CN110438129B - 长链非编码rna ogru及其过表达载体的药物应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA OGRU及其过表达载体的药物应用，该lncRNA OGRU在2D回转MC3T3‑E1细胞去负荷模型以及小鼠后肢尾悬吊(HLU)去负荷模型中的表达显著降低，且OGRU的过表达载体pcDNA3.1(+)‑OGRU在2D回转细胞去负荷模型中促进小鼠前成骨细胞MC3T3‑E1细胞分化，通过骨靶向递送系统(DSS)₆‑liposome将pcDNA3.1(+)‑OGRU递送至小鼠成骨区可有效缓解后肢尾悬吊(HLU)导致的骨质疏松；OGRU有潜力成为废用性骨质疏松症诊断生物标志物和治疗的新靶点，OGRU的过表达载体用于治疗废用性骨质疏松症的药物中。

Description

长链非编码RNA OGRU及其过表达载体的药物应用

技术领域

本发明涉及分子生物医学领域，具体涉及一种长链非编码RNA OGRU及其过表达载体的药物应用，主要用于废用性骨质疏松症药物中。

背景技术

骨质疏松症是一种系统性骨骼疾病，其主要特征是骨量降低和骨微结构恶化导致骨强度降低和骨折风险增加。在全球范围内，骨质疏松性骨折的发病率在北美和欧洲最高，其次是亚洲、中东、大洋洲、拉丁美洲和非洲。考虑到亚洲拥有全球的大部分人口，据估计到2050年，全球将有超过50％的骨质疏松性骨折发生在亚洲。

废用性骨质疏松症是一种常见的骨质疏松症类型，其发生的主要原因是长期卧床、运动麻痹疾病、骨折后固定以及空间飞行失重状态等原因导致的骨骼长期去负荷状态。现有的抗骨质疏松药物可有效降低骨质疏松症患者骨折的发生率，但是这些药物会产生一定的副作用，如骨坏死、高钙血症和血栓栓塞性疾病等，对人体健康产生极大危害。因此，亟待寻找新的分子靶点，以对废用性骨质疏松症的诊断和治疗提供依据。

成骨细胞由骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells)分化而来。成骨细胞在经历细胞增殖、细胞外基质沉积、成熟和矿化后，最终走向凋亡；部分成骨细胞则被周围的矿化基质所包埋形成骨细胞；而裸露于骨表面者成为骨衬细胞。成骨功能障碍是废用性骨质疏松症发生的主要原因，这一过程受到多种信号通路的调控。

长链非编码RNA(lncRNA)是在真核生物中新发现的一类长度大于200个核苷酸、没有长阅读框架、但往往具有mRNA结构特征(5’帽式结构和polyA尾)的RNA。研究发现lncRNA可在转录水平、转录后水平和表观遗传学水平调控成骨分化进程。本发明发现了一种全新的lncRNA OGRU，其可在去负荷状态下调控成骨细胞分化和骨形成，并在废用性骨质疏松症的诊断和治疗中具有潜在的临床应用价值。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA OGRU及其过表达载体的药物应用，主要用于废用性骨质疏松症药物中，该lncRNA OGRU(NONCODETRANSCRIPT ID：NONMMUT068562.2)在2D回转MC3T3-E1细胞去负荷模型以及小鼠后肢尾悬吊(HLU)去负荷模型中的表达显著降低，并且OGRU的过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU可在2D回转细胞去负荷模型中促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞分化，通过骨靶向递送系统(DSS)₆-liposome将pcDNA3.1(+)-OGRU递送至小鼠成骨区可有效缓解后肢尾悬吊(HLU)导致的骨质疏松；OGRU有潜力成为废用性骨质疏松症诊断生物标志物和治疗的新靶点，OGRU的过表达载体用于治疗废用性骨质疏松症的药物中。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种长链非编码RNA OGRU，序列为SEQ ID No:1。

