CN107267510B - 长链非编码lncRNA-OD1在骨质疏松症疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请人提供了一种长链非编码lncRNA‑OD1，其是由位于第18号染色体的基因转录产生而来：chr18:77343316‑77345492，hg19，基因序列长度为2177bp。本申请人还提供了一种所述的长链非编码lncRNA‑OD1在制备预测骨质疏松症的试剂、试剂盒或基因芯片中的应用。本发明通过基因芯片技术、生物信息学技术以及分子生物学技术确定骨质疏松过程中LncRNA是否会出现异常表达，了解LncRNA在骨质疏松发病过程中所发挥的作用，可为骨质疏松早期诊断提供新的线索，并有助于丰富骨质疏松发生的分子机制。

Description

长链非编码lncRNA-OD1在骨质疏松症疾病中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物医学技术领域，尤其是涉及一种长链非编码RNA在对骨质疏松症风险的评估及预防方面的应用。

背景技术

随着全球人口老龄化程度日益加剧，骨质疏松症已成为严重威胁社会公共卫生的疾病之一。骨质疏松在我国老年人中的发病率达到15.7％^[1]，其最严重的后果是骨质疏松性骨折，给患者的身心健康造成严重威胁、家庭造成极大的拖累、社会造成沉重的经济负担^[2]。因而，对骨质疏松症的早发现及防治显得尤为重要。

目前骨质疏松症的实验室检查有：(1)血钙、磷和碱性磷酸酶：在原发性骨质疏松症中，血清钙、磷以及碱性磷酸酶水平通常是正常的，骨折后数月碱性磷酸酶水平可增高。(2)血甲状旁腺激素：原发性骨质疏松症者血甲状旁腺激素水平可正常或升高。(3)骨更新的标记物：骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换(包括骨形成和骨吸收)状态，这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶(反应骨形成)、抗酒石酸酸性磷酸酶(反应骨吸收)、骨钙素(反应骨形成)、Ⅰ型原胶原肽(反应骨形成)、尿吡啶啉和脱氧吡啶啉(反应骨吸收)、Ⅰ型胶原的N-C-末端交联肽(反应骨吸收)。(4)晨尿钙/肌酐比值：正常比值为0.13±0.01，尿钙排量过多则比值增高，提示有骨吸收率增加可能。然而目前采取的实验室检查方法准确度还不够。骨质疏松症的辅助检查：临床上主要是通过影像学和骨密度测定，而辅助检查的对象一般是晚期患者，不能用于早期骨质疏松症患者的筛查。

骨的塑性和重建主要通过成骨细胞(osteoblast,OB)和破骨细胞(osteoclast,OC)实现，成骨细胞增加骨形成，破骨细胞减少骨生成，对于保持骨重塑过程的动态耦联平衡至关重要。大量研究结果显示骨质疏松过中的OB和OC事件都出现了异常，这一变化的背后是OB和OC内特定分子基因的表达失调。在基因表达的过程中各层次调节因素的变化最终都会导致基因的表达失调。

过去的研究结果显示在基因表达的过程中不同层次调节因素的变化最终都会导致基因的表达失调。在这些因素中，具有调节功能的非编码RNA的表达异常在近年来越来越受到学者们的关注。非编码RNA是一类没有蛋白编码功能的基因组转录产物，越来越多的证据表明非编码RNA在调节基因表达的众多过程中都有所参与。LncRNA(long noncodingRNA)是序列长度大于等于200nt的一类非编码RNA。在过去的十年间，研究者们发现了许多LncRNA，这些LncRNA被证实在人体生物学过程的每一个方面例如染色体剂量补偿、染色体印迹、染色质重塑、染色质集结、转录、剪切、细胞分化、细胞结构完整性、细胞周期调节、胞内运输、干细胞重编码和热休克反应等等都发挥了重要的作用。

非编码RNA有许多亚类，除了研究较为透彻的microRNA，越来越多的证据显示LncRNA在机体的很多生物学过程中都发挥着关键的调节作用，此外LncRNA的表达失调还与许多人类疾病的发生有着密切联系，例如神经退变和肿瘤。然而到目前为止还没有一项针对骨质疏松症过程中LncRNA表达情况的研究。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种长链非编码lncRNA-OD1在骨质疏松症检测中的应用。本发明可以用来诊断骨质疏松症的发生，可进行骨质疏松症风险的评估及预防，并从长链非编码RNA的角度揭示骨质疏松症发生的潜在机制。

