CN111304324B - Alpl基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用 - Google Patents

Alpl基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111304324B
CN111304324B CN202010106195.3A CN202010106195A CN111304324B CN 111304324 B CN111304324 B CN 111304324B CN 202010106195 A CN202010106195 A CN 202010106195A CN 111304324 B CN111304324 B CN 111304324B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpl
lung adenocarcinoma
metastasis
lung
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010106195.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111304324A (zh
Inventor
黄海山
金红蕾
赵会荣
林炜炜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical University filed Critical Wenzhou Medical University
Priority to CN202010106195.3A priority Critical patent/CN111304324B/zh
Publication of CN111304324A publication Critical patent/CN111304324A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111304324B publication Critical patent/CN111304324B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

本发明公开了ALPL基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用。本发明首次通过TCGA数据库及临床标本分析发现，ALPL在肺腺癌组织中显著下调，且通过Transwell实验发现过表达ALPL显著抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力，并通过体内肺转移动物实验模型进一步说明了ALPL具有抑制肺腺癌细胞转移的功能，为研发以ALPL基因及其表达产物为诊治靶标的抗肺腺癌转移新药或新技术提供依据。

Description

ALPL基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及ALPL基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用。
背景技术
近年来人口老龄化、大气污染及吸烟等因素的影响，致使我国肺癌的发病率和死亡率逐年递增，中国已成为世界上肺癌人数最多的国家，专家预测中国肺癌人数在2025年当年将达到100万。同时据全国肿瘤登记中心2018年最新发布的统计结果显示：中国各地区(东，中，西)肺癌均居于恶性肿瘤发病的首位。更令人遗憾的是，近20年来，我国报告的肺癌外科治疗生存率一直没有显著改善，而国际上却在不断提高。最主要的原因是，目前我国肺癌外科治疗中局部晚期的病例仍然偏多，其比例达30％～40％，然而在国际上该比例仅为20％。
肺癌按照组织学类型可分为两大类，小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。其中NSCLC约占肺癌的70％-85％，又分为肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)和大细胞癌，肺腺癌所占比例最大，已经成为NSCLC中最常见的亚型，大约占到全部肺癌的50％，且其发病率在逐年升高，由此，探索肺腺癌疾病进展新分子机制具有非常重要的意义。
尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)早期症状隐匿，只有进展到一定程度才会引起不适，所以大多数NSCLC患者就诊时已处于中晚期，失去手术机会。而NSCLC中肺腺癌是最常见的组织学类型，尤其在成年(26岁-40岁)患者中，其发生率很高。转移一般被认为是肿瘤由良性进展为恶性的标志，而肺癌往往会转移到骨、脑和肝等机体重要的器官，尤其善于血道转移的肺腺癌更容易转移到这些重要脏器。