优选的，所述长链非编码RNA OGRU位于chr9：35089682-35091503，全长1816个碱基。

(三)一种长链非编码RNA OGRU在诊断废用性骨质疏松症药物中的应用。

优选的，所述长链非编码RNA OGRU用于废用性骨质疏松症诊断的生物标志物和治疗的靶点。

(四)一种检测长链非编码RNA OGRU的试剂盒，包括用于检测长链非编码RNA OGRU的引物序列：

Forward:5’-CCGTAAGACTTGGAAGGAAGGTATGTG-3’；

Reverse:5’-CATCAGAGAACCTTGCAGCAGACAG-3’。

(五)一种长链非编码RNA OGRU过表达载体在治疗废用性骨质疏松症药物中的应用。

优选的，所述长链非编码RNA OGRU过表达载体为pcDNA3.1(+)-OGRU。

优选的，以上(三)、(五)中药物，包括药学上可接受的一种或多种载体，所述载体包含稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂。

进一步优选的，所述药物还包括添加剂。

优选的，所述添加剂包含稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂和表面活性剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的OGRU位于小鼠chr9：35089682-35091503，cDNA序列为SEQ ID No:1，具体如图2所示；OGRU在细胞去负荷模型(2D回转MC3T3-E1细胞)以及动物去负荷模型(小鼠后肢尾悬吊)中均显著低表达，提示其可能作为废用性骨质疏松症潜在的生物标志物。

(2)本发明发现OGRU过表达能够明显促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化能力，并能部分缓解2D回转器导致的成骨分化能力障碍，提示其对成骨分化的重要性，为废用性骨质疏松症治疗提供参考。

(3)本发明通过骨靶向材料(DSS)₆-liposome将pcDNA3.1(+)-OGRU递送至尾悬吊(HLU)小鼠的成骨形成区，发现其可显著缓解HLU导致的新骨形成障碍、骨微结构破坏和生物力学性能受损，进一步确立了OGRU在废用性骨质疏松症中的治疗作用。

(4)本发明对OGRU与废用性骨质疏松症的关系进行了深入系统地研究；基于以上发现，OGRU表达水平可作为一个新的生物标志物辅助废用性骨质疏松症的诊断，并可作为新的靶点对抗废用性骨质疏松症，具有良好的转化医学前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为qRT-PCR技术检测结果图；其中，A图为qRT-PCR技术检测OGRU在2D回转MC3T3-E1细胞去负荷模型的表达结果图；B图为qRT-PCR技术检测OGRU在后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织中的表达结果图；C图为OGRU在2D回转24、48、72小时后的变化时程图；图中横坐标CON表示空白对照，Clino表示MC3T3-E1细胞去负荷，HLU表示尾悬吊；纵坐标Relative OGRU level表示OGRU的相对表达水平；

图2为OGRU序列的确定结果图；其中，A图为RACE确定的OGRU序列图；B图为northern blot确定OGRU序列全长的结果图；

图3为OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU和siRNA-OGRU分别转染至MC3T3-E1细胞后对成骨分化影响的结果图；其中，A-D图分别对应成骨分化指标Alp、Osx、Runx2和Ocn的mRNA表达水平变化图；

图4为OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU和siRNA-OGRU分别转染至MC3T3-E1细胞后对成骨分化影响的结果图，其中，A图为western blot检测Osx、Runx2和Ocn的结果图，B-D分别对应Image J统计所得的成骨分化指标Osx、Runx2和Ocn的蛋白表达水平变化图；

图5为OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU和siRNA-OGRU分别转染至MC3T3-E1细胞后Alp活性检测结果图；其中，纵坐标为Relative Alp Activity(Alp相对活性)；

图6为OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU和siRNA-OGRU分别转染至MC3T3-E1细胞后Alp染色结果图；

图7为OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU和siRNA-OGRU分别转染至MC3T3-E1细胞后茜素红检测矿化结节面积图；其中，纵坐标为Relative Mineralized Area(相对矿化结节面积)；

图8为OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU和siRNA-OGRU分别转染至MC3T3-E1细胞后茜素红染色结果图；