本发明的技术方案如下：

一种长链非编码lncRNA-OD1，其是由位于第18号染色体的基因转录产生而来：chr18:77343316-77345492，hg19，基因序列长度为2177bp。

本申请人还提供了一种所述的长链非编码lncRNA-OD1在制备预测骨质疏松症的试剂、试剂盒或基因芯片中的应用。

本申请人还提供了一种预测骨质疏松症的定量PCR检测试剂盒，包括用于检测上述的长链非编码lncRNA-OD1的正向引物：

TACACTGACCCCACAGCCTATG；

和反向引物：

CATTTCCCAAGCAGGTTTCC。

本发明有益的技术效果在于：

本发明的目的是通过基因芯片技术、生物信息学技术以及分子生物学技术确定骨质疏松过程中LncRNA是否会出现异常表达，了解LncRNA在骨质疏松发病过程中所发挥的作用，可为骨质疏松早期诊断提供新的线索，并有助于丰富骨质疏松发生的分子机制。运用血液分子诊断标记物，能显著提高诊断的准确性，并对骨质疏松发病过程中LncRNA所发挥的功能进行预测和验证。

本发明的实现手段是利用高通量lncRNA芯片技术首先在不同骨质疏松症血液标本及健康对照者血液标本进行lncRNA表达谱的系统筛查，接着通过逐步扩大临床样本验证，确定可能与骨质疏松症相关的目标lncRNA。在此基础上，针对目标lncRNA结合临床病理资料分析，并进行细胞体外功能实验及初步机制研究，以揭示目标lncRNA对骨质疏松症破骨细胞功能的影响与潜在的调控途径。

本发明利用lncRNA芯片分别在骨质疏松症患者的血液中进行筛查，发现19415个骨质疏松症差异表达lncRNA。将骨质疏松症血液中lncRNA的表达量与正常血液中相比较，其中相对表达量比值在2倍以上，且差异具有统计学意义(P<0.05)的lncRNA作为是表达差异的lncRNA。结果相对表达量比值在2倍以上变化的共3636个，2倍以上上调的共2612个，2倍以上下调的共1024个，我们将均值Fold change提高到5倍及以进行筛选，结果发现5倍以上上调的共9个，5倍以上下调的共6个。

我们初步筛选出15个在上述不同组间比较中均呈现显著差异的lncRNA，进一步对其进行扩大临床样本(骨质疏松症组25例，正常组25例)的SYBR Green定量PCR验证，共获得2个与芯片结果基本一致的新lncRNA，而其中一个在体外破骨细胞分化中表达明显增多，并命名为lncRNA-OD1，通过PCR表达分析，提示lncRNA-OD1可能可能在骨质疏松症破骨细胞分化发生进展中起到促进作用。

本发明的原理是：

破骨细胞的起源和特征破骨细胞是骨骼的细胞成分之一，是生理状态下唯一具有骨吸收功能的细胞。破骨细胞来源于造血干细胞的粒细胞-巨噬细胞集落形成单位，是由其分化来的单核细胞融合而成。破骨细胞数量增多及其骨吸收活性增强，是骨质疏松症骨量丢失的一个重要方面。本发明充分利用课题组前期建立的骨质疏松症完备的临床资料和血液标本库，针对上述现实问题，重点关注血液单核细胞，从而为进一步在骨质疏松症临床样本中验证目标lncRNA的可信性提供坚实基础。

近年来随着研究的不断深入，愈来愈多的新lncRNA被发现，但多存在零散报道，一直缺乏在生物信息学方面对lncRNA进行系统描述。本发明直接关注在骨质疏松症血液单核细胞中呈现动态变化的lncRNA，并通过扩大临床标本量和体外破骨细胞分化进一步分析其表达差异，从而确定可能在骨质疏松症血液中发挥功能的lncRNA。

针对lncRNA-OD1序列，本发明的发明人查阅UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/)hg19数据库与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，发现在位于第18号染色体(chr18:77343316-77345492，hg18)，基因序列长度为2177bp，含有3个外显子，2个内含子，转录本序列长度为760nt。