有文献回顾1966-2008年世界上关于肺癌的研究，发现伴有鼻窦转移的肺癌中有一半以上是肺腺癌，另有文章报道脑转移与肺腺癌患者预后差、复发及死亡有关，并发现LPCAT1(胞浆酶)可以推动肺腺癌细胞发生脑转移。而与吸烟关系密切的肺鳞癌的发病率则相对较低，然而其晚期预后很差。目前，对于这两种NSCLC在疾病分子水平方面有怎样的区别，二者在疾病进展过程中存在怎样的调控机制，哪些分子介导了肺腺癌相较于肺鳞癌高的转移性，又是什么样的机制导致了肺鳞癌相较于肺腺癌较差的疾病预后等，目前尚不清楚。
碱性磷酸酶(ALP)由成骨细胞高表达，是成骨细胞活性的关键组成成分，能够水解导致矿化的无机焦磷酸。其存在四种亚型：碱性磷酸酶，组织非特异性同工酶(ALPL)；肠型碱性磷酸酶(IALP，又称IAP)；胎盘型碱性磷酸酶(PAP，又称PLAP和PLAP-1)；和碱性磷酸酶，胎盘样(也称为生殖细胞碱性磷酸酶，GCAP，PAPL样和ALP-1)。Alkaline phosphatase，Liver/bone/kidney(ALPL，又名TNAP、APTNAP、TNSALP、TNALP，HOPS等)定位于人1号染色体1p36.1-p34，在基因组中跨度预计为50kb，有12个外显子和11个内含子，开放读框ORF长度为1575bp，编码包含524个氨基酸的组织非特异性碱性磷酸酶(tissue-nonspecificalkaline phosphatase，TNAP/TNALP)。ALPL又称组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)、间充质干细胞抗原1，是一种由包括骨、肝脏和肾脏在内的多种组织表达的酶，其也在骨盐沉积和矿化过程中发挥重要作用，而其具体的生物学功能目前并不是特别清楚。有研究发现敲低ALPL可以促进人牙髓质肝细胞的凋亡，且其可以通过调控无极焦磷酸盐(PPi)影响Wnt/β-catenin的激活,进而调控间充质干细胞的成骨分化。这些表明ALPL参与了细胞的凋亡和分化。另有研究发现ALPL可以抑制卵巢癌细胞的增殖，但其具体分子机制尚未阐明清楚。最近的一篇报道发现ALPL与转移性前列腺癌的肿瘤生长、上皮可塑性和无病生存期相关，同时发现敲减ALPL的表达，前列腺癌细胞的转移能力降低，并且出现MET(间质-上皮转化)现象，然而ALPL在肺癌中的作用尚不清楚。
发明内容
本发明提供了ALPL基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用，该ALPL基因可用于作为诊治肺腺癌及其转移的分子标记物。
具体技术方案如下：
本发明提供了ALPL基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用。
本发明通过TCGA数据库及临床标本分析发现，ALPL在肺腺癌组织中显著下调，同时在TNM分期较高的病人癌组织中的表达进一步降低，且生存曲线分析发现ALPL表达量与病人的无病生存期(DFS)呈正相关。
进一步地，特异性检测ALPL基因及其表达产物的试剂可用于制备诊断早期肺腺癌及其转移倾向的产品。该产品能通过检测ALPL基因的表达水平来诊断是否患肺腺癌以及肺腺癌是否发生转移。
进一步地，所述检测ALPL基因的表达水平的产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测ALPL基因及其表达产物的表达水平以诊断肺腺癌及其转移倾向的产品。
更进一步地，所述用RT-PCR诊断肺腺癌及其转移倾向的产品至少包括一对特异扩增ALPL基因的引物；所述用实时定量PCR诊断肺腺癌及其转移倾向的产品至少包括一对特异扩增ALPL基因的引物；所述用免疫检测诊断肺腺癌及其转移倾向的产品包括：与ALPL蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断肺腺癌及其转移倾向的产品包括：与ALPL基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肺腺癌及其转移倾向的产品包括：基因芯片和蛋白芯片；其中，基因芯片包括与ALPL基因的核酸序列杂交的探针，蛋白芯片包括与ALPL蛋白特异性结合的抗体。
所述一对特异扩增ALPL基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。