图9为检测2D回转去负荷环境下转染OGRU过表达载体对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化功能的调控结果图，其中，A-D图分别对应成骨分化指标Alp、Osx、Runx2和Ocn的mRNA表达水平变化图；

图10为检测2D回转去负荷环境下转染OGRU过表达载体对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化功能的Alp活性检测结果图；

图11为检测2D回转去负荷环境下转染OGRU过表达载体对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化功能的调控结果图；其种，A图为western blot检测Osx、Runx2和Ocn的结果图，B-D分别对应Image J统计所得的成骨分化指标Osx、Runx2和Ocn的蛋白表达水平变化图；

图12为(DSS)₆-liposome-pcDNA3.1(+)-OGRU对尾悬吊小鼠骨质疏松的防护效果评价图，其中，A图为micro-CT检测骨小梁微结构后的2D图；B图为三维重建图；

图13为钙黄绿素试验测量的荧光标记线之间的距离图；

图14为钙黄绿素检测新骨形成的成骨速率图；其中，纵坐标为成骨率，单位为μm/d；

图15为载荷-挠度曲线，其中，横坐标为挠度，单位为mm；纵坐标为载荷，单位为N；

图16为三点弯曲实验评价骨的生物力学性能，其中，A图为最大载荷图，B图为刚度图，C图为弹性模量图；

以上图3-8中，在横坐标中，CON表示空白对照，Vector表示空载体，OGRU表示OGRU过表达载体，si-NC表示siRNA-OGRU的阴性对照，si-OGRU表示siRNA-OGRU；pcDNA3.1表示OGRU过表达载体；

图9-11中，在横坐标中，CON表示空白对照，Clino表示2D回转，Clino+vector表示空载体转染至MC3T3-E1后进行2D回转，Clino+OGRU表示OGRU过表达载体转染至MC3T3-E1后进行2D回转；

图12-13中，在横坐标中，CON表示空白对照，HLU表示尾悬吊，HLU+(DSS)₆-liposome表示小鼠单独注射靶向药物后进行尾悬吊，HLU+(DSS)₆-liposome-OGRU表示小鼠注射靶向药物+OGRU过表达载体后进行尾悬吊；

图14、16中，HLU表示尾悬吊，(DSS)₆-liposome表示靶向药物，OGRU表示OGRU过表达载体。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例1

分析长链非编码RNA OGRU在2D回转MC3T3-E1细胞去负荷模型、后肢尾悬吊(HLU)去负荷骨质疏松小鼠模型中的表达及特性，包括以下步骤：

步骤1，建立2D回转MC3T3-E1细胞去负荷模型

在超净台中将MC3T3-E1细胞传代至回转瓶，放入37℃孵箱常规培养。传代6～8小时后细胞完全贴壁，用含有10％胎牛血清(HyClone,USA)和1％双抗(Invitrogen,USA)的α-MEM培养基(Gibco,USA)灌满回转瓶，直立放于37℃孵箱培养过夜。第2天在超净台中完全排尽回转瓶中的气泡。回转组安装于2D回转器上垂直回转，回转半径为1.5cm，转速均为24rpm；空白对照组(CON)置于37℃孵箱中常规培养。回转时间分别为24h、48h、72h。回转完成后根据后续实验所需提取细胞样本进行检测。

步骤2，建立后肢尾悬吊(HLU)去负荷骨质疏松小鼠模型

将6月龄雄性C57BL/6J小鼠用小鼠固定器固定，露出尾部并均匀涂抹安息香酊止痒并涂抹松香，将尾部缠上胶布并连接回形针，防止缠绕过紧，露出尾尖以观察血运。之后将小鼠放进尾吊笼，尾部通过小环悬挂于横杆上，调整横杆高度使小鼠后肢完全离地，使得身体与水平面约成30°，并使其前肢着地可以自由活动，并能正常进食、饮水，每天观察小鼠情况，确保其后肢完全离地，尾吊21天后处死小鼠，收集小鼠股骨样本。