本发明首次在骨质疏松症血液单核细胞中进行长链非编码RNA(lncRNA)表达谱的系统筛查、分析，获得了19615个骨质疏松症差异表达的lncRNAs。首次发现与骨质疏松症破骨细胞分化相关的lncRNA，即lncRNA-OD1。本发明在一系列基因实验证实的基础上进一步应用于实际临床的中，存在很高的开发价值。

附图说明

图1为血液样本RNA提取和芯片的部分质控结果，其中，A为RNA电泳图；B为实验所用的部分芯片外观图；C为芯片筛查后产生的扫描图。

图2为随机选取的5个探针号序列在原先用于芯片筛查的cDNA上进行定量PCR验证，发现定量PCR所反映的OP和NC的相对差异倍数值与芯片筛查所反映的倍数值之间均无显著统计学差异。

图3为差异lncRNA的筛选，其中，A为散点图；B为分聚类热图。图中红色代表相对高表达，绿色代表相对低表达。

图4为2个差异的lncRNA分别在OP组和NC组血液的差异表达。A为探针TR170015126；B为TR170015138。

图5为目标lncRNA-OD1的选择，其中，A为诱导分化的破骨细胞，左边图为阴性对照，右边图为分化的破骨细胞，包体大，多核等特征；B为探针TR170015126和TR170015138在破骨细胞分化中的mRNA表达；C为lncRNA-OD1基因在UCSC数据库上的位置图。

具体实施方式

下面结合附图和操作方法，对本发明进行具体描述。

1、方法

1.1 骨质疏松组：随意抽取医院骨科收治的10例原发性骨质疏松症的患者，男、女各5例，年龄65-75岁。纳入标准符合：《中国人骨质疏松症建议诊断标准》第二稿。无明显的心肝肺等其它疾病，无引起继发性骨质疏松症的各种疾病，排除由于甲状腺、肿瘤、糖尿病等其它严重疾病引起骨代谢者。正常组：选取年龄65-75岁的健康门诊志愿者10例，男、女各5例。两组之间的年龄、性别差异无统计学意义(p>0.01)，具有可比性。所有研究对象均知情同意。

1.2 血液RNA提取：采用TRI pure LS Reagent用于全血有核细胞的RNA抽提，1ml的全血可得到10μg左右的total RNA。

1.3 Total RNA合成cDNA、反转录合成First Strand cDNA、体外转录合成cRNA；采用RNeasy Mini Kitc检测RNA纯度；cRNA反转录并进行荧光标记。

1.4 芯片杂交

1.4.1 标记产物杂交准备

经

Extract II试剂盒纯化后的标记产物，洗脱体积在30μL左右。如果进行单通道芯片杂交，将单管标记(cy3-dCTP或cy5-dCTP)纯化洗脱产物抽真空浓缩或补水体积至27.5μL备用。如果进行双通道芯片杂交，将1管cy3-dCTP标记纯化产物与另外1管cy3-dCTP标记纯化产物混合后，共计60μL左右抽真空浓缩至27.5μL备用。

1.4.2 杂交体系配制、杂交反应及数据分析

将单通道芯片杂交或双通道芯片杂交步骤中准备好的标记产物，取100μL杂交液加样至杂交盖片围栏中，“Agilent”标签面朝下轻轻盖上围栏，安装好Agilent杂交盒并旋紧后，可轻轻水平转动杂交盒，检查各个亚阵的杂交腔体内液体是否流动。将杂交盒安装在杂交炉的转子上，注意对称安装，同时在托盘中加入适量超纯水后，45℃杂交过夜。结束后，取出芯片在博奥Slide Washer8芯片洗干仪进行清洗，清洗程序如下：

洗液I：0.2％SDS，2×SSC，42℃120S清洗2遍。

洗液II：0.2％SDS，2×SSC，42℃80S清洗3遍。

清洗程序完成后，离心甩干，待扫描。使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。

1.5 芯片数据分析

1.5.1 差异表达的mRNA和IncRNA的筛选

获得的lncRNAs数据，经过折叠倍率(Fold Change，FC)筛选，筛选出所有差异表达的incRNAs，参数选择标准为P<0.05，FC>2fold or<-2fold；筛选后分别统计差异高表达和差异低表达的IncRNAs和mRNAs数据。使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析。