本发明还提供了ALPL基因及其表达产物的激活剂在制备抑制肺腺癌及其转移的药物组合物中的应用。
进一步地，所述ALPL基因的激活剂是在表达载体上导入ALPL基因编码序列所获得的过表达ALPL基因的重组表达载体。
所述表达载体为Plvx-GFP，过表达ALPL基因的重组表达载体为Plvx-GFP-ALPL。
进一步地，所述治疗肺腺癌的药物组合物为抑制肺腺癌细胞转移和侵袭能力的药物组合物。本发明通过Transwell实验发现过表达ALPL显著抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力，同时，体内肺转移动物实验模型的结果进一步说明了ALPL具有抑制肺腺癌细胞转移的功能。
进一步地，所述药物组合物包括与所述激活剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明中所述的ALPL基因包括人ALPL基因以及人ALPL基因的任何功能等同物的多核苷酸。ALPL基因在国际公共核酸序列数据库GeneBank中的编号为NM_000478.6。本发明中所述的ALPL基因表达产物包括ALPL蛋白以及ALPL蛋白的部分肽。所述ALPL蛋白的部分肽含有与肺腺癌相关的功能域。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次通过TCGA数据库及临床标本分析发现，ALPL在肺腺癌组织中显著下调，且通过Transwell实验发现过表达ALPL显著抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力，并通过体内肺转移动物实验模型进一步说明了ALPL具有抑制肺腺癌细胞转移的功能，为研发以ALPL基因及其表达产物为诊治靶标的抗肺腺癌转移新药或新技术提供依据。
附图说明
图1为TCGA数据库中显示ALPL在肺腺癌组织中表达显著下调，临床样本中也发现ALPL在肺腺癌组织中表达下调并具有统计学意义。(A)TCGA数据库中分析ALPL表达情况。(B)36对临床样本(癌组织/癌旁正常组织)中检测ALPL的表达情况。(C)从36例肺腺癌患者的癌组织(T)和配对癌旁正常组织(N)中制备总蛋白裂解物，并进行westernblot分析，以确定ALPL蛋白的表达谱(*表示具有统计学意义)；其中，Relative expression of ALPL inLUAD from TCGA表示来自TCGA数据库的肺腺癌中ALPL的表达量；Relative expression ofALPL in LUAD tissues表示肺腺癌组织中ALPL的表达量；GAPDH为内参。
图2为ALPL在肺腺癌病人中表达较低时其无病生存期显著缩短。TCGA数据库数据分析显示ALPL在肺腺癌病人中的表达水平与其无病生存期之间的关系。其中，Survivalprobabitity in LUAD from TCGA表示来自TCGA数据库的肺腺癌病人的生存概率；High表示高表达ALPL的人群组；Low表示低表达ALPL人群组。
图3为TCGA数据库分析发现ALPL表达与病人TNM分期之间关系；其中，Relativeexpression of ALPL mRNA in LUAD from TCGA表示TCGA数据库中ALPL的表达量；StageI表示分期I，n＝273表示病例数；StageII+III+IV表示分期II，III及IV的病例，n＝230表示病例数；
图4为过表达ALPL显著抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。(A，C)应用Transwerll实验评估过表达ALPL背景下肺腺癌细胞A549和HCC827的迁移和侵袭能力。(B，D)为其统计图，P<0.05,具有差异显著性(*代表具有统计学意义)其中，Vector表示载体；GFP-ALPL表示绿色荧光蛋白-ALPL过表达；Migration表示迁移；Invasion表示侵染；RelativeMigration/Invasion Index表示相关迁移/侵染指数。
图5为ALPL具有抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭功能。(A)利用尾静脉注射方式构建裸鼠异位肺转移模型，并拍固定后肺正面(Front)和背面(Back)照片，箭头指示较为显著肺部转移灶，大小不一；(C)五对裸鼠肺部转移灶数目统计图(*表示具有统计学意义)；LungMetastic Tumor(Number)表示肺转移性肿瘤数目；(B)HE结果证实转移灶癌细胞的存在。Vector表示载体；ALPL表示ALPL过表达。
