CN109295015B

CN109295015B - E3泛素连接酶trim7在肝癌中的应用

Info

Publication number: CN109295015B
Application number: CN201811039239.4A
Authority: CN
Inventors: 韩丽辉; 朱礼慧; 马小敏; 李涛; 邱昱旻; 赵云雪; 林月轲; 马大鹏; 秦振志; 孙偲瑜
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN109295015A

Abstract

本发明属于分子生物技术和医学领域，具体涉及E3泛素连接酶TRIM7在肝癌中的应用。本发明提供一种肝癌的生物标志物，所述标志物为TRIM7，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明为肝癌的诊断提供了新的生物标志物TRIM7，并且TRIM7可以作为治疗肝癌的新型靶点，为筛选诊治肝癌药物及治疗肝癌提供了新方向。

Description

E3泛素连接酶TRIM7在肝癌中的应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和医学领域，具体涉及E3泛素连接酶TRIM7在肝癌中的应用。

背景技术

原发性肝癌(primary hepatocellμLar carcinoma，PHC，简称肝癌)是一种高度恶性的肿瘤，其起病隐匿、进展迅速，病死率在全世界恶性肿瘤中位居第二位。虽然手术切除、肿瘤血管栓塞和射频消融等综合治疗有效地提高了患者的生存率，但是多数患者终因肝癌侵袭进展，预后极差。对于原发性肝癌的有效控制，始终是医学界面临的基础和临床的重大课题。从分子水平阐明其发生发展的分子机制，将为发现并鉴定新型治疗靶点，制定有效的治疗策略奠定理论基础。

精准医疗和肿瘤分子靶向治疗概念的提出对肝癌的基础研究和临床诊治提出了更高的要求，而针对肿瘤新型治疗靶点的鉴定和相应治疗策略的探索也逐渐受到关注。因此，从分子水平探索肝癌的发病机制，寻找影响其发生和进展的关键分子，评估其成为分子标记物和干预靶点的可能性，进而对其进行靶向干预，已成为成熟可靠的研究思路。这为肝癌治疗提供了新的策略和导向，将对控制疾病进程和改善预后产生重大的意义。

TRIM(Tripartite Motif-containing protein)家族是一个结构保守、进化迅速的蛋白家族，其家族成员通常具有高度保守的RBCC结构序列，从N端到C端依次是RING(Really Interesting New Gene)结构域、一个或两个B-box(zinc-finger motifs)结构域和一个Coiled-coil结构域。TRIM蛋白家族成员由于含有RING-finger结构域，因而具有E3泛素连接酶活性，能够介导泛素向底物的转移，从而实现底物的泛素化降解。TRIM蛋白家族参与众多细胞内生理学和病理学过程，在细胞分化、发育、固有免疫、肿瘤发生和进展等过程中发挥重要作用。

近年来，随着对TRIM家族功能与机制研究的不断深入，TRIM家族在肿瘤进展中的作用越来越受到关注。研究显示，TRIM家族蛋白在肿瘤的发生与进展过程中能够通过靶向调控参与肿瘤进程的癌基因或抑癌基因，而在肿瘤进展过程中发挥重要的节点作用和调控效应。而作为严重干扰国民健康的肝癌，TRIM家族分子在其中的作用效应及分子机制尚未阐明。为了进一步深入研究TRIM家族分子在肝癌中的作用效应，为阐明肝癌的发生与进展机制和对其进行分子靶向逆转奠定基础，我们在前期工作中系统地筛选了有可能在肝癌进程中发挥效应的TRIM家族分子。我们的筛选和鉴定结果显示，TRIM7分子可能是参与肝癌发生发展的关键分子，而对其机制的深入研究和阐明，将为肝癌的分子靶向治疗提供新的策略。

TRIM7是2002年被首次鉴定的TRIM家族新成员，由于其可以结合并激活糖原蛋白，在糖原的生物合成中发挥启动作用，因而最初被定义为GNIP(Glycogenin interactingprotein，糖原蛋白结合蛋白)。目前关于TRIM7相关的文献报导很少，其功能和作用机制尚不清楚，而TRIM7分子在肝癌中的表达情况、生物学效应和分子机制，目前尚无研究报道。为了明确TRIM7在肝癌中的作用，本发明检测了TRIM7在临床肝癌组织中的表达，分析了其表达与肝细胞肝癌疾病进展的关系，并且在肝癌细胞和动物模型中进一步研究了其对肝癌细胞恶性行为的调控作用，进一步证明了TRIM7可以通过调控SRC的表达水平发挥对肝癌的调控作用。

SRC是由原癌基因Src编码的一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，从N端到C端，其含有一个独特的结构域(SH4)、一个SH3结构域、一个SH2结构域、一个蛋白酪氨酸激酶结构域(SH1)和一个调节性尾端。SRC通过催化底物酪氨酸残端的磷酸化反应，将ATP的磷酸基团转移到底物，从而改变底物的构象及活性，在细胞生长、分裂和迁移中发挥重要作用。现有的研究表明，SRC参与多种恶性肿瘤的发生与进展，包括胃癌、肝癌、结肠癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、食管癌等。深入探究TRIM7对于SRC的调节作用，将为阐明肝癌发生进展的分子机制奠定基础。

发明内容

本发明主要目的是，提供E3泛素连接酶TRIM7在肝癌中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种肝癌的生物标志物，所述标志物为TRIM7，其序列如SEQID NO.1所示。

本发明第二方面，提供检测TRIM7表达水平的试剂在制备诊断肝癌试剂盒中的用途。

进一步，所述TRIM7在肝癌患者中表达下调。

本发明第三方面，提供一种制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒含有检测TRIM7表达水平的反应试剂。