1.5.2 Real-time PCR

挑选芯片杂交结果中表达量倍数变化较大的lncRNA进行Real-time PCR验证，分别以骨质疏松症血液和正常患者血液体外反转录得到的cDNA为模板，采用Bio-Rad荧光定量PCR仪，SYBR Green荧光染料参入法相对定量。以GAPDH作为内参，计算表达量差异倍数。

1.6 体外破骨细胞分化的诱导

建立巨噬细胞集落刺激因子(maerophage colony stimulating factor，M-CSF)和细胞分化因子(receptor activator of nuclear foetor—KB ligand，RANKL)体外诱导骨髓单核细胞分化为破骨细胞。

2、结果

2.1 RNA抽提及芯片扫描及质控结果

如图1所示，针对所有用于芯片筛查的血液中提取的总RNA来做好RNA质控检测。骨质疏松症血液中提取总RNA为25ug，分光光度计结果显示，样品中提取RNA的吸收值均在1.6-2.2之间，经甲醛变性胶电泳检测，28S:18S rRNA条带亮度清晰、完整，判定所有样本的RNA的质量均符合芯片实验要求(图1A)，所用RNA质控合格。利用Affymetrix

Human Transcriptome Array 2.0芯片，按照操作流程规范，在上海伯豪生物公司进行芯片筛查，质控结果均合格图(1B、1C)。

2.2 芯片数据准确性的定量PCR验证

由图2可见，在同时骨质疏松症组(OP)和健康对照组(NC)的比较中，验证表达谱芯片筛查基因的可靠性，通过定量PCR所反映的相对表达差异倍数与芯片筛查数据一致，可进一步进行后期的生物信息学分析以及目标lncRNA的筛选。

2.3 差异lncRNA的筛选

如图3所示，利用Affymetrix公司提供的GGHTA芯片，按照操作流程规范进行芯片筛查(图3B)。芯片扫描图像经过NimbkScan软件和Agilent GeneSpringGX软件分析处理后，得到骨质疏松症组与正常对照组的lncRNAs表达数据；再经过折叠倍率(Fold Change)筛选获得显著差异表达的lncRNA数据。如图3A所示散点图分析2倍以上表达量的改变，并且差异具有统计学意义的lncRNA，观察表达量2倍以上改变的lncRNA的分布及统计学差异。

进一步对对数据定量分析，共检测出19615个lncRNA，将骨质疏松症血液中lncRNA的表达量与正常血液中相比较，其中相对表达量比值在2倍以上，且差异具有统计学意义(P<0.05)的lncRNA作为是表达差异的lncRNA。结果相对表达量比值在2倍以上变化的共3638个，2倍以上上调的共2612个，2倍以上下调的共1026个，结果按生物学重复的结果的均值Fold change＝2.0，p<0.05筛选出的有差异变化的lncRNA数量太多，我们将均值Foldchange提高到5倍及以进行筛选，结果发现5倍以上上调的共9个，5倍以上下调的共6个。

2.4 目标lncRNA的验证

我们选择9个上调的lncRNAs，6个下调的lnc RNAs共15个lnc RNA在更大样本中骨质疏松症组(OP)和健康对照组进行验证，OP组25例，正常组25例。选择上述15个lncRNA的依据是：(1)选择芯片筛查结果中Fold changed较大的lncRNA；(2)在聚类分析的结果中，以不相同的cluster中选取lncRNA；(3)在每个OP患者及对照样本中都能检测出的lnc RNA。

定量PCR验证结果显示，之前筛选获得的15个lncRNA中，有10个lncRNA在各组间的表达与芯片结果不一致，且组间比较均无显著性差异。另外3个lncRNA表达变化与芯片结果一致，但均无统计学意义。由此最终获得2个可能与OP相关的lncRNA，探针TR170015126和TR170015138。其在OP组和NC组血液的表达均存在不同程度的显著性差异，如图4所示。

2.5 目标lncRNA的选择——lncRNA-OD1

将最终获得2各自序列均通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或UCSC数据库(http://www.genome.ucsc.edu/)比对分析，并查阅lncRNA相关数据库，如lncRNAdb(http://www.lncrnadb.org/)等均未发现有正式报道。如图5所示，为了进一步验证2个lncRNA在OP中的作用，我们用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和破骨细胞生成因子(RANKL)诱导人骨髓单核细胞(BMMs)向破骨细胞分化(图5A)，实时荧光定量PCR检测发现，M-CSF和RANKL诱导的破骨细胞探针号TR170015126mRNA表达明显增多(p<0.05)，而探针号TR170015138表达未见明显改变(p>0.05)(图5B)。

考虑到上述lncRNA均是首次在OP组血液样本中通过筛选验证获得，参考肌肉细胞分化(Muscle Differentiation，lncRNA-MD1)等lncRNA命名特点，暂将其命名为lncRNA-OD1。通过UCSC数据库上的位置图分析发现lncRNA-OD1位于第18号染色体(chr18:77343316-77345492，hg18)，基因序列长度为2177bp，含有3个外显子，2个内含子，转录本序列长度为760nt(图5C)。重要的是lncRNA-OD1在OP和破骨细胞分化中表达明显增多，从临床意义分析、体外实验等深入探索，提示lncRNA-OD1可能可能在骨质疏松症破骨细胞分化发生进展中起到促进作用。

引物由上海生工生物工程有限公司代为合成，如表1所示。

表1 目标lncRNA-OD1的引物

名称	Forward primer	Reverse primer
			lncRNA-OD1	GATCCTGCAGATGTGGTCAA	CTTAATAGTGGAAACAGCCC

目标lncRNA-OD1的探针序列为：

Gtgcatggtgcagggtgcagggtggggggctgtggggaaggtatggggggtttcgggtgcagtggggaggtgcagggggtgtggggtgcaggggtgcctccagccccagacctgctggggttgcactggttctgctgctgacaggtgacccacctgcccctgtgcgcaagtcactgaaagttttggagcctggttttcttacctgagaaatggggctgatgatcgtcctgactgatcgattggaccacccggtacaccactggcctctccgatccacaagcttcgaaagcattttcatatcaggatcctgcagatgtggtcaagacaagcactgggctgggcggggcccaagtccaggaacaggcatcctcctaagaggaaagagaccaacacggtgccatgggaggcaggcgaggttggagcaacggcacaagccagggaagctgagagcagcagatgctgggacaggtggctaggagccaccggtgcacccggggagcacgcccttgcgaggtgatgaaaaacctgctgaaatagcacagagcagcccctcccgcggtggttcatagcattcatcccctgagagcccacacaggccacaccaccggcccacagaggggaagctgaggcaggagcctaatgactcgccccaggcctcaaaacgatgtgcactggggctgtttccactattaagtcaacaatctctgcagtttctgcttaatggtctcaattaaggttctcttaataaagaacatttgtg。

SEQUENCE LISTING

<110> 无锡市第三人民医院

<120> 一种长链非编码lncRNA-OD1在骨质疏松症检测中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 760

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcatggtg cagggtgcag ggtggggggc tgtggggaag gtatgggggg tttcgggtgc 60

agtggggagg tgcagggggt gtggggtgca ggggtgcctc cagccccaga cctgctgggg 120

ttgcactggt tctgctgctg acaggtgacc cacctgcccc tgtgcgcaag tcactgaaag 180

ttttggagcc tggttttctt acctgagaaa tggggctgat gatcgtcctg actgatcgat 240

tggaccaccc ggtacaccac tggcctctcc gatccacaag cttcgaaagc attttcatat 300

caggatcctg cagatgtggt caagacaagc actgggctgg gcggggccca agtccaggaa 360

caggcatcct cctaagagga aagagaccaa cacggtgcca tgggaggcag gcgaggttgg 420

agcaacggca caagccaggg aagctgagag cagcagatgc tgggacaggt ggctaggagc 480

caccggtgca cccggggagc acgcccttgc gaggtgatga aaaacctgct gaaatagcac 540

agagcagccc ctcccgcggt ggttcatagc attcatcccc tgagagccca cacaggccac 600

accaccggcc cacagagggg aagctgaggc aggagcctaa tgactcgccc caggcctcaa 660

aacgatgtgc actggggctg tttccactat taagtcaaca atctctgcag tttctgctta 720

atggtctcaa ttaaggttct cttaataaag aacatttgtg 760

Claims (1)

1.一种长链非编码lncRNA-OD1在制备预测骨质疏松症的试剂、试剂盒或基因芯片中的应用；

所述长链非编码lncRNA-OD1是由位于第18号染色体的基因转录产生而来：chr18:77343316-77345492，hg19，基因序列长度为2177bp。

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