图6为构建的过表达质粒ALPL结构示意图(仅起展示作用)，是连接有ALPL基因的Plvx-GFP质粒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中所涉及的材料来源如下：Plvx-GFP购自国内桑尼公司，Plvx-GFP-ALPL自行构建，并送桑尼公司测序比对正确。A549和HCC827两株肺癌细胞购自ATCC官方网站，并进行细胞鉴定正确；A549Vector/A549ALPL；HCC827Vector/HCC827ALPL稳定细胞株均是自行构建；其中，A549Vector是指肺腺癌A549对照细胞；A549ALPL肺腺癌A549过表达ALPL细胞；HCC827Vector是指肺腺癌HCC827对照细胞；HCC827ALPL是指肺腺癌HCC827过表达ALPL细胞。构建稳定细胞株的过程中涉及PCR扩增构建过表达质粒ALPL以及A549Vector/A549ALPL；HCC827Vector/HCC827ALPL稳定细胞株的培养和筛选等步骤，均采用常规技术手段进行。构建的过表达质粒ALPL是连接有ALPL基因的Plvx-GFP质粒(过表达质粒ALPL如图5所示)。
实验数据均以平均±标准差(X±SD)来表示，数据处理采用GraphPad prism5.0统计软件，P<0.05表示差异显著，有统计学意义。
实施例1
1、ALPL在肺腺癌组织中表达显著下调
肝、骨、肾，碱性磷酸酶ALPL(alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL)，位于1号染色体短臂1p36.1-p34，又被称之为TNAP，TNSALP，HOPS等。
利用线性回归和经验贝叶斯方法等统计方法，分析TCGA数据库中ALPL的表达情况，获得ALPL在人肺腺癌中的表达情况及其与疾病进展预后的关系。利用荧光定量PCR(qPCR)对36对临床样本进行qPCR评估，检测ALPL在临床样本中的mRNA水平；并为进一步明确ALPL在肺腺癌组织中的表达水平，从成对肺腺癌组织中提取总蛋白，并利用蛋白免疫印迹实验检测ALPL在肺腺癌组织及对应癌旁正常组织中的表达情况。
具体内容如下：
1)从TCGA数据库中选择全部配对病例(含癌旁正常组织为对照的病例)的样本进行分析，样本数为n＝58。
2)上述36对临床样本为肺腺癌临床样本，收集于温州医科大学第一附属医院，第二附属医院和杭州邵逸夫医院在2014年4月份至2018年4月份肿瘤外科行肺癌手术的36例肺腺癌患者的组织标本。收集患者姓名，性别，年龄，病例号，病历资料等等，术前活检和术后病例检查证实为肺腺癌。每例标本均采集肿瘤组织，并在距肿瘤3cm处取正常组织作为对照。
3)qPCR的步骤如下：
(1)手工法提取细胞总RNA：需要检测的细胞按照实验设计预先处理后，使用TRIzolTM Reagent试剂提取细胞总RNA；步骤为：旧的培养基去除后，用PBS洗涤细胞，6孔板每孔加入1mL TRIzolTMReagent试剂，冰上放置2min，并用安装有去酶枪头的移液枪吹打将板上细胞都吹下来，使细胞充分裂解。并将细胞裂解液用转移到已经标记好的对应1.5mL去酶Ep管中，每管加入200μl的氯仿，剧烈振荡30s，冰上放置3-5min，样品将会出现3层分层现象。4℃离心15min，速度12000g。用200μl去酶中枪头将上层含有RNA的水相(大约400μL)转移到已经标记好的对应新1.5ml去酶Ep管中，加入等体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀，静置10min。4℃离心15min，速度12000g，弃去上清可看见管底乳白色沉淀。加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，轻轻吹打沉淀，洗涤沉淀RNA。4℃离心15min，速度12000g，弃去上清。Ep管开盖，室温挥发乙醇大约30min。待白色沉淀透明，加RNA free water可室温溶解30min(也可直接放于56°水浴中溶解)用NanoDrop 2000c分光光度计进行浓度测量RNA浓度，进行定量分析，若OD260/OD280值在2.0左右，则所提取的RNA纯度较高，可将其分装后放于-80℃保存或用于下一步实验。
(2)普通mRNA逆转录(20μl体系)：按照实验设计处理细胞并提取mRNA后，用从美国Qiagen公司购买的SuperScript IV First-Strand试剂盒进行逆转录，步骤如下：
(a)配制RT反应体系如下，冰上操作。
Figure BDA0002388519480000061
(b)振荡混匀后，瞬离，放入PCR仪65℃孵育5min后置于冰上1min；
(c)配制RT反应体系如下，冰上操作。