本发明第四个方面，提供所述制剂或试剂盒在制备诊断肝癌产品中的应用。

本发明第五个方面，提供TRIM7在筛选肝癌诊治药物中的用途。

本发明第六个方面，提供TRIM7在制备预防或治疗肝癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括TRIM7功能性表达促进剂。

本发明第七个方面，提供一种用于预防或治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括TRIM7功能性表达促进剂。

进一步，所述药物组合物还包括其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明取得的有益效果：

本发明分析了临床肝癌组织样本中TRIM7的表达水平，发现与相匹配的远端非癌肝组织相比，肝癌组织中TRIM7的mRNA和蛋白的表达水平均显著降低。构建TRIM7敲低和过表达的肝癌细胞模型，发现TRIM7能够显著抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭转移等能力。对TRIM7发挥作用的下游靶点进行筛选，发现TRIM7能显著下调原癌基因SRC的表达，并且这种调控效应发生在蛋白水平，而非mRNA水平。免疫共沉淀实验发现TRIM7能与SRC发生结合，进一步泛素化分析显示，TRIM7能够给SRC分子加上泛素链。裸鼠成瘤实验进一步证实：过表达TRIM7显著抑制小鼠成瘤模型中肝癌的生长并降低瘤体的体积与质量。这些结果均显示：TRIM7能够通过对SRC进行翻译后泛素化降解对肝癌发挥显著的抑癌效应，而其在肝癌组织中显著性的表达下调甚至缺失，有可能是导致其对肝癌的抑制效应缺失，并进而参与肝癌发生与进展的关键因素。本发明为肝癌的诊断提供了新的生物标志物TRIM7，并且TRIM7可以作为治疗肝癌的新型靶点，为筛选诊治肝癌药物及治疗肝癌提供了新方向。

附图说明

图1：肝癌患者临床标本中肝癌组织及其相匹配的非癌肝组织中，TRIM7蛋白和mRNA表达水平的检测。(A)免疫组织化学染色法检测肝癌组织及其相匹配的非癌肝组织中TRIM7的表达。(B)IPP6软件对免疫组化染色结果中TRIM7在肝癌组织及其相匹配的非癌肝组织中的表达水平进行统计分析，***p<0.001。(C)Real-time PCR检测肝癌组织及其相匹配的非癌肝组织中TRIM7mRNA表达水平，*p<0.05。(D)Western blot检测肝癌组织及其相匹配的非癌肝组织中TRIM7蛋白表达水平。(E)Image J软件对WB结果中TRIM7在肝癌组织及其相匹配的非癌肝组织中的表达水平进行统计分析，*p<0.05。

图2：TRIM7低表达能够促进肝癌细胞的恶性行为能力。(A)WB检测肝癌细胞转染Si-TRIM7后的干扰效果。(B)CCK8实验检测TRIM7低表达对肝癌细胞增殖能力的影响。(C)Transwell实验检测TRIM7低表达对肝癌细胞迁移能力的影响。(D)克隆形成实验检测TRIM7低表达对肝癌细胞克隆形成能力的影响。

图3：TRIM7过表达能够抑制肝癌细胞的恶性行为能力。(A)WB检测肝癌细胞转染TRIM7质粒后的过表达效果。(B)CCK8实验检测TRIM7过表达对肝癌细胞增殖能力的影响。(C)Transwell实验检测TRIM7过表达对肝癌细胞迁移能力的影响。(D)克隆形成实验检测TRIM7过表达对肝癌细胞克隆形成能力的影响。

图4：TRIM7通过负向调控SRC发挥抑癌作用。(A)Western blot检测HepG2肝癌细胞系中TRIM7低表达后SRC蛋白表达水平的变化。(B)Western blot检测HepG2肝癌细胞系中TRIM7过表达后SRC蛋白表达水平的变化。(C)Western blot检测SMMC 7721肝癌细胞系中TRIM7低表达后SRC蛋白表达水平的变化。(D)过表达TRIM7后，Real-time PCR检测Huh7肝癌细胞株中TRIM7的mRNA水平的变化。(E)过表达TRIM7后，Real-time PCR检测肝癌细胞株中SRC的mRNA水平的变化。(F)CHX处理SMMC 7721和BEL 7402细胞后，Western blot检测对照组和TRIM7过表达组SRC蛋白的表达水平随时间的变化。(G)统计分析CHX处理后SMMC 7721和BEL 7402细胞的SRC蛋白表达水平变化。

图5：TRIM7通过与SRC直接结合发挥抑癌效应。(A)免疫共沉淀实验检测在293T细胞和BEL7402细胞中过表达TRIM7和SRC之后，外源性TRIM7与SRC的结合情况。(B)免疫共沉淀实验检测在293T细胞和BEL7402细胞中过表达TRIM7之后，TRIM7与内源性SRC的结合情况。(C)免疫共沉淀实验检测体外翻译的TRIM7与SRC蛋白的结合情况。

图6：TRIM7通过靶向泛素化降解SRC发挥抑癌效应。(A)免疫共沉淀实验检测在293T细胞中转染TRIM7、HA-UB和SRC质粒之后，SRC发生泛素化的情况。(B)免疫共沉淀实验检测在293T细胞中转染TRIM7和HA-UB质粒之后，SRC发生泛素化的情况。(C)免疫共沉淀实验检测在293T细胞中分别共转TRIM7，SRC，HA-K11、HA-K48或HA-K63质粒之后，SRC发生泛素化的情况。

图7：靶点恢复实验显示SRC的过表达能够逆转TRIM7的抑癌效应。(A)在TRIM7过表达的肝癌细胞系中，进行SRC的外源性过表达，Western blot检测BEL 7402和SMMC 7721肝癌细胞系转染TRIM7和SRC质粒后的过表达效果。(B)CCK8实验检测各组肝癌细胞的增殖能力。(C)Transwell实验检测各组肝癌细胞的迁移能力。(D)克隆形成实验检测各组肝癌细胞的克隆形成能力。

图8：外源性高表达TRIM7分子抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长。BEL 7402肝癌细胞株(1×10⁷)种植到小鼠左右腋内侧皮下，成瘤后左侧瘤内注射30ug TRIM7质粒，同时在左侧瘤内注射30ug空载质粒。(A)照片示裸鼠处死后剥离出的TRIM7注射组和空载注射组的瘤体。(B)TRIM7注射组和空载注射组的裸鼠瘤体生长曲线。(C)TRIM7注射组和空载注射组的裸鼠瘤体的体积，***p<0.001。(D)TRIM7注射组和空载注射组的裸鼠瘤体的质量，**p<0.01。(E)Real-time PCR检测TRIM7注射组和空载注射组的裸鼠瘤体中TRIM7的mRNA的表达水平。(F)Western blot检测TRIM7注射组和空载注射组的裸鼠瘤体中TRIM7和SRC蛋白的表达水平，**p<0.01。Image J软件对Western blot结果中TRIM7和SRC在TRIM7注射组和空载注射组的裸鼠瘤体组织中的表达水平进行统计分析，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1肝癌病人临床标本的收集

本发明共有临床组织标本196例，其中80例用于免疫组织化学染色检测TRIM7的表达水平，64例通过Real-time PCR检测TRIM7的mRNA水平，52例用于Western blot检测TRIM7的蛋白表达水平。临床组织来自山东大学省立医院。患者临床病例特征如表2所示。

表2.临床肝癌病例及其临床特征

实施例2免疫组化检测TRIM7在肝癌和非癌肝组织中的表达情况

(1)烤片：将石蜡切片放在温度为65℃烤箱内烘烤1-2h，使表面蜡融化。

(2)脱蜡和水化：将切片依次至于二甲苯15min、二甲苯Ⅱ15min、100％酒精5min、95％酒精5min、90％酒精5min、85％酒精5min、80％酒精5min、75％酒精5min，进行脱蜡和水化处理。

(3)漂洗切片：用蒸馏水漂洗切片三次，每次5min；继续用PBS洗涤三次，每次洗5min。

(4)抗原修复：将配好的柠檬酸盐缓冲液置于高压锅中煮沸，切片置于切片架放入缓冲液后再次煮沸5min。

(5)室温放置切片1-2h，使其恢复至室温。

(6)滴加3％H₂O₂，37℃孵育30min，取出切片，用PBS洗涤三次，每次洗5min。

(7)封闭：滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30min。

(8)一抗孵育：弃去山羊血清封闭液，擦干组织周围液体，直接滴加稀释后的一抗。置于湿盒，4℃过夜。

(9)复温：将湿盒取出置于37℃孵育30min。

(10)用PBS洗涤三次，每次洗5min。

(11)滴加二抗，37℃孵育30min。

(12)用PBS洗涤三次，每次洗5min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min。

(13)用PBS洗涤，每次洗5min，共洗三次。

(14)DAB显色：DAB显色液按说明书配置，滴加DAB显色液，镜下观察控制显色时间，蒸馏水终止显色。

(15)苏木素复染10min。

(16)1％盐酸酒精分化数秒，自来水返蓝5min。

(17)梯度酒精脱水(水化步骤倒置)，透明，中性树胶封片。

实施例3 Western blot检测肝癌和癌旁组织中TRIM7的表达情况

1.组织蛋白的抽提：

(1)收取肝癌切除术所获得的肝癌组织和对应癌旁组织标本，将组织切成小块冻存于液氮。

(2)配制蛋白裂解液，按照蛋白裂解液(RIPA)：蛋白酶抑制剂(PMSF)：磷酸酶抑制剂(PI)比值为100：1：1的比例进行配制。

(3)取100mg组织置于Ep管中，加入150μL蛋白裂解液，用剪刀尽力剪碎后，用电动研磨棒将组织研磨成匀浆。冰上放置30min，使细胞充分裂解。

(4)14000g，4℃离心30min，离心后小心将上清吸出至新Ep管中。

(5)蛋白浓度测定：根据蛋白定量BCA试剂盒实验操作步骤，将试剂A和试剂B按照50：1比例混合，配成蛋白定量检测液。吸取蛋白2μL加入96孔板，同时加入18μL PBS和200μL蛋白定量检测液，置于37℃孵育30min。

(6)用酶标仪在562nm处测定吸光度，根据转换公式将吸光度值换算为蛋白浓度。

(7)向蛋白液中加入5X SDS蛋白上样缓冲液，煮沸蛋白5-10min，用于Westernblot电泳或置于-80℃保存备用。

2.Western blot步骤：

(1)凝胶配制

a)分离胶的配制：

清洗好玻璃板后，用ddH₂O冲洗，晾干后，将玻璃板安装于制胶架。将新鲜配置的10％分离胶液灌入胶板中，将上方用1mL无水乙醇封板，室温凝固30min。将无水乙醇弃掉，并用滤纸吸干胶面残留无水乙醇。将新鲜配置的4％堆积胶灌入胶板，小心插入梳子，避免气泡产生。室温凝固30min。

(2)电泳缓冲液的配置：称取甘氨酸18.8g，Tris 3.02g，SDS 1g，加入1L ddH₂O。

(3)上样：将胶板安装于电泳支架，放于电泳槽中，倒入适量电泳缓冲液。轻轻拔掉梳子，向梳子孔加入适量体积的蛋白marker或蛋白上样液。

(4)电泳：恒压70V进行电泳，直至蛋白样进入分离胶。蛋白marker开始出现分层后，调节电压至120V，直至蛋白上样液的条带跑至胶板边缘，即可停止电泳。

(5)半干转膜缓冲液的配置：将5.82g Tris和2.93g甘氨酸溶于800mL ddH₂O,再加200mL甲醇，混匀。

(6)转膜：裁剪出与分离胶大小适宜的PVDF膜和滤纸，将PVDF膜置于甲醇浸泡5min，取出后在ddH₂O中漂洗，移入转膜缓冲液中。将滤纸、PVDF膜和凝胶由下到上按照滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸的顺序依次放好，注意避免气泡产生。将该“三明治”结构放入半干转膜仪中，以恒压15V转膜1h。

(7)配制3％封闭液：将3g BSA溶于100mL洗膜液中。

(8)封闭：按照目的条带分子量的大小将PVDF膜裁成合适的大小，浸入封闭液中，摇床缓慢孵育1h。

(9)一抗孵育：将抗体按照说明书配好目的抗体，备用。将封闭好的PVDF膜置于抗体孵育盒中，加入预先配置好的抗体，4℃孵育过夜。

(10)洗膜液的配置：1L PBS中加入1mL吐温，混匀。

(11)洗膜：将PVDF膜从孵育盒中取出，放入洗膜液中，洗涤10min，共洗三次。

(12)二抗孵育：根据一抗种属来源选择合适二抗，按照1：3000配置二抗稀释液，制备杂交袋，加入二抗液体和PVDF膜。室温，摇床缓慢孵育1h。

(13)洗膜：将PVDF膜从杂交袋取出，放入洗膜液中，洗涤10min，共洗3次。

(14)显影：按照试剂说明书配置ECL显影液，均匀加在PVDF膜上进行显影，由ECL凝胶成像系统进行扫描。

实施例4 Real-time PCR检测TRIM7在肝癌及癌旁组织中mRNA的表达水平

1.细胞/组织总RNA的提取

按TRIzol(Invitrogen)试剂说明进行，步骤如下：

(1)收集的细胞或经充分研磨的组织，用PBS洗2次，按1×10⁷细胞/mL，加入总RNA抽提试剂Trizol 1mL，吹打数次使细胞完全裂解。

(2)室温孵育5min后，加入200μL三氯甲烷，颠倒混匀数次。

(3)室温静置5min后，12000rpm 4℃离心15min。

(4)小心吸取上层水相(RNA)至去RNase的新Ep管内。

(5)加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10min。

(6)12000rpm 4℃离心10min。

(7)弃上清，加1mL 75％乙醇(DEPC水配置，现用现配)充分漂洗。

(8)7500rpm 4℃离心10min。

(9)弃上清，室温干燥10min。

(10)加入30-50μL RNase free的无菌DEPC水，静置10min充分溶解沉淀。

(11)用Biophometer检测RNA浓度，纯度后，直接进行反转录或置于-80℃保存备用。

2.逆转录

(1)于RNase free的Ep管中依次加入下表所列试剂：

(2)混匀后，简短离心，并置于42℃孵育3min，按下表继续加样

(3)将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应中，充分混匀。

(4)42℃孵育15min。

(5)95℃孵育3min之后置于冰上，得到cDNA用于后续实验或-80℃保存。

3.Real-time PCR检测mRNA

TRIM7上游引物为：GCTCGGGGTTGAGATCACC，如SEQ ID NO.2所示；

TRIM7下游引物为：CCAGGCACATTGCTACACCT，如SEQ ID NO.3所示；

β-actin上游引物为：GGCACCACACCTTCTACAATG，如SEQ ID NO.4所示；

β-actin下游引物为：TAGCACAGCCTGGATAGCAAC，如SEQ ID NO.4所示。

以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因设置三个复孔，冰上操作，反应体系配制如下：

按照两步法PCR设定反应步骤。

反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照2^-ΔΔCT计算得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。

实施例5质粒抽提

1.转化

(1)2μL质粒加入50μL感受态细胞中。混匀。

(2)冰上放置30min。

(3)42℃水浴热激90s。迅速放冰上静置2min。

(4)加入500μL LB液，轻轻摇匀，37℃振荡培养1-2h，以恢复细胞活力。

(5)LK/LA板放孵箱中备用。

(6)取100μL菌液，均匀涂布于平板。

(7)37℃温箱放置1h后，翻板，继续培养过夜。

(8)挑取单克隆，接种于2mL LK/LA培养液中，振荡培养12h。

(9)取1mL菌液，加入10mL LK/LA培养液，振荡培养12h。

2.大抽试剂盒抽提质粒

(1)摇好的菌液放入50mL离心管，3500-5000g离心10min，由此获取全部细菌沉淀。

(2)弃上清，用吸水纸吸干管壁残留的培养基。加入10mL冰上预冷的Solution Ⅰ/RNase A重悬菌体，用涡旋器混匀。

(3)加10mL SolutionⅡ，上下颠倒轻柔混匀10-15次，得到清亮的裂解液，室温放置2min(不要用力混匀，否则会有DNA污染或质量产量下降)。

(4)加入5mL Buffer N3，轻柔混匀，颠倒几次直至出现白色絮状沉淀，室温孵育2-3min。孵育期间颠倒混匀几次(Buffer N3使用之前进行冰浴，能够促进蛋白沉淀的形成。加入N3之后应立即充分混匀，否则不易形成沉淀)。

(5)15000g，4℃离心10min。去掉细胞碎片和KDS沉淀。

(6)向HiBind Maxi column(柱子)中加入5mL Buffer GPS，室温静置3-10min，然后3000-5000g，室温5min离心柱子。离心结束后弃掉管中液体。

(7)将第五步的上清倒入filter管中，静置5min。用一个新的50mL离心管收集细胞裂解液。(不要迫使所有的裂解液都通过filter管)

(8)加入0.1倍体积ETR溶液颠倒混匀7-10次。冰上孵育10-20min。孵育过程中颠倒混匀1-2次。(加入ETR后，裂解液变浑浊，放在冰上后变亮。ETR溶液要4℃保存，置于冰上使用)。

(9)42℃水浴5min。裂解液再次变浑浊，之后3000-5000g，25℃离心5min，此时可见ETR溶液形成的蓝色层位于管底(若溶液中仍有蓝色ETR溶液悬浮，可在室温放置5-10min)。

(10)小心吸取上层的液相，转移至一个新的50mL离心管中，加入0.5体积的无水乙醇，颠倒混匀5-6次，室温孵育2min。

(11)向HiBind Maxi column中加入20mL裂解液，3000-5000g离心3-5min。弃掉离心管中的液体。

(12)重复11步，直至所有的裂解液通过柱子。

(13)加入10mL HB Buffer，3000-5000g离心3-5min，弃掉离心管中液体。

(14)加入15mL DNA wash buffer，3000-5000g，离心3-5min(DNA wash buffer用之前放于室温)。

(15)加入10mL DNA wash buffer。同上离心。

(16)空管离心10-15min，小于6000g，离心3-5min。

(17)干燥column:65℃烤箱中烘烤10-15min。

(18)向column中加入1-3mL Endotoxin-Free Elution Buffer。室温孵育2min。小于6000g，离心5min。

(19)测浓度分装，-80℃保存。

本发明通过对80例肝癌患者的临床组织标本进行免疫组织化学染色，发现与相匹配的非癌肝组织相比，TRIM7在肝癌组织中的表达水平明显降低(图1A-B)。卡方检验发现，TRIM7的表达高低与是否是肝癌组织具有明显的相关性(表1)。以上结果提示，TRIM7在肝癌组织中的表达水平明显下调，其表达缺失可能是促进HCC疾病的恶性进展的重要因素。应用Real-time PCR的方法对64例肝癌患者的肝癌组织及其相匹配的远端非癌肝组织中TRIM7mRNA的表达水平进行检测。结果显示，与相匹配的非癌肝组织相比，肝癌组织TRIM7的mRNA表达水平显著降低(图1C)。应用Western blot对52例肝癌患者的肝癌组织及其相匹配的远端非癌肝组织中TRIM7蛋白的表达水平进行检测。结果显示，与相匹配的非癌肝组织相比，肝癌组织中TRIM7蛋白的表达水平显著下调(图1D-E)。

表1.TRIM7在肝癌组织与相匹配的远端非癌组织中的表达

实施例6细胞株及培养条件

BEL7402、HepG2、Huh7和SMMC7721细胞系均为人肝癌细胞系，293T细胞为人胚胎肾上皮细胞系，为购自中国科学院上海细胞生物研究所，引进后在本实验室长期培养。BEL7402和SMMC7721细胞系以RPMI1640+10％FBS，HepG2、Huh7和293T细胞以DMEM+10％FBS，37℃、5％CO2，95％空气，饱和湿度条件下进行培养。

实施例7细胞的转染

(1)转染前一天，胰酶消化预转染的细胞，调整细胞浓度为4-5×10⁵个/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养。

(2)16-20h后，细胞密度达到80％，将板内完全培养基换成opti-MEM培养液。

(3)取2ug的TRIM7-siRNA或TRIM7质粒稀释于100μL opti-MEM培养基中。

(4)取2μL Lipofectamine2000脂质体稀释于100μL opti-MEM培养基中。

(5)将稀释好的脂质体与TRIM7-siRNA或TRIM7质粒混合，室温孵育15min。

(6)将Si-RNA或质粒脂质体混合液按每孔200mL/孔加到6孔板中，轻轻摇动混匀。

(7)37℃，5％CO2培养箱中培养6h后，更换为完全培养基继续培养。

实施例8 CCK-8法检测细胞增殖活力

肝癌细胞以1x10⁵细胞/mL的密度接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，培养过夜。转染Si-TRIM7或TRIM7表达质粒，并以Si-NC或空载体转染组作为对照，转染后6h换液，并作为0h；分别在转染后0h、24h、48h和72h时加入CCK-8试剂，37℃孵箱孵育1h，酶标仪于450nm处检测OD值。

实施9 Transwell迁移实验

(1)肝癌细胞以3×10⁵/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，过夜培养。细胞密度为60％-80％时，转染Si-TRIM7或TRIM7表达质粒，并以Si-NC或空载体转染组作为对照，另设空白对照组。继续培养24h后胰酶消化，用无血清培养基制成单细胞悬液，细胞计数，将各组细胞密度调整至2x10⁵/mL。

(2)取100μL细胞悬液，加入Transwell小室，下室加入600μL含10％FBS的全培养基，继续培养24h。

(3)取出小室，PBS冲洗3次后加入100μL甲醇，固定15min。

(4)吸出甲醇，PBS冲洗三次后加入100μL结晶紫染色15min。

(5)吸出结晶紫，用用棉签将小室内部结晶紫染料擦拭干净，PBS冲洗三遍，除去小室内部未迁移的细胞。

(6)电子显微镜下观察各组细胞迁移情况，随机选取5个不同的视野拍照，分别计数，并计算细胞迁移率。

实施例10克隆形成实验

肝癌细胞以3x10⁵/mL的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，过夜培养。细胞密度为60％-80％时，向肝癌细胞转染Si-TRIM7或TRIM7表达质粒，以Si-NC或空载体转染组作为对照，另设空白对照组。继续培养24h后胰酶消化，制成单细胞悬液，细胞计数，将各组细胞密度调整至500细胞/mL，向六孔板加入2mL细胞悬液，置于37℃，5％CO2孵箱孵育7-10天。对细胞克隆进行结晶紫染色，拍照，计数并分析细胞数>50的克隆。

实施例11放线菌酮(Cycloheximide，CHX)实验

(1)胰酶消化预转染的细胞，调整细胞浓度为4-5×10⁵个/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养。

(2)16-20h后，细胞密度达到80％，转染带有Flag标签的TRIM7质粒，对照组转染带有Flag标签的空载体质粒。

(3)转染后24小时，换成含有CHX的全培养基,CHX浓度为1uM/mL，每孔1mL。

(4)分别收取CHX处理0h，3h，6h，9h的细胞，提取蛋白，Western blot检测SRC的蛋白水平的变化。

实施例12免疫共沉淀实验

(1)预先处理细胞，设置对照组。

(2)弃掉小平皿中的培养基，用PBS冲洗2遍。

(3)每个小平皿中加400μL IP Buffer，收蛋白。收蛋白的IP Buffer配制如下：IPBuffer：PI比例为300:1，现配现用。

(4)14000rpm，4℃离心10min。

(5)收集上清大约400μL。每个样品的上清分为2部分：Input样品40μL及IP样品360μL。

(6)40μL的Input样品直接放入-20℃保存。按照抗体说明书，在IP样品中加入适当目的抗体，4℃匀速摇1h。

(7)1h后，每个样品加入40μL Protein A agarose。4℃匀速摇一夜。

(8)第二天用IP buffer洗琼脂糖珠子，洗5次。先离心，1000g，5min。之后每次用200μL IP Buffer洗，离心前用手弹一下EP管，使珠子混匀。

(9)洗琼脂糖珠子完毕，小心吸出上清(即IP Buffer)，弃掉。

(10)每个样品中加入40μL 2×溴酚蓝。

(11)拿出Input样，加入6×溴酚蓝，体积为样品体积的五分之一，即8μL。

(12)4℃，瞬离，使样品沉在底部。

(13)100℃金属浴煮5min。

实施例13体外转录与翻译

(1)制备反应体系：

(2)将样品放入30℃金属浴中反应90min.

(3)分析翻译结果：

1)将1μL翻译反应物加入19μL 1X SDS上样缓冲液中，剩余样品放置-20℃保存；

2)100℃孵育5min，瞬离，收集蛋白样。将20μL样品加入到配好的12％凝胶中；

3)电泳后取出凝胶放入WB半干转膜缓冲液(1×)中；

4)按照WB转膜系统将样品转到PVDF膜上；

5)封闭：转膜结束后，将PVDF膜浸入到5％封闭液中，室温摇床孵育1h，也可4℃封闭过夜。6)一抗孵育：根据目的蛋白分子量大小将PVDF膜裁剪成小段，将与目的蛋白对应的一抗按说明书稀释，将PVDF膜放入杂交袋，封口，摇床室温一抗孵育1h；

7)洗膜：室温用WB洗膜液(1×)轻轻洗5min，重复洗6次；

8)二抗孵育：二抗摇床室温孵育1h；

9)洗膜：室温用WB洗膜液(1×)轻轻洗5min，重复洗6次；

10)显影：配制好ECL显影液，均匀加在PVDF膜上，根据条带强弱调整显影时间并保存，如果有目的条带继续一下实验；

11)每个样品分为2部分：IP样品47μL，Input样品2μL。

12)Input样品放入-20℃保存。IP样品和Input样品各分为2份。

另取2个新的Ep管，其中一管加23μL的TRIM7体外翻译反应样品，另一管加入23μL的TRIM7体外翻译反应样品和24μL的SRC体外翻译反应样品，根据抗体说明书，在IP样品中加入适当TRIM7的标签抗体Flag一抗，4℃匀速摇1-2h。

13)每个样品加入40μL Protein A agarose，4℃匀速摇一夜。

14)第二天，取出样品，用IP buffer洗琼脂糖珠子，4℃、1000g、5min离心，洗5次。每次用200μL IP Buffer洗。

15)洗完，弃掉上清，注意要小心吸，不要吸到珠子。

16)体外翻译反应样品中每个样品加入40μL 2×溴酚蓝；Input样每个样品中加入40μL 1×溴酚蓝溶液。

17)4℃瞬时离心后，100℃金属浴煮5-10min。按WB步骤继续下面实验，曝光，检测是否有目的条带。

本发明在肝癌细胞系中进行了TRIM7 SiRNA的转染，以此构建TRIM7功能缺失的细胞模型。Western blot检测TRIM7表达水平敲低的效率(图2A)。分别用CCK8、Transwell和克隆形成的方法检测肝癌细胞的增殖能力、侵袭迁移能力和克隆形成能力等肝癌的恶性生物学行为。结果显示，与Si-NC转染组相比，Si-TRIM7转染组的肝癌细胞的增殖能力、侵袭迁移能力和克隆形成能力均显著提高(图2B-D)。

本发明在肝癌细胞系中进行TRIM7表达载体的转染，以空载体转染组为对照，以此构建TRIM7过表达的肝癌细胞模型。运用Western blot的方法检测TRIM7过表达的效率(图3A)。通过CCK8、Transwell和克隆形成检测肝癌细胞的增殖能力、侵袭迁移能力和克隆形成能力。结果显示，与空载体转染组相比，TRIM7质粒转染组的肝癌细胞的增殖能力、侵袭迁移能力和克隆形成能力等恶性行为受到显著抑制(图3B-D)。

本发明接着进行了TRIM7的作用靶点筛选实验，结果显示在TRIM7表达受抑制的细胞模型中，SRC的蛋白表达水平发生显著上调(图4A)，反之，在TRIM7过表达的细胞模型中SRC的表达水平发生显著下调(图4B-C)，这提示TRIM7能够显著抑制SRC在肝癌细胞中的高表达。运用Real-time PCR检测过表达TRIM7之后SRC的mRNA的表达水平，结果显示，SRC的mRNA水平未发生明显变化，这说明TRIM7对于SRC的调节作用发生在蛋白水平而非转录水平(4D-E)。运用放线菌酮(Cycloheximide，CHX)抑制细胞的蛋白合成，Western blot检测SRC的蛋白表达水平，结果显示，与空载体转染组相比，TRIM7质粒转染组的表达水平明显降低(图4F)。

在293T细胞和肝癌细胞中，共同转染带有标签的TRIM7及SRC的真核表达载体，通过Western blot验证成功过表达后，通过免疫共沉淀实验，应用标签抗体检测外源性过表达的TRIM7与SRC的结合情况，结果显示，外源性过表达的TRIM7能够与SRC发生结合(图5A)。在TRIM7过表达的293T细胞和肝癌细胞中，应用TRIM7的标签抗体检测TRIM7与内源性SRC的结合效应。证实TRIM7能够与内源性表达的SRC相结合(图5B)。应用Quick CoupledTranscdption/Translation Systems(promega)蛋白体外表达体系进行蛋白的体外转录和翻译。在体外获得TRIM7蛋白和SRC蛋白，并通过Western blot验证表达成功以后，进一步验证TRIM7与SRC在是否具有体外的直接结合作用，结果显示，TRIM7能够直接与SRC蛋白相互作用(图5C)。

实施例14泛素化实验

(1)胰酶消化预转染的细胞，调整细胞浓度为8-10×10⁵个/皿接种于直径为6cm的小平皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

(2)16-20h后，细胞密度达到80％，转染带有Flag标签的TRIM7质粒，对照组转染带有Flag标签的空载体质粒。实验组和对照组都转染HA-UB和SRC质粒。

(3)转染后24小时，收取各组细胞，提取蛋白进行免疫共沉淀实验。

(4)Werstern blot检测SRC的泛素化情况。

实施例15靶点恢复实验

(1)胰酶消化预转染的细胞，调整细胞浓度为4-5×105个/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

(2)设置对照组，分别为：Mock，Mock+HA-SRC，Flag-TRIM7，Flag-TRIM7+HA-SRC。

(3)16-20h后，细胞密度达到80％，按照上述对照组进行转染。

(4)转染后24小时，收取各组细胞，提取蛋白。

(5)Werstern blot验证转染效率。

(6)进行CCK8，Transwell和克隆形成实验检测细胞的生物活性变化。明确SRC的过表达是否能够逆转TRIM7对肝癌的抑癌效应。

TRIM7属于具有E3泛素连接酶活性的蛋白，其对靶分子的调控有可能通过TRIM7对靶分子的泛素化降解效应发生的。本发明为了明确TRIM7负向调控SRC的模式，检测了TRIM7对SRC的泛素化修饰效应。本发明分别将TRIM7表达载体、SRC表达载体以及泛素分子(UB)表达载体HA-UB共同转染入293T细胞中，通过泛素化分析明确TRIM7是否能够对SRC进行泛素化修饰。结果显示，TRIM7能够将泛素链连接到SRC分子上(图6A-B)。在明确TRIM7对SRC能够进行泛素化调控的基础上，分别将HA-K11，HA-K48，HA-K63等不同类型的多聚泛素化修饰的泛素表达载体与TRIM7及SRC表达载体共同转染，结果显示HA-K48转染组的泛素化明显增强(图6C)，这说明TRIM7对SRC进行泛素化修饰的位点是K48位。

本发明进一步通过靶点恢复实验明确了SRC的过表达是否能够逆转TRIM7的抑癌效应。在TRIM7过表达的肝癌细胞系中，进行SRC的外源性过表达，Western blot证实了TRIM7和SRC的外源性过表达成功之后(图7A)，运用CCK8、Transwell和克隆形成实验检测肝癌细胞的增殖、侵袭迁移和克隆形成能力，结果显示，TRIM7和SRC共同转染组，肝癌细胞的增殖、侵袭迁移和克隆形成能力得到明显恢复，这提示，SRC的过表达能够逆转TRIM7的抑癌效应。

实施例16裸鼠成瘤实验

(1)裸鼠异种移植瘤模型的构建

应用4-6周雄性BALB/c裸鼠10只，置于山东大学动物中心饲养。将癌细胞系BEL7402(1×10⁷)皮下注射入裸鼠左腋内侧。肉眼可见肿瘤出现后，开始在瘤内注射30ugTRIM7质粒，同时在对照组瘤内注射30ug空载体，隔天注射一次，25天后处死裸鼠，剥离肿瘤组织。

(2)验证TRIM7在裸鼠瘤内是否成功表达

将剥离出的肿瘤组织抽提RNA和蛋白质，应用Real-time PCR的方法检测TRIM7注射组和空载体注射组中TRIM7 mRNA的相对表达量。应用Western blot的方法检测TRIM7注射组和空载体注射组中TRIM7蛋白的相对表达量。以此验证TRIM7是否在裸鼠肿瘤内成功表达。

(3)比较实验组和对照组肿瘤体积及重量差异

量取剥离出的肿瘤长径(a)和短径(b)，计算肿瘤的体积(肿瘤体积V＝a*b^2/2)。比较实验组和对照组之间肿瘤体积的差异。称取瘤重，比较实验组和对照组中肿瘤重量的差异。

(4)瘤体组织中进一步验证靶分子的变化

将剥离的肿瘤组织提取蛋白，应用Western blot的方法检测TRIM7注射组和空载体注射组中SRC蛋白表达水平的变化。

实施例17统计分析

统计分析应用SPSS16.0和GraphPad Prism5.0统计软件，数据以均数+标准差(mean+SD)表示，两组间均数差异采用非配对t检验，两组间阳性率差异采用卡方检验，连续变量间相关性分析采用PearSrcn检验，等级变量间相关性分析采用Spearman秩相关检验。P<0.05水平认为具有统计学意义。

本发明为了验证TRIM7在小鼠成瘤模型中的作用效应，构建了TRIM7过表达的小鼠成瘤模型。将肝癌细胞系进行裸鼠双侧腋窝的皮下接种，待形成肉眼可见的肿瘤以后，分别对小鼠两侧腋窝处形成的肿瘤进行瘤内注射TRIM7真核表达载体和空载体对照，由此构建TRIM7过表达的小鼠动物模型。在上述成瘤模型中，检测各组成瘤模型中肿瘤的大小，结果显示，相对于对照组，TRIM7过表达组的肿瘤大小明显降低(图8A)。记录各组肿瘤的生长曲线，结果显示，TRIM7过表达组的肿瘤生长速度明显降低(图8B)。分离瘤体组织后，进行瘤体体积、质量分析，发现TRIM7过表达组的肿瘤体积与质量明显降低(图8C-D)。应用Real-timePCR和Western blot对瘤体组织中TRIM7的mRNA水平和蛋白水平进行检测，明确了TRIM7过表达或干扰表达的模型构建成功(图8E-F)。应用Western blot对瘤体组织中SRC的表达水平进行检测，结果显示，相对于对照组，TRIM7过表达组的SRC蛋白表达水平明显下调(图8F)。这从动物实验的水平验证了TRIM7对肝癌的抑癌效应及其对靶分子SRC的调节作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> E3泛素连接酶TRIM7在肝癌中的应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Ala Val Gly Pro Arg Thr Gly Pro Gly Thr Gly Ala Glu Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Ala Ala Glu Leu Gln Gly Glu Ala Thr Cys Ser Ile Cys

20 25 30

Leu Glu Leu Phe Arg Glu Pro Val Ser Val Glu Cys Gly His Ser Phe

35 40 45

Cys Arg Ala Cys Ile Gly Arg Cys Trp Glu Arg Pro Gly Ala Gly Ser

50 55 60

Val Gly Ala Ala Thr Arg Ala Pro Pro Phe Pro Leu Pro Cys Pro Gln

65 70 75 80

Cys Arg Glu Pro Ala Arg Pro Ser Gln Leu Arg Pro Asn Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Ala Val Ala Thr Leu Leu Arg Arg Phe Ser Leu Pro Ala Ala Ala

100 105 110

Pro Gly Glu His Gly Ser Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala

115 120 125

Arg Cys Gly Gln His Gly Glu Pro Phe Lys Leu Tyr Cys Gln Asp Asp

130 135 140

Gly Arg Ala Ile Cys Val Val Cys Asp Arg Ala Arg Glu His Arg Glu

145 150 155 160

His Ala Val Leu Pro Leu Asp Glu Ala Val Gln Glu Ala Lys Glu Leu

165 170 175

Leu Glu Ser Arg Leu Arg Val Leu Lys Lys Glu Leu Glu Asp Cys Glu

180 185 190

Val Phe Arg Ser Thr Glu Lys Lys Glu Ser Lys Glu Leu Leu Lys Gln

195 200 205

Met Ala Ala Glu Gln Glu Lys Val Gly Ala Glu Phe Gln Ala Leu Arg

210 215 220

Ala Phe Leu Val Glu Gln Glu Gly Arg Leu Leu Gly Arg Leu Glu Glu

225 230 235 240

Leu Ser Arg Glu Val Ala Gln Lys Gln Asn Glu Asn Leu Ala Gln Leu

245 250 255

Gly Val Glu Ile Thr Gln Leu Ser Lys Leu Ser Ser Gln Ile Gln Glu

260 265 270

Thr Ala Gln Lys Pro Asp Leu Asp Phe Leu Gln Glu Phe Lys Ser Thr

275 280 285

Leu Ser Arg Cys Ser Asn Val Pro Gly Pro Lys Pro Thr Thr Val Ser

290 295 300

Ser Glu Met Lys Asn Lys Val Trp Asn Val Ser Leu Lys Thr Phe Val

305 310 315 320

Leu Lys Gly Met Leu Lys Lys Phe Lys Glu Asp Leu Arg Gly Glu Leu

325 330 335

Glu Lys Glu Glu Lys Val Glu Leu Thr Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn

340 345 350

Pro Arg Leu Ile Leu Ser Leu Asp Leu Lys Gly Val Arg Leu Gly Glu

355 360 365

Arg Ala Gln Asp Leu Pro Asn His Pro Cys Arg Phe Asp Thr Asn Thr

370 375 380

Arg Val Leu Ala Ser Cys Gly Phe Ser Ser Gly Arg His His Trp Glu

385 390 395 400

Val Glu Val Gly Ser Lys Asp Gly Trp Ala Phe Gly Val Ala Arg Glu

405 410 415

Ser Val Arg Arg Lys Gly Leu Thr Pro Phe Thr Pro Glu Glu Gly Val

420 425 430

Trp Ala Leu Gln Leu Asn Gly Gly Gln Tyr Trp Ala Val Thr Ser Pro

435 440 445

Glu Arg Ser Pro Leu Ser Cys Gly His Leu Ser Arg Val Arg Val Ala

450 455 460

Leu Asp Leu Glu Val Gly Ala Val Ser Phe Tyr Ala Val Glu Asp Met

465 470 475 480

Arg His Leu Tyr Thr Phe Arg Val Asn Phe Gln Glu Arg Val Phe Pro

485 490 495

Leu Phe Ser Val Cys Ser Thr Gly Thr Tyr Leu Arg Ile Trp Pro

500 505 510

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctcggggtt gagatcacc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaggcacat tgctacacct 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcaccacac cttctacaat g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagcacagcc tggatagcaa c 21

Claims

1.TRIM7在制备预防或治疗肝癌的药物组合物中的应用，其特征在于，TRIM7序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括TRIM7功能性表达促进剂。