步骤3，提取细胞和骨组织RNA并进行qRT-PCR检测

按照RNAiso Plus(Takara,China)说明书分别提取细胞样本中的细胞总RNA以及股骨样本中的骨组织RNA。采用

RT Master Mix reagent Kit合成cDNA；程序：37℃15分钟，85℃5秒，存于4℃。

以合成的cDNA为模版，以GAPDH为内参进行qRT-PCR检测(检测结果如图1所示)，反应条件为：95℃变性2min；95℃10s；60℃40s，40个循环；其中，OGRU与GAPDH引物序列如表1所示：

表1 OGRU与GAPDH的引物序列

由图1A可知，本申请的长链非编码RNA OGRU在2D回转MC3T3-E1细胞去负荷模型中表达降低；由图1B可知，本申请的长链非编码RNA OGRU在后肢尾悬吊(HLU)去负荷骨质疏松小鼠模型中的表达降低。由图1C可知，OGRU在2D回转MC3T3-E1细胞72小时内表达持续降低。

步骤4，cDNA末端快速扩增(RACE)

依据NONCODE数据库提供的NONMMUT068562的部分碱基序列，采用SMARTerTM RACEcDNA Amplification Kit(Clontech,CA,USA)确定OGRU的转录起始与终止位点(结果如图2A所示)。获得的产物测序完成后，将结果和原来已知序列进行拼接，获取OGRU的cDNA全长序列，所用的基因特异性引物序列如表2所示：

表2 基因特异性引物序列

步骤2，诺瑟杂交(Northern Blot)

将提取的细胞总RNA与5×甲醛凝胶电泳缓冲液、37％甲醛和甲酰胺在65℃下加热15分钟，在冰上冷却5分钟，加入RNA缓冲液。样品以50V进行甲醛凝胶电泳2小时，将RNA转移到尼龙膜上。42℃下预杂交3h后，与地高辛标记的OGRU探针在42℃下杂交16h。Tanon 4600(Tanon，China)对膜进行扫描，通过Northern Blot确定OGRU的全长(结果如图2B所示)。探针序列如下:

TTTGGTTGACTTCCCTGATACTTCAGAAAGATAAGAAAATGAACTCTACTCTCTTGCTTCTGGATCTTTTGTTCCCCTCTGTCTCCCCATTCCTTTCCTCCAACTCTCCACATGTTAATGGCTGGCCTCTCCTTATCTACTCTTTCTCTCTGCCTTTCTCGACTCTAGGACCCTCTTAACTC。

由图2可知，OGRU全长为1816个碱基，定位于chr9：35089682-35091503。

实施例2

将OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU和siRNA-OGRU分别转染至MC3T3-E1细胞中，然后检测其成骨分化和矿化能力，包括成骨分化指标(Alp、Osx、Runx2、Ocn)的mRNA及蛋白表达、Alp活性、Alp染色和茜素红染色等，具体包括以下步骤：

步骤1，细胞转染

使用Lipofectamine 3000kit(Invitrogen,USA)将siRNA-OGRU或siRNA-NC(GenePharma,China；终浓度：80nM)、OGRU过表达载体pcDNA3.1(+)-OGRU(GeneCreate,China；终浓度：200ng/μL)分别转入MC3T3-E1细胞中，并设置空白对照(CON)和空载体组(Vector)，根据需要进行后续实验。其中，siRNA-OGRU、si-NC的序列分别如表3所示。

表3 siRNA序列

步骤2，qRT-PCR检测成骨分化指标(Alp,Osx,Runx2,Ocn)的mRNA水平，检测方法同实施例1，引物序列见表4，qRT-PCR检测结果如图3所示。