Figure BDA0002388519480000062
(d)将步骤c中体系加入第b步产物中，振荡混匀后瞬离；放入PCR仪，反应条件：55℃10min→80℃10min→4℃∞，得到cDNA；
(e)反应程序结束后，收取样品至-80℃保存或用于下一步实验。
(3)real-time PCR：将需要实验的细胞按照所需实验设计处理获得cDNA后，使用美国ThermoFisher公司所购PowerUp SYBR Green Master Mix进行real-time PCR(实时荧光定量PCR)；步骤如下：RhoA Primer(F+R,1μM):5μl；GAPDH Primer(F+R,1μM):5μl；
体系：
Figure BDA0002388519480000071
上述体系震荡混匀后，取5μl加入384孔板中，注意不可碰到孔中引物。
以上试剂均加入384孔板中后，2500rpm，2min，之后上机检测。
反应体系如下：
Figure BDA0002388519480000072
主要引物序列：
Figure BDA0002388519480000073
(4)琼脂糖凝胶电泳：
2％琼脂糖凝胶配制步骤：称取2g琼脂糖至250mL的锥形瓶中，加入100ml1×TAE缓冲液，振荡混匀，放入微波炉中加热至沸腾2至3次使琼脂糖完全溶解，呈透明状，冷却至50℃-60℃(不烫手)后，加入10μl I型核算燃料，摇匀。组装好胶槽和样品梳，倒入凝胶溶液，避免产生气泡，凝胶的厚度大约0.5cm。放置于室温30min以上，使凝胶充分凝固；垂直缓慢拔出样品梳，切取实验所需孔数的凝胶放入到电泳槽中，给电泳槽倒入工作浓度TAE，液面高度应略高于胶，其余胶可放入工作浓度TAE中，并放入4°保存；在胶孔内加入PCR扩增反应产物，第一或最后留一孔加DNA ladder marker，125V稳压电泳。
4)蛋白免疫印迹实验的步骤如下：
(1)配制SDS-PAGE凝胶胶板：从盒中取出相应厚度一次性空胶板，注意检查胶板下面胶条是否粘的牢固以免漏胶，同时手不要触碰胶板开口处以防落入杂质，安装好胶板。依照配方配制10％或12％的分离胶，此处用10mL 1.5M Tris-HCl(pH8.8)，混匀，用滴管迅速沿胶板壁灌入至所需高度。用甲醇在胶板一侧缓慢液封，室温下静置约45min左右，待其凝固；弃掉甲醇，用干净的滤纸小心沿一侧吸干残余甲醇。继续配制5％的浓缩胶3mL(1.5胶板配3毫升，1.0胶板可配2毫升)，混匀后用1ml枪加入分离胶之上，直至灌满胶板剩余空间，并顺势用枪吸掉多余的气泡，再补满胶板之后，迅速插入相应厚度的样品梳，均匀用力，同时避免产生气泡。室温下静置约45min后，待其凝固即可使用。
(2)制备与处理蛋白样品：准备冰盒，清洗干净细胞刮，写清楚EP管，打开加热器并设定温度为100℃。收集细胞：吸去培养液，加入适量PBS清洗一次，弃干净PBS，将培养板放在冰上，加入适量细胞裂解液(BB液)60-80μl/孔(六孔版)，用细胞刮快速刮下细胞，并将其吸入放置在冰上的对应EP管中(整个操作用时<1min)。100℃煮5min，转至冰上；(加热大约1min时打开EP管盖放气，以防EP管盖崩开，损失样本)。超声碎裂(1s/次，间隔1s，振幅30，连续50次，体系少时振幅可以调至20)，混匀后瞬离；(冰上操作，注意深度，防止液体飞溅)。用NanoDrop 2000c分光光度计测样本吸光度，测体积，利用吸光度换算出样本浓度，加入6×Loading Buffer(SB液)和细胞裂解液(BB)进行相应调整。
(3)SDS-PAGE凝胶电泳：依据实验设计和样品蛋白浓度适量上样。浓缩胶中用150V恒压跑，尽量保持电流至最大，直至溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶交界处，此时样本会压缩成一条直线，此过程大概需要10-15min。调整电压至125V跑分离胶，调整电流至最大，直至溴酚蓝到达胶板底部，此过程大概1.5-2h。内侧电泳液用新配置的，外侧用回收的。电泳液配置：100ml 10％原液加双蒸水900ml稀释至1000ml。提前配置转膜液：，备后续转膜用。
(4)转膜：先使用清水冲洗转印槽，镊子，撬板，除去残留物及SDS；准备海绵垫。从电泳槽中取出待转胶板，流水冲洗上面电泳液，将其浸入转膜液中保持胶的湿度。转膜前先将PVDF膜置于甲醇中活化，两面各约15s，然后使用双蒸水冲洗3次，除去甲醇，浸泡于转膜液中备用(平角镊子夹膜时动作轻柔，以防刺破膜)。注意顺序：从阴极到阳极依次是：海棉垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海棉垫；插电源时注意正负极。内槽转膜液用新配置的，外槽可用回收的。恒压25V转膜4.5h(低电压可以减低发热，电压停下后应该立马进行接下来的步骤，防止蛋白扩散)。7：2：1(700ml ddH2O+200ml甲醇+100ml 10％原液)，配置好后放入4℃冰箱降温。
