进展", 《国际内分泌代谢杂志》 *
李通平: "糖尿病前期患者差异基因的筛选及鉴定", 《万方学位论文全文数据库》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105969897A (zh) * 2016-07-21 2016-09-28 中国人民解放军第四军医大学 一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒及lncRNA-H19的应用
CN106011288A (zh) * 2016-07-27 2016-10-12 北京泱深生物信息技术有限公司 多发性骨髓瘤诊治标志物及其应用
CN106011288B (zh) * 2016-07-27 2019-09-27 北京泱深生物信息技术有限公司 多发性骨髓瘤诊治标志物及其应用
CN108949965A (zh) * 2018-08-22 2018-12-07 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Snp标志物在ii型糖尿病诊断中的应用
CN108949965B (zh) * 2018-08-22 2019-09-03 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Snp标志物在ii型糖尿病诊断中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105400880B (zh) 急性心肌梗死早期诊断标志物
CN105296659B (zh) 一种与缺血性脑卒中相关的基因标记物
CN105543408A (zh) 冠心病早期诊断标志物
CN105567851A (zh) 一种与糖尿病相关的分子标志物
CN105506083A (zh) Capg在制备诊断帕金森症产品中的用途
CN105112552A (zh) Ift52基因在骨质疏松症诊断中的应用
CN105567861A (zh) Ifi27作为冠心病诊断标志物的用途
CN105695622B (zh) Pilra基因作为诊断骨质疏松症的分子标志物
CN108384847B (zh) Rnf182基因作为慢性阻塞性肺疾病的诊断标志物
CN105296658A (zh) Alkbh2基因在缺血性脑卒中诊断中的应用
CN105925714A (zh) 一种诊断缺血性脑卒中的分子标志物
CN107043811B (zh) Cfap20基因在骨质疏松症诊断中的应用
CN105567862B (zh) Cdk18在制备诊断冠心病产品中的用途
CN105238872B (zh) 检测caln1基因表达的产品在胆管癌诊治中的应用
CN105543400B (zh) I型糖尿病的分子标志物
CN110184269A (zh) Loc105377068诊断新用途
CN108624690A (zh) 一种左右半结肠腺癌早期筛查检测试剂盒及检测方法
CN107164507A (zh) 绝经后妇女原发性骨质疏松症的诊断工具
CN105567852A (zh) Iqce基因及其表达产物在i型糖尿病诊断中的用途
CN106367484A (zh) 分子标志物在诊断脓毒症中的应用
CN106520970B (zh) 用于诊断脑卒中的标志物
CN105112551A (zh) 检测eps8l3基因表达的试剂在制备骨质疏松症诊断产品中的应用
CN106119402A (zh) 一种脓毒症的分子诊断标志物
KR102622107B1 (ko) 장내 미생물을 이용한 간질환 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 그를 이용한 진단키트, 정보제공방법 및 간질환 예방 또는 치료제 스크리닝 방법
CN105925713A (zh) 缺血性脑卒中的分子诊断标志物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 1210, Building 3, Ronghua Xintai Building, 10 Ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant after: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

Address before: 100080 Beijing city Haidian District Shanyuan Street No. 1 cubic court building room 3103

Applicant before: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160511

RJ01 Rejection of invention patent application after publication