表4 引物序列

由图3可知，pcDNA3.1(+)-OGRU可显著提高mRNA的表达水平，而siRNA-OGRU降低mRNA的表达水平。

步骤3，蛋白提取及Western blot

使用M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific,USA)从细胞中提取总蛋白，使用Pierce^TM BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific,USA)对蛋白定量。蛋白样品在70℃加热10分钟后，按照蛋白浓度加入一定量的LDS samplebuffer,reducing agent(Thermo Scientific,USA)和双蒸水。蛋白样品在NuPAGE^TM Bis-Tris蛋白凝胶(Invitrogen,USA)上电泳：90V，30分钟；120V，90分钟。电泳后，将分离的蛋白转移到PVDF膜上，恒流250mA,4℃下2小时。然后，5％脱脂牛奶在室温下封闭PVDF膜2小时后孵育一抗：Osx(1:1000,Abcam,UK)，Runx2(1:1000、Cell Signaling Technology,USA),Ocn(1:2000,Abcam,英国),GAPDH(1:5000,Proteintech,USA),4℃过夜。TBST洗涤后孵育二抗，室温下1小时。TBST洗膜后发光。GAPDH作为参考基因，用ImageJ软件分析蛋白相对表达量，结果如图4所示。

由图4可知，pcDNA3.1(+)-OGRU可显著提高蛋白的表达水平，而siRNA-OGRU降低蛋白的表达水平。

步骤4，Alp活性检测

采用alkaline phosphatase assay kit(中国南京建成科技有限公司)，从细胞中提取的总蛋白用于测定Alp活性。蛋白浓度由Pierce^TM BCA Protein Assay Kit(ThermoScientific,USA)测定。以苯酚(0.02mg/mL)为标准溶液，双蒸水为空白对照溶液。Alp活性定义为1g蛋白在37℃下与底物反应15分钟后产生的苯酚量，Alp活性检测结果如图5所示。

由图5可知，pcDNA3.1(+)-OGRU可显著提高Alp活性，而siRNA-OGRU降低Alp活性。

步骤5，Alp染色

MC3T3-E1细胞在成骨培养基中培养7天后，进行碱性磷酸酶染色。将6孔板中的细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，在室温下用BCIP/NBT Alp Color Development kit(Beyotime,China)染色30分钟，整个过程避光操作。图像是由数码相机拍摄所得，Alp染色结果如图6所示。

由图6可知，pcDNA3.1(+)-OGRU可显著提高Alp表达，而siRNA-OGRU降低Alp表达。

步骤6，茜素红染色

MC3T3-E1细胞在成骨培养基中培养21天后，用DPBS冲洗3次，而后在4℃下用70％乙醇冰固定40分钟。双蒸水洗涤3次后，1％茜素红染液(Sigma-Aldrich,USA)室温下染色15分钟。然后用双蒸水冲洗细胞5次，用数码相机拍摄图像。Image J软件对矿化结节面积比进行量化(结果如图7所示)，茜素红染色结果如图8所示。

由图7和图8可知，pcDNA3.1(+)-OGRU可显著提高矿化结节面积，而siRNA-OGRU降低矿化结节面积。

综上所述，由图3-8可知，OGRU过表达载体可有效促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的分化及矿化能力，而siRNA-OGRU可抑制其分化及矿化能力。

实施例3

考察OGRU过表达载体在2D回转细胞去负荷模型中对MC3T3-E1细胞分化的作用，包括以下步骤：

MC3T3-E1细胞转染进OGRU过表达载体12h后，置于2D回转器回转48h，而后提取RNA和蛋白用于后续qRT-PCR、Alp活性及western blot检测，检测方法同实施例2，检测结果分别如图9-11所示。

由图9-11可知，OGRU过表达载体可部分缓解2D回转导致的MC3T3-E1细胞分化障碍。

实施例4

使用骨靶向材料(DSS)₆-liposome将pcDNA3.1(+)-OGRU递送至尾悬吊(HLU)小鼠的成骨形成区，采用micro-CT、钙黄绿素双标、三点弯曲实验分别检测小鼠股骨的微结构、新骨形成以及生物力学性能，考察靶向递送OGRU过表达载体至尾悬吊小鼠成骨区对去负荷骨质疏松症的防护作用，包括以下步骤：

步骤1，靶向药物的配制与小鼠尾静脉注射

pcDNA3.1(+)-OGRU的给药剂量为2mg/kg体重，单次注射使用300μL生理盐水配制靶向药物，现配现用。将混合好的药物吹打均匀后，在震荡器上震荡30min，而后室温静置1h。将药物吸入1mL注射器，排气泡后准备注射。使用小鼠固定器固定小鼠并将尾部暴露，加热法使小鼠尾静脉扩张，在良好的光照条件下仔细观察确定尾静脉位置。对准尾静脉几乎平行于尾部皮肤进针，推药时无阻力、见尾静脉有液体流入且皮下无局部水肿即为注射成功。

步骤2，micro-CT

小鼠股骨剔除肌肉及结缔组织后置于4％多聚甲醛中固定2天，使用mico-CT机扫描成像系统(Siemens,Germany)进行拍摄(如图12A所示)。设置参数为：电压80kV；电流500mA；扫描分辨率10.44μm；曝光时间800ms。所选择的感兴趣区域(ROI)为离股骨远端生长板约1.5mm的2.5×2.5×3mm3立方体，而后对ROI进行三维重建(如图12B所示)。由图12可知，靶向注射OGRU过表达载体可显著缓解尾悬吊小鼠所致的骨微结构损坏。

步骤3，钙黄绿素双标实验

以每千克小鼠体重使用8mg钙黄绿素(8mg/kg)，每次注射使用200μL生理盐水作为溶剂，配制钙黄绿素溶液，现配现用，避光。在各组小鼠处死前第10天与第3天分别对小鼠进行腹腔注射。处死小鼠并取胫骨剃净软组织后，多聚甲醛固定2-3d，而后流水冲洗1h。梯度乙醇中脱水，待干燥后放入适当玻璃容器中，加入甲基丙烯酸甲酯覆盖样本，盖紧瓶盖，置于4℃冰箱静置7d。再将其放入40℃烘箱内直至其完全硬化。将包埋块取出，适量修正形状，使用硬组织切片机(SP1600、徕卡、德国)进行切片，厚度为50μm。切片常温避光保存，在共焦显微镜(LSM800,蔡司)下观察钙黄绿素沉积情况。用Image J软件测量荧光标记线之间的距离(如图13所示)，评价成骨速率(如图14所示)。

由图13和图14可知，靶向注射OGRU过表达载体可显著缓解尾悬吊小鼠所致的成骨速率降低。

步骤4，三点弯曲试验

获得的小鼠股骨用浸泡生理盐水的纱布包裹后保存于-80℃。解冻后上机检测(Bose,USA)。将股骨放置于跨度为8mm的两点支架上，以0.02mm/s的恒定位移率向股骨中轴垂直施加荷载，直至骨折。然后，用游标卡尺测量骨折部位外中轴和外中轴的长度和皮质骨的厚度。根据荷载-挠度曲线(如图15所示)计算结构性能值，包括最大荷载、刚度和弹性模量(如图16所示)。

由图15、16可知，靶向注射OGRU过表达载体可显著缓解尾悬吊小鼠所致的骨生物力学性能降低。

综上所述，由图12-16可知，靶向递送OGRU过表达载体可显著缓解尾悬吊小鼠的骨质疏松症，具体表现为促进骨生成、改善骨小梁结构和生物力学性能。

所有数据以均数±标准差表示，使用SPSS 22.0软件进行统计检验分析。先对数据进行正态性分析和方差齐性检验。两样本间比较时采用独立样本t检验；多样本组间两两比较分析时采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较使用LSD post hoc检验，P<0.05为差异有统计学意义。

OGRU及其过表达载体可用于制备诊断和治疗骨质疏松症的药物。其中，药物包括药学上可接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂、崩解剂等；药物还包括添加剂，添加剂包含稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 长链非编码RNA OGRU及其过表达载体的药物应用

<130> 2019

<141> 2019-08-23

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1816

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

caagcagtgg tatcaacgca gagtacatgg ggaaagaatg ggactggcgt ttttattttt 60

aaatgttagt ttaatttcat aaaatagttc ttttagagtt ttatacagta atcttcctcc 120

tttccccaga ctcttgccag atacctgcct ccttccttac accaaagtcc aattcaaaat 180

atccatatat ccatatattg ttgggtgtgt agtcttctgc tgaagtttgg ttgacttccc 240

tgatacttca gaaagataag aaaatgaact ctactctctt gcttctggat cttttgttcc 300

cctctgtctc cccattcctt tcctccaact ctccacatgt taatggctgg cctctcctta 360

tctactcttt ctctctgcct ttctctgact ctaggaccct cttaactccc ctccccatgc 420

ctgaatgaac tctattctat acaaaaaaga aaaaagaaag aataagaaag aaacagaagg 480

gaaaaaagga aaggaaagga aaggaaagga aaggaaagga aaggaaagga aaggaaagga 540

aaggaaagga aaggaaagga aaggaaagga aaaaagaaaa tggactcttc ctttgcctgg 600

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tcatgctggg gttgggtctg ccttgagctt gcaaagatct tctgtatgct atcacatctc 720

tgtgtggtta ttgtatagct gaccttctgc atcccaaaga catcttgtca tctactttct 780

ttactcccgt aacctttcta ttcactctag tacaacaatc cgtaagactt ggaaggaagg 840

tatgtgatat ggatatcctg tttagggctg agaattatgc agtctgtctc tgcagcttta 900

ctgtctgctg caaggttctc tgatgaggcc agctttaaaa ggtcttgaca tgtaaattca 960

gtgataaaat attgtctggg atatgcaagt ccctcggttt gaaccccaga aacatacaca 1020

cacacacaca cacacacaca aacacataca gagacacaaa tttcaattat taataaaaga 1080

caatatatct ttcaaatggg tatggtcaca tatggctatt atcaaatact ctggtggcat 1140

agccaggagg atccagagtt ctaggccaac gtaggctatg tagtgaggtt tgagtcagcc 1200

acagcaaagc aatgggactg acatttttat ttttaaatgt tagtttaatt tcataaaata 1260

gttcttttag agttttatac agtagtcttc cctccttttc ccaaactctt gccaatactt 1320

gactccttcc ctacaccaaa gtccaattca tactatccat ctatccctat attcttgggt 1380

gtgtaatcat cctccctccc tcccccgact cttcccagat aatctgcctc cttccctaga 1440

acaaagtcta cttcatacta tttatatatc ctatattctt gggtgtgtac tcttctgatg 1500

aagtgtcgtt caattcccgg aaacttcaga aaagtaagat aatgaaatct agtcttttgc 1560

ttcttgctgt tttattttgt ctctctcccc attttcttcc tccaactttc cacatgatca 1620

tggctggcct ctacttatct attctttctt tctgccttcc tctgactcta ggaccctctt 1680

acctcccctc cccatgccct gaataaactc taatctataa aaaaaataag aaaataaaaa 1740

aagtaaagga aagaaaggaa aggaaaagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtactatg 1800

cgttgatacc actgct 1816

Claims (4)

1.一种检测长链非编码RNA OGRU的试剂在制备诊断废用性骨质疏松症产品中的应用，所述长链非编码RNA OGRU的序列为SEQ ID No:1。

2.一种检测长链非编码RNA OGRU的试剂在制备诊断废用性骨质疏松症的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测长链非编码RNA OGRU的引物：

Forward: 5’-CCGTAAGACTTGGAAGGAAGGTATGTG-3’;

Reverse: 5’-CATCAGAGAACCTTGCAGCAGACAG-3’；所述长链非编码RNA OGRU的序列为SEQ ID NO.1。

3.一种长链非编码RNA OGRU过表达载体在制备治疗废用性骨质疏松症药物中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA OGRU的序列为SEQ ID No:1。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA OGRU过表达载体为pcDNA3.1(+)-OGRU。

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