(5)5％牛奶封闭(Block)：转膜后PVDF膜用适量TBS清洗3次，倒立，甩干；(此后一直蛋白面朝下)；5％牛奶常温Block 1h；将牛奶回收后，TBS清洗PVDF膜5min*3次，倒立，甩干。
(6)孵育一抗：按照说明书选择合适比例配置抗体，敷抗体4℃过夜，回收一抗，TBS(少量多次)清洗PVDF膜后，用TBST清洗5min*3次，倒立，甩干；对于反应较强的抗体，孵育4h即可。
(7)孵育二抗：按照说明书配置抗体，4℃孵育2.5-3h，回收二抗；使用工作浓度TBST洗5min，共洗3次，之后洗15min，共三次，TBS再洗10min，倒立，甩干；换新的TBS，将PVDF膜浸泡于其中，放置干燥处，待扫。
(8)显影扫描：提前打开扫膜仪器，并用无尘纸擦干净透明塑料夹，设定程序及曝光度及保存位置；枪吸取适量TBS稀释500μlECF显影液(TBS基础量6ml,根据目标蛋白的强弱稀释)，并混匀，将膜浸泡于显影液中15s-1min，显影时间可根据抗体强度增长或减少；将浸泡显影液的PVDF膜放入透明显影塑料夹中,放入机器,排净气泡选定膜的位置；运行程序开始扫描，曝光强度通常为500，可以根据目标蛋白的强弱做适当调整，切忌过曝。
(9)洗脱二抗：使用TBS洗去PVDF膜上显色液5min，共洗3次；根据目的蛋白强弱，选择Strip Buffer，将适量Strip Buffer加入孵育盒中浸泡PVDF膜8min(Strip I 6-8min,StripII 8-10min,StripIII 10-12min)，此处操做在通风厨进行。回收Strip Buffer(I回收于II中，II回收于III中，III倒入废液桶中集中处理)使用单蒸水冲洗几遍，直至没有异味且膜颜色变白；使用单蒸水洗膜5min*1次，用5％牛奶室温封闭1h，然后工作浓度TBS；将PVDF膜上牛奶清洗干净后，可孵育一抗过夜；注意：切忌直接正对PVDF膜加入StripBuffer，以防局部蛋白被冲洗掉。另外加入Strip Buffer后，应用薄膜将孵育盒封起来，再盖上盖子，放在摇床上洗。
结果：分析TCGA数据库中ALPL的表达情况，发现相较于癌旁正常组织，在LUAD中ALPL的表达下调将近60％(P<0.05)(图1A)。qPCR评估发现：在36对临床样本中ALPL在肺腺癌组织中的表达相较于正常组织下调了73％(P<0.05)(图1B)。如图1C所示，在36个病人(癌组织/癌旁组织)组织样本中，有30组结果显示ALPL在癌组织中表达下调。
以上结果可较为充分说明，ALPL在肺腺癌中表达下调，即ALPL在肺腺癌组织和正常组织中存在差异表达。
2、ALPL的表达量与肺腺癌病人的无病生存期呈正相关
为了进一步明确ALPL其可能发挥的作用，我们利用线性回归和经验贝叶斯方法等统计方法对TCGA数据库数据分析，获得ALPL及其与疾病进展预后的关系。
分析发现，ALPL在肺腺癌中呈显著下调趋势，并且随着ALPL的表达下调，病人的无病生存期也随之缩短(图2)，由此说明ALPL在肺腺癌癌组织及正常组织中的表达差异可能与病人的预后相关。
此外，对TCGA数据库中数据进一步分析结果发现，ALPL表达偏低往往发生在TNM分期较高的病人中(图3)，而TNM分期是根据肿瘤侵润深度划分。为此，我们推测ALPL很可能在肺腺癌迁移和侵袭过程中起一定作用，从而影响肺腺癌病人预后。
实施例2体外细胞实验发现过表达ALPL显著抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力
利用Transwell实验检测ALPL对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；并利用裸鼠尾静脉注射肺转移模型评价ALPL对肺腺癌细胞转移能力的影响。
Transwell实验中采用的是前期构建的两株稳定细胞株(A549Vector/A549ALPL和HCC827Vector/HCC827ALPL)。
Transwell实验的实验步骤为：从-20快速取出带胶小室，置于corning 24孔板中，盖上24孔板盖，复温10min；上室每室加入Free DMEM培养基400μl，下室加700μl，放入37°5％CO2培养箱中活化膜3h；2.5h后，取出不带胶小室放入24孔板中，上室400μl，下室700μl，继续放入37°5％CO2培养箱中浸润30min；浸润不带胶小室时开始消化细胞，用0.1％FBS培养基重悬细胞，并计数；上层加入含细胞培养基400μl，每孔细胞总数约4×104个；下层加入700μl所检测细胞的完全培养基；放入37℃细胞培养箱培养24h后收Transwell。说明：以没有铺胶的小室作为参照，每种设置2个复孔。
Transwell染色步骤：24h后取出小室，注意勿碰到小室底部，用PBS洗1次；将小室置入3.7％福尔马林中初步固定10min；用水洗2次；将小室置入甲醇溶液中通透20min；再使用水洗2次；将小室置入Giemsa染液中染色25min；用清水洗2次，棉签轻轻擦去Transwell上室中的细胞，并轻轻沾去下面水渍；将小室放置于显微镜下观察，选取不同视野拍照；随机选取5个视野，计数并进行数据分析。
结果发现，与对照组细胞A549(Vector)相比，过表达ALPL的A549(ALPL)细胞的迁移和侵袭能力被显著抑制(图4A)，统计结果如(图4B)。HCC827细胞中呈现一致趋势(图4C)，统计结果如(图4D)。
体外实验发现，ALPL具有抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭的功能，为了进一步明确ALPL这一抑癌效应，为其可作为潜在的抑制肺腺癌迁移和侵袭的靶分子提供较为有力的证据，我们选择动物实验做更进一步探究。
将4周龄的BALB/c裸鼠随机分成2组，每组9只，分别注射3.0×106过表达ALPL的A549细胞及其对照细胞以构建体内裸鼠异位肺转移模型。
裸鼠异位肺转移模型的构建：选取A549(3.0×106个)细胞，在4w龄裸鼠尾部进行尾静脉注射，实验组和对照组各注射9只，大约55天时将裸鼠全部处死，取其肺，用苦味酸固定24-48小时后，体式显微镜拍照，分析。
结果：大约5-6周，可观察到与对照组相比，实验组裸鼠呼吸较为急促，体型消瘦。注射6-8周后，将裸鼠处死，取其肺用苦味酸固定48h后，采用体式显微镜拍照(图5A)，并对肺部进行HE染色分析(图5B))及转移灶进行统计(图5C)，发现过表达组裸鼠肺部转移灶数量明显少于对照组，由此明确ALPL可以抑制肺腺癌细胞的转移能力。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> ALPL基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accgagatac aagcactccc act 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtcacgt tgttcctgtt cag 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactcatgac cacagtccat gc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggtcaggt ccaccactga 20

Claims (3)

1.ALPL基因的激活剂在制备治疗肺腺癌及其转移的药物组合物中的应用，其特征在于，所述ALPL基因的激活剂是在表达载体上导入ALPL基因编码序列所获得的过表达ALPL基因的重组表达载体。
2.如权利要求1所述的应用，所述治疗肺腺癌及其转移的药物组合物为抑制肺腺癌细胞转移的药物组合物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括与所述激活剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
CN202010106195.3A 2020-02-21 2020-02-21 Alpl基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用 Active CN111304324B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010106195.3A CN111304324B (zh) 2020-02-21 2020-02-21 Alpl基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010106195.3A CN111304324B (zh) 2020-02-21 2020-02-21 Alpl基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111304324A CN111304324A (zh) 2020-06-19
CN111304324B true CN111304324B (zh) 2021-05-14

Family

ID=71145135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010106195.3A Active CN111304324B (zh) 2020-02-21 2020-02-21 Alpl基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111304324B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111793687B (zh) * 2020-06-23 2021-08-24 温州医科大学 抑制肺腺癌的靶标crtac1及其应用
CN114107507B (zh) * 2021-09-29 2023-04-25 暨南大学 Zswim1蛋白在调控肺腺癌细胞增殖和转移中的应用
CN114457159B (zh) * 2022-02-24 2023-09-19 珠海圣美生物诊断技术有限公司 一种检测肿瘤细胞或肿瘤细胞碎片的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014501388A (ja) * 2010-12-24 2014-01-20 マップ ダイアグノースティックス ピーティーワイ エルティーディー 選択反応モニタリング（ｓｒｍ）による癌および他の病理学的実体のタンパク質プロファイル
EP3180000A4 (en) * 2014-08-12 2018-03-07 Gillies Mcindoe Research Institute Cancer diagnosis and therapy

Also Published As

Publication number Publication date
CN111304324A (zh) 2020-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111304324B (zh) Alpl基因作为肺腺癌及其转移的诊治靶标的应用
CN107519194B (zh) miR-21在制备治疗宫腔粘连和/或薄型内膜的药物中的应用
CN113151177B (zh) 乳腺或乳腺癌组织脱细胞基质及其制备方法和用途
CN112641797B (zh) 抑制结直肠癌生长、转移的靶标与诊断标志物及其应用
CN114848666A (zh) miRNA-203a-3p模拟物在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用
CN104975071A (zh) 用于肿瘤诊断和治疗的分子标记
CN110951880B (zh) 检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用
CN107937519B (zh) 一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用
CN113368242B (zh) 一种抑制非小细胞肺癌靶标的应用
CN111424092A (zh) 一种检测基因及其应用
CN113186280B (zh) 抑制结直肠癌生长的靶标uc.77-与诊断标志物及其应用
CN114574583B (zh) Tmc5在乳腺癌特异性骨转移中的诊断、治疗的应用
CN109295015B (zh) E3泛素连接酶trim7在肝癌中的应用
CN113122638B (zh) 一种hsa-novel_circ_0006787分子在肝癌治疗中的应用
CN108410985B (zh) Spin1促进非小细胞肺癌肿瘤的生长
CN110656174B (zh) 一种与原发性肝细胞癌发生发展密切相关的特异性标志物及其应用
CN108165624A (zh) 生物标志物在骨肉瘤诊治中的应用
CN107881240A (zh) 骨肉瘤的诊治标志物
CN108410986B (zh) Cdh6促进骨肉瘤生长和转移
CN114908172B (zh) Apobec3b在前列腺癌诊断、预后预测及治疗中的应用
CN114959041A (zh) 抑制结直肠癌增殖转移的新靶标与诊断标志物及其应用
CN113388682B (zh) 基于基因的诊断胃癌的产品及其应用
CN112755190A (zh) 抑制结直肠癌生长的靶标与诊断标志物及其应用
CN108676892B (zh) 结直肠癌诊断标志物mettl11a及其应用
CN114941032A (zh) Rnf122在制备抗肿瘤药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant