CN114075600B - Orm2基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点中的应用 - Google Patents

Orm2基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ORM2基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点中的应用。本发明提供了降低ORM2蛋白含量或者抑制ORM2基因表达的物质在制备具有如下1)和/或2)所示功能产品中的应用：1)抑制肿瘤转移；2)治疗肿瘤。本发明使用iTRAQ蛋白质定量技术初步筛选出ORM2蛋白为目标蛋白，在基因转录水平和蛋白表达水平同时证明了在四氯化碳和奥沙利铂治疗后小鼠肝脏中ORM2表达显著增高。小鼠动物模型中，将ORM2蛋白在小鼠肝脏过度表达后可显著增加小鼠肝脏和肺脏转移肿瘤的数量；肝脏特异性敲降ORM2的小鼠，肝脏转移肿瘤的数量明显减少。

Description

ORM2基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种ORM2(Orosomucoid-2，Alpha-1-AcidGlycoprotein 2，类粘蛋白2)基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点及肿瘤转移临床辅助诊断中的应用，尤其涉及ORM2基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点中的应用。
背景技术
肿瘤转移是患者死亡的主要原因，化疗药物尽管在体外杀死肿瘤细胞非常有效，但临床研究发现化疗药物与肿瘤转移密切相关。部分研究表明，化学药物可能诱发肿瘤细胞发生改变，从而加剧肿瘤细胞增殖和扩散。因此，值得关注的不仅是化学药物引起的恶心和脱发等副作用，化疗促进肿瘤生长和转移的副作用更应引发人们深思。对化疗与肿瘤转移的相关机制进行研究，期待保留化疗药物治疗疗效的同时降低转移发生概率。
用于肝转移研究的动物模型，通常使用两种方法：(1)在脾脏包膜下注射肿瘤细胞(脾脏注射法)；(2)盲肠浆膜下移植肿瘤细胞(盲肠法)。1959年，勒杜克率先成功使用脾脏注射肿瘤在小鼠肝脏中引起肿瘤的形成。脾脏注射法是常用的方法且优势显著，因为肿瘤细胞注射技术相对容易，形成的肿瘤结节不影响动物的存活，产生肝转移效果稳定，就算在小鼠中也可以使用，被广泛使用在研究肝脏转移的动物模型中。
在盲肠法中，肿瘤经过在盲肠浆膜下移植，是一种可以模拟自然条件下产生的原位移植模型。盲肠法的最大缺点是盲肠中的肿瘤细胞植入操作复杂，时间长，大约需要5周，它会导致肝转移，肺和弥漫性腹膜转移，产生肝转移效果不够稳定并且难以处理大鼠模型，用于研究肝脏微转移时不够理想因为很难判断实验观察时间。
此外，在肝脏组织上直接注射肿瘤细胞，由于无法模仿结直肠癌的血源性扩散的公认假设，操作难度极大已经很少使用。直接在门静脉系统中注射肿瘤细胞模拟血管扩散并也因为可以在其他地方发生肿瘤的风险及操作难度不如脾脏注射方便也很少被使用。
尾静脉注射建立肺癌实验性转移模型。这种方法通常将肿瘤细胞悬液直接注射血管腔内建立的模型，这种方法的优点缩短了靶向器官内形成瘤灶的时间，转移率高。缺点是该模型模拟了肿瘤复杂转移过程的一个阶段，并不能模拟转移的全过程。与皮下注射肿瘤细胞相比，转移率高且出现转移的时间明显缩短。与原位移植相比，小鼠不容出现感染，且存活时间长有利于后续的研究。因此，该模型特点是操作简单、出现远处转移的时间短、转移效率高、动物存活率高及存活时间长。
药物诱发的肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)是临床上最为复杂的肝脏疾病。尽管药物监管机构对药物开发提出了严格的要求，但随着药物种类和数量的不断增多，药物诱发的肝脏损伤发生概率依旧呈现出居高不下的态势。西方国家，较为常见的，能够诱发肝脏损伤的药物，主要包括：(1)抗感染药物；(2)抗炎药物；(3)神经系统治疗药物等等，而草本药物仍然是东方国家引起肝毒性的主要原因之一。肿瘤患者的用药是十分复杂的，现代观点归因为药物种类的繁多，除了使用化疗药物之外，镇痛药和抗生素也是临床医生治疗肿瘤过程中常用药物，甚至一部分国家的患者尝试使用一些传统药物去治疗肿瘤。因此，在肿瘤患者中发生药物性肝损伤就在所难免。大多数结直肠癌的局部晚期或转移性肿瘤都会使用到细胞毒性药物，如，(1)伊立替康；(2)奥沙利铂；(3)5-氟尿嘧啶；(4)卡培他滨等等。尤其突出的奥沙利铂，作为第三代的，含有铂类金属元素的化学治疗药物，在20年前的时候就已经被美国的FDA组织，批准在患者身上用于治疗III期/IV期的结直肠癌，各种化疗方案中都含有奥沙利铂，成为第一线治疗结肠恶性肿瘤的药物。越来越多的研究发现使用完奥沙利铂治疗后的患者可以出现肝脏增生性结节产生肝门静脉高压，究其原因是因为发生了肝窦梗阻综合征，也叫"蓝肝综合征"，研究发现基于奥沙利铂的化学疗法与高达45％的肝窦梗阻综合征的发展有关。肝窦梗阻综合征通常从病理学上，表现为：(1)以肝脏腺泡Ⅲ区为主的，肝脏血窦的，内皮细胞也会发生的，细胞肿胀，细胞损伤，细胞死亡脱落；(2)肝血窦会显著扩张，还会充入血液；(3)肝脏内原来有的小静脉血管，血管壁会增厚，血管管腔变得狭窄不堪，血管管腔会生闭塞；(4)肝脏内部组织可以没有纤维化表现，当然部分患者可见肝脏汇管区稍微轻度的纤维增生性改变。按上述的认识来说，为了克服上述不良反应，寻找保护免受由奥沙利铂等药物损害肝脏的有效药物显得十分重要。
总之，恶性肿瘤已成为人类的第一杀手。目前，让肿瘤患者死亡的主要原因之一是发生远处器官的转移，特别是肝肺等脏器的转移。因此，探索肿瘤转移的原因可以为潜在的临床干预提供有效的指导。医生在医治肿瘤患者的过程中需要使用各种药物。药物性肝损伤是最常见的不良反应。例如化疗药物是常见的可以引起肝功能损害的药物。
发明内容
本发明的一个目的是提供降低ORM2蛋白含量或者抑制ORM2基因表达的物质的用途。
本发明提供的降低ORM2蛋白含量的物质或者抑制ORM2基因表达的物质或抑制ORM2蛋白功能的物质在制备具有如下1)和/或2)所示功能产品中的应用在制备具有如下1)和/或2)所示功能产品中的应用：
1)抑制肿瘤转移；
2)治疗肿瘤。
所述物质为以ORM2蛋白为靶点实现降低ORM2蛋白含量的物质或者抑制ORM2基因表达的物质或抑制ORM2蛋白功能的任意物质。
上述应用中，所述肿瘤转移为肿瘤肝脏转移和/或肿瘤肺脏转移。
上述应用中，所述肿瘤肝脏转移为药物引发肿瘤肝脏转移。
上述应用中，所述药物为引起肝损伤的药物，所述引起肝损伤的药物可以为铂类化疗药物，例如卡铂、顺铂、奥沙利铂、依铂奈、达铂、奈达铂、草酸铂等等；在本发明的实施例具体为以奥沙利铂为代表的至肝损伤的化疗药物。
上述肿瘤可以为结直肠癌，也可以为肝癌、肺癌、胰腺癌、软组织肉瘤等。
上述降低ORM2蛋白含量或者抑制ORM2基因表达的物质具体可以为如下：
1)靶序列为ACCCTGAGCTGG的sgRNA；该sgRNA具体可以为5‘-GGGCAGGCACTTACCCAGCTCAGGGT-3’；
2)含有所述sgRNA的重组载体或重组病毒；具体可以采用腺病毒。
本发明另一个目的是提供ORM2蛋白的用途。
本发明提供了ORM2蛋白在制备具有如下1)和/或2)所示功能产品中的应用：
1)促进肿瘤转移；
2)筛选治疗肿瘤转移药物。
上述应用中，所述肿瘤转移为肿瘤肝脏转移和/或肿瘤肺脏转移。
上述应用中，所述肿瘤肝脏转移为药物引发肿瘤肝脏转移。
上述应用中，所述药物为引起肝损伤的药物，在本发明的实施例具体为以奥沙利铂为代表的至肝损伤的化疗药物。
上述肿瘤可以为结直肠癌，也可以为肝癌、肺癌、胰腺癌、软组织肉瘤等。
ORM2蛋白作为靶标在筛选及治疗肿瘤转移药物中的应用也是本发明保护的范围。
检测待检者ORM2蛋白表达量的物质在制备诊断或辅助诊断待检者是否为肿瘤转移患者中的应用也是本发明保护的范围。
ORM2蛋白可以为人源也可以为鼠源；在本发明的实施例中，以小鼠的ORM2蛋白为例，作为动物模型，小鼠ORM2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。人源的ORM2含量在临床上跟结直肠癌转移密切相关，人源ORM2(氨基酸序列为序列表中序列3,编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4)可能是促进临床结直肠癌患者转移的关键因素。
本发明使用iTRAQ蛋白质定量技术初步筛选出ORM2蛋白为目标蛋白，在基因转录水平和蛋白表达水平同时证明了在四氯化碳和奥沙利铂治疗后小鼠肝脏中ORM2表达显著增高。小鼠动物模型中，将ORM2蛋白在小鼠肝脏过度表达后可显著增加小鼠肝脏和肺脏转移肿瘤的数量；肝脏特异性敲降ORM2的小鼠，肝脏转移肿瘤的数量明显减少。
附图说明
图1为四氯化碳处理(模拟药物肝脏损伤)对小鼠肿瘤肝转移的影响。
图2为奥沙利铂治疗(模拟临床化疗肝脏损伤)对小鼠肿瘤肝转移的影响。
图3为肝脏损伤后蛋白改变的iTRAQ蛋白质谱的筛选及验证。
图4为ORM2蛋白过表达病毒载体注射后在小鼠器官分布及表达的情况。
图5为机体过表达ORM2蛋白对肿瘤肝转移的影响。
图6为机体过表达ORM2蛋白对肿瘤肺转移影响。
图7为肝脏特异性敲除ORM2对药物性肝损伤引起的肿瘤肝转移的影响。
图8为临床发生结直肠癌转移患者血清ORM2含量的情况。
图9为正常人群中ORM2血清含量的情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小鼠为Balb/c小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，目录编号11002A，体重为18-20g；
下述实施例中的四氯化碳购自中国天津大茂化学化工试剂厂，目录号3903；
荧光素酶底物D-荧光素钾盐上海莱滋生物公司，产品编号40901ES01。
人ORM2 Elisa试剂盒(96次规格)购自中国Cusabio公司，货号：CSB-E11821h。
小鼠ORM2 Elisa试剂盒(96次规格)购自中国Cusabio公司，货号：CSB-EL017238MO
下述实施例中的带有荧光素酶标记CT26结直肠癌细胞按照如下方法制备：其中起始野生型CT26.WT细胞购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,资源编号3131C0001000800037；Lvs-Luc-EGFP慢病毒购自北京丽科利生物技术公司，病毒滴度为1x108 TU/ml，制备方法如下：
按说明书常规操作细胞：(1)在实验的前一天，使用24孔的细胞培养板，铺板一个孔即可，接种生长状态优良的细胞，数量约为1x105/孔；(2)待到第二天，细胞接触融合率达到50％-70％，更换为无血清培养基且把Lvs-Luc-EGFP慢病毒液加入到小孔中感染细胞，MOI值(即细胞数量：病毒数量)等于1:10；(3)感染细胞6小时，缓慢地吸出无血清培养，轻轻地加入完全培养基，继续培养细胞18小时；(4)按照1.5.1方法消化细胞，准确对细胞计数，调整细胞最终的浓度为100个/10ml(根据细胞计数结果得到)；(5)将稀释后的细胞(边加边混合细胞悬液)加入到96孔板里，尽量保证一个孔里只加了一个细胞；(6)培养6小时即可观察；(7)小心地将96孔板细胞专门培养箱中取出，调节倒置显微镜放大倍数到400倍模式，观察每一个小孔(将含有一个细胞的小孔划“圈”标记)；(8)继续培养24小时，使用荧光倒置显微镜，观察划“圈”标记的小孔细胞，将能够发绿光的小孔标记下来；(9)每日观察2次标记小孔中细胞生长情况，待细胞长满小孔(约2周左右)，即可将小孔中细胞消化下来放到24孔传代培养；(10)随后细胞不断繁殖形成带有Luc荧光标记的单克隆细胞株，冻存保种。
下述实施例中的方法：
1、固定包埋做苏木素-伊红(HE)染色
将取好的肝脏组织PBS中漂洗2次。(1)用干净的眼科剪，将肝组织剪成小拇指指甲盖大小，投入10％多聚甲醛(也可以选用4％福尔马林)溶液，固定24小时即可；(2)甲醛固定好的肝脏组织，做好标记后放入一次性蜡盒中，按下面步骤进行操作:70％EthanoⅠ60分钟，80％EthanolⅠ60分钟，90％EthanolⅡ60分钟，95％EthanolⅢ60分钟，EthanolⅠ40分钟，EthanolⅡ40分钟，XyleneⅠ40分钟，XyleneⅡ40分钟，ParaffinⅠ60分钟ParaffinⅡ60分钟，ParaffinⅢ60分钟，浸蜡后包埋；(3)包埋好的组织蜡块，在莱卡牌切片机上切出5-15μm的切片，烤干切片(1小时即可)；(4)如果烤片，将切片放至烤箱中65℃50分钟，按照下边程序进行操作:XyleneⅠ10分钟，XyleneII 8分钟，95％EthanolⅠ1分钟(再重复一次95％EthanolⅠ1分钟)，80％EthanolⅡ1分钟，自来水流水冲洗5分钟；(5)苏木素一过性地浸染(约5-10秒)；(6)自来水流水冲洗切片(至肉眼见无色即可)；(7)1％Ethanol hydrochloride分化1秒钟；(8)自来水流水清洗1分钟，1％的伊红浸染1分钟；(9)自来水流水清洗1分钟，95％EthanolⅠ1分钟，95％EthanolⅡ1分钟，EthanolⅠ1分钟，EthanolⅡ1分钟，XyleneⅠ1分钟，XyleneⅡ1分钟，待甩干后中性树胶过夜封片并观察。
2、活体成像仪检测
(1)为避免不必要的荧光干扰，实验前一天对小鼠进行禁食，但不要禁水；实验当天，先用温水浸湿的纱布搽拭口鼻、爪子以及排尿处；(2)首先打开稳压电源，再打开活体成像仪开关，2min后再打开电脑及成像软件；(3)将从动物房取回的待测小鼠按上述要求准备好后，称量体重；(4)按照0.1ml/10g的注射标准注射萤光素酶底物Luciferin，开始记录时间；(5)将5％(w/v)的戊巴比妥钠10倍稀释(注意稀释后过滤除菌)，按0.1ml/10g剂量，麻醉实验中的所有小鼠；(6)待小鼠睡着后，迅速处死小鼠，摘取小鼠肝脏，按顺序摆放到成像专用纸(黑色)，将纸片放到活体成像仪托盘中成像；(7)约在注射完萤光素酶底物15min左右时荧光产生可达峰值且可持续1小时左右，拍照并分析荧光强度。
3、荧光实时定量PCR技术检测ORM2基因的表达：
1)组织和细胞的总RNA的提取
(1)务必获取长势良好的细胞，应处在对数生长期；(2)使用胰酶消化细胞，最后收集到1.5ml离心管中；(3)用PBS洗3次(充分取出血清)，加入1ml TRIzol试剂；(4)用1ml枪头(无RNA酶)反复抽吸看不到细胞沉淀为止；(5)使用涡旋振荡器，剧烈震荡变白色为止，室温静置10分钟；(6)如果使用的为组织标本，按照每50mg组织加入1ml TRIzol试剂的比例，其余操作同上；(7)每1ml Trizol加0.2ml氯仿(抽提RNA)，使用涡旋振荡器剧烈振荡，15秒；(8)小管(室温)静置15分钟；(9)(2-8)℃，12000转/分钟，离心20分钟即可；(10)上层水相(约0.5ml)，小心移入另一个处理过的EP管中；(11)加入等体积(约0.5ml)异丙醇，室温剧烈振荡，静置10分钟；(12)(2-8)℃，12000转/分钟，离心15分钟；(13)弃上清(RNA附着在管壁斜面)，加1ml75％乙醇(由DEPC水配制)洗涤白色絮状沉淀；(14)(2-8)℃(室温也可以)，7500转/分钟，离心2分钟；(15)小心吸干上清，开盖暴露于空气中，大约干燥5-10分钟；(16)加入40ul DEPC水溶解沉淀的RNA(溶解的水可以提前升温至65℃)；(17)测定RNA浓度；(18)配制琼脂糖凝胶(浓度为2％)，使用核酸电泳方法，检测RNA样品质量；(19)使用去离子水调零，测定样品的吸光度，计算总RNA的浓度；(20)如果吸光度A260/280比值，在1.8-2.0之间，判定为样品合格；(21)RNA跑胶体条带为3条(有时候为2条)无涂抹的RNA为合格；(22)分装样品并做好标记；(23)-80℃冰箱可长期保存；-20℃保存则尽快用于后续实验。
2)总mRNA的逆转录成为cDNA
严格按试剂说明书(Takara,PrimeScriptTM RT Master Mix,RR036A)，进行操作:(1)去除总RNA里残留的DNA分子，配置实验反应体系:a.5×gDNA Eraser Buffer 2μl；b.gDNA Eraser 1μl；c.提取好的RNA 2μl(500ng/μl)；d.RNase Free水补齐到10μl；(2)42℃，2min或室温放置20分钟；(3)进行逆转录，反应体系如下:a.PrimeScriPt(5x)Buffer 4μl；b.PrimeScriPt RT Enzyme Mix I1μl；c.上述反应产物10μl；d.RNase Free水5μl；(4)设置程序：a.37℃，15分钟(逆转录过程)；b.85℃，5秒(酶类失活)；(5)去离子水稀释逆转录产物20倍，-20℃保存或待用。
3)实时定量荧光PCR(qRT-PCR)的操作
(1)避光条件下配置：a.SYBR-Green qPCR Mix 10μl；b.Forward Primer 0.5μl；c.Reverse Primer 0.5μl；d.cDNA 2μl；e.去离子水7μl，共计20μl；(3)每个样本加3个重复孔，上机操作；(4)反应程序:a.95℃，预变性5分钟；b.95℃，变性15秒；c.60℃，退火；d.72℃，延伸，30秒；e.b-d过程共计40个循环；(5)统计分析方法:采用2-ΔΔCt方法将基因表达量转变为倍数关系，进行数据整理和分析，方便结果观察；(6)Ct值，仪器能够检测到的荧光信号经历的循环次数的值(这个荧光信号必须达到所设定的阈值)；(7)ΔCt是各样品的Ct值减去内参的Ct值(即ΔCt＝目的基因ΔCt-内参ΔCt)；(8)ΔΔCt＝实验组ΔCt-内参组ΔCt；(9)以2-ΔΔCt计算，得到的值是实验组对比对照组某个基因表达的相对倍数的改变，称为基因相对表达量；(6)荧光PCR十分敏感，实验每个样本不但要做三个复孔，而且复孔间的ΔCt值不应超过0.5。
4、Western Blot技术检测ORM2蛋白的表达：
(1)戴好橡胶手套和口罩，将玻璃板固定器上固定好(用自来水洗干净即可)，继续加入去离子水冲洗3次(控干)；(2)使用去离子水填满玻璃板，观察10分钟；(3)没有漏液时方可进行后续实验；(4)倾斜玻璃板子，倒掉去离子水，务必倒干净(也可以用滤纸吸干残玻璃板残留的水)；(5)按照上边描述的方法，新鲜配制相应浓度的分离胶(本试验中ORM2使用10％分离胶即可)；(6)注入约7ml的分离胶，使胶体距离板口约1cm；(7)用去离子水缓慢地加入玻璃板中(这叫压胶，目的是使胶面保持水平)；(8)室温放置30分钟，观察有无折叠线的形成；(9)分离胶聚合后才可以倒掉去离子水，用滤纸吸干残留的去离子水；(10)按照上述配方配制浓缩胶(可加入粉红色染料)，注入胶板后立即插入10孔梳子，室温放置待凝固；(11)检查电泳装置并组装；(12)倒入新鲜稀释的电泳缓冲液(可重复利用)；(13)将胶板垂直地放入电泳槽才可以缓缓拔出梳子(避免将胶体弄弯)；(14)样品孔每孔上样30μg蛋白(样品品孔旁边的孔加入5μl的蛋白marker作为指示)；(15)多余的空孔中加入1x的蛋白变性缓冲液(使条带整齐，减弱蛋白堆积力)；(16)用新鲜配制的电泳液加满电泳槽；(17)注意用电安全地连接电源；(18)先采用80V恒压电泳方式(蓝色的样品线，到达浓缩胶与分离胶交界)：(19)再调节电压为120V(直至溴酚蓝跑到分离胶底部)；(20)取厚海绵2块、厚滤纸2张和硝酸纤维素膜(NC膜)1片，放入转膜液中，平衡几分钟(在电泳快要结束时操作即可)；(21)电泳结束后，按黑胶白膜的原则，依次放入：a.海绵；b.滤纸；c.硝酸纤维素膜；d.胶体；e.滤纸；f.海绵，不可以有气泡；(22)将“三明治”电转夹子放入电转槽中，加满转膜液开始转膜；(23)转膜槽提前放入冰水混合中，转膜条件为：恒流250mA，时间为100分钟；(24)根据蛋白marker裁剪NC膜(使有目的蛋白条带和内参蛋白膜分开)；(25)裁好的膜(蛋白面朝上)放入TBST中，漂洗3次，每次1分钟；(26)将漂洗好的NC膜放入5％牛奶中(不可以有小凝块)，室温封闭1小时即可；(27)封闭完成后的NC膜，放入一抗(affinity公司,货号DF8280，1:150)稀释液中，冷室过夜至少16小时；(28)从冷室将NC膜取出，放入TBST中，在摇床上(40转/分钟)漂洗3次，每次10分钟即可；(29)漂洗完成后，将NC膜放入二抗(affinity公司,货号S0001，1:1000)稀释液中，在摇床上(20转/分钟)室温孵育60分钟；(30)将NC膜放入TBST中，在摇床上(40转/分钟)漂洗3次，每次10分钟即可；(31)按1:1比例将ECL发光液(A液和B液充分混合)；(32)发光仪器中进行检测(注意控制曝光时间)，拍照保存；(33)用Image J软件分析蛋白的灰度值即可。
5、ELISA技术检测ORM2含量情况：
(1)从冰箱中取出ELISA检测试剂盒(cusabio公司，小鼠ORM2货号CSB-EL017238MO，人ORM2货号：CSB-E11821h)；(2)试剂盒中各试剂均平衡至室温(增加实验准确性)；(2)按说明书配置：a.标准品；b.洗液；c.抗体稀释液，所有试剂均充分混匀(不可以有气泡)；(3)待检测血清按说明书稀释(预实验发现1:2000稀释刚好)；(4)96孔板上分别设：a.空白孔；b.标准孔；c.待测样品孔；(5)a.空白孔加样品稀释液100μl；b.标准品孔加标准品(cusabio公司，货号CSB-EL017238MO自带)100μl；c.样品孔加稀释后待测样品100μl；(6)每个孔中加入检测抗体稀释液工作液(在使用前15分钟内配制)50μl；(7)96孔板上加膜覆盖覆，37℃温育，1小时；(8)使用甩干法(不可以在劣质纸巾上拍板)甩掉孔内液体；(9)用提前配置好的洗液洗板5次，每次5分钟；(10)最后一次将孔内液体，狠狠地拍干；(11)每孔加含辣根过氧化物酶Conjugate工作液(临用前10分钟内配制)100μl；(12)96孔板上加膜覆盖覆，37℃温育，30分钟；(13)甩干法甩掉孔内液体，方法见步骤8；(14)每孔加底物(注意避光)溶液90μl，酶标板加上覆膜，37℃温育15分钟；(15)每孔加终止液(避免接触皮肤)50μl，蓝色立即变成黄色；(16)使用酶标仪，450nm波长，测量各孔的OD值，记录结果；(17)根据结果绘制标准曲线，计算各个孔的检测结果；(18)注意事项:为了使结果更准确，通常一个样本至少做2个复孔，根据复孔结果平均值计算每个样本的最终结果；(13)在测定组织样本的时候，通常将测定值/测定的蛋白浓度，这样就代表该组织中每克蛋白含有这种目的蛋白是多少，在一定程度上消除了误差。
实施例1、与肿瘤转移相关蛋白ORM2的筛选
1、四氯化碳处理(模拟药物肝脏损伤)对小鼠肿瘤肝转移的影响
1)四氯化碳对小鼠肝损伤的影响
四氯化碳是公认的能够严重引起肝脏损伤的化学药物。为了确认实验过程中使用的治疗剂量是否可以引起肝脏损伤，并观察肝损伤发生的程度和损伤持续的时间，使用按0.2ml/kg小鼠的剂量对小鼠腹腔进行注射四氯化碳，并观察注射后第3，5，7，10，14天小鼠肝脏病理情况的变化情况(n＝30)。与此同时，收集第3天；第5天；第7天；第10天；第14天小鼠外周血浆，并利用全自动生化分析仪检测评价肝功能的ALT和AST两个指标。
和正常对照组比较，小鼠肝脏第3天时候损伤最严重，肝细胞失去了完整的形态并见大量的免疫细胞浸润。第5天时候肝脏损伤逐渐好转，浸润的免疫细胞逐渐减少，肝细胞成气球样变化。第7天时候肝脏损伤继续好转，免疫细胞数量继续减少，肝细胞形态逐渐趋于正常。第10天时候肝细胞形态基本恢复正常。第14天时候肝细胞形态完全正常(见图1A)。(2)CCL4引起肝损伤后小鼠肝脏第3天时候损伤最严重，跟正常对照组比较ALT和AST数值均达到高峰，分别约是正常对照组的25倍和15倍(P<0.001，见图1B)，随后迅速下降，第五天时候基本达到正常小鼠血浆水平，与对照组无显著差异。
2)肝损伤促进肿瘤肝转移
实验组(CCl4)：使用四氯化碳(可以引起小鼠肝脏损伤的经典药物)，经小鼠腹腔注射(按0.2ml/kg小鼠的剂量)；3天后经脾脏注射(1x106个/小鼠)的CT26结直肠癌细胞，并在第14天时候观察小鼠肝脏肿瘤情况(n＝10)。
对照组(con)：与实验组的区别在于不使用四氯化碳。
对小鼠内脏器官进行拍照；对小鼠本身和肝脏分别进行称重；对小鼠肝脏组织进行固定包埋做苏木素-伊红(HE)染色。
小鼠肝脏肿瘤情况结果如图1C所示，可以看出，与对照组的不使用四氯化碳药物治疗小鼠相比较，使用四氯化碳治疗的小鼠组肝脏上肿瘤数量明显增多，肝脏上布满密密麻麻的肿瘤，很难使用肉眼计数，对照组肝脏几乎不见肿瘤。HE染色显示，使用四氯化碳治疗的小鼠肝脏中明显可以见肿瘤细胞生长，局部可见损伤后修复的肝脏组织和小的肿瘤灶；对照组小鼠，肝脏组织未见有肿瘤浸润生长。
因为有肿瘤生长的小鼠肝脏重量会增加，因此采取了小鼠肝脏直接称量法和小鼠肝脏重量除以小鼠体重(记作肝脏指数)，计算肝脏指数。
肝脏指数结果如图1C所示，可以看出，小鼠标准化后的肝脏指数也明显增加，约是对照组的3倍(P<0.001)。
肝脏重量结果如图1C所示，可以看出，使用四氯化碳治疗的小鼠肝脏重量明显增加，约是对照组重量的4倍(均为P<0.001)。
上述结果表明，四氯化碳明显促进了结直肠癌肝转移的发生，造成肝损伤的药物四氯化碳促进结直肠癌肝转移。
2、奥沙利铂治疗对小鼠肿瘤肝转移的影响
1)奥沙利铂治疗引起的肝损伤
奥沙利铂(OXA)是治疗结直肠癌的一线化疗药，是可以引起成为"蓝肝综合征"的肝损伤的化疗药物。按5mg/kg小鼠的剂量对小鼠腹腔进行注射奥沙利铂，参考CCL4引起肝损伤检测方法，观察注射后第3天小鼠肝脏病理情况的变化情况，并收集外周血分离血浆检测可以评价肝脏功能损伤指标的ALT和AST(n＝10)。
结果显示:奥沙利铂注射后小鼠肝脏第三天时候，与对照比较，发现小鼠肝脏中肝细胞并没有呈弥漫性损伤，只是肝血窦周围肝细胞发生明显得肿胀和细胞间隙明显增大，可见部分细胞核消失。与正常对照组比较，ALT和AST检测到的数值显著增加，分别约是正常对照组的4倍和5倍(分别为P<0.01，P<0.001，见图2A)。
证明奥沙利铂会引起肝脏形态学改变并引起肝功能的异常，造成肝损伤。
2)奥沙利铂治疗对小鼠肿瘤肝转移的影响
实验组：奥沙利铂(按5mg/kg小鼠的剂量)经小鼠腹腔注射(n＝10)；3天后经脾脏注射(5x105个细胞/小鼠)的CT26结直肠癌细胞，接种肿瘤后(第12天)经小鼠腹腔注射荧光素酶底物D-荧光素钾盐(150mg/kg)，在小鼠活体成像仪上观察实验结果。
对照组(con)：与实验组的区别在于不使用奥沙利铂。
结果显示:(1)与对照组不使用奥沙利铂药物相比，使用奥沙利铂治疗的小鼠组肝脏上肿瘤数量明显增多，荧光强度明显增强(见图2B)。对荧光数值进行统计发现，奥沙利铂药物组的平均荧光强度显著增高，是对照组的1000倍左右(P<0.001，见图2B)。
另外，小鼠处死后对标本进行拍照并进行石蜡包埋和HE染色。
结果显示：与对照组不使用奥沙利铂药物相比，使用奥沙利铂治疗的小鼠组肝脏上肿瘤数量明显增多，肿瘤呈针尖样突起，对照组未见肉眼可见到的明显肿瘤。肝脏的HE染色，显示使用奥沙利铂治疗的小鼠组肝脏上确实为肝转移肿瘤且跟对照组相比肿瘤数量明显增多，对照组肝脏未发现肿瘤细胞浸润(见图2C)。
结果提示：奥沙利铂确实可以显著促进了肿瘤细胞肝转移的发生，证明治疗结直肠癌的奥沙利铂可以促进肿瘤肝转移。
3、肝脏损伤后蛋白改变的iTRAQ蛋白质谱的筛选及验证
肝脏发生损伤后，会使肝脏的微环境发生一系列的改变。为了寻找到关键性的蛋白，选择使用iTRAQ蛋白质谱技术寻找差异蛋白。差异蛋白入选标准:(1)肝脏中表达的，且为分泌型的；(2)表达差异大的；(3)跟免疫系统有一定关联性的；(4)研究相对较少的。对照组是不做任何药物处理；实验组(按0.2ml/kg小鼠的剂量)经小鼠腹腔注射四氯化碳，3天后摘取小鼠肝脏组织并迅速液氮冻存后立即干冰运输华大基因公司进行分析(n＝10)。iTRAQ蛋白质谱技术检测的是蛋白片段，它高通量的检测方法可以作为筛选关键基因的强有力的工具。
结果如图3A所示，选择差异性蛋白大于2倍变化才算有显著性改变。(1)通过与对照组的蛋白相比较，降低的蛋白有161个，升高的蛋白有1051个，没变化的蛋白有4743个(图3A)。
另外，发现有一组数据不能以倍数的形式展示出来，这部分蛋白为对照组没有检测到表达，而只有四氯化碳组明显表达出来，只有在四氯化碳诱导时候可以检测到的蛋白有301个，消失的蛋白有19个(见图3A)；做了一下统计，这类蛋白中与分泌有关的蛋白有55个，不能明确蛋白种类的35个，其他的为骨架或者核蛋白等230个(见图3A)，其中ORM2是与分泌有关的55个蛋白中的一个。
结果提示:肝损伤之后肝脏微环境发生了显著的改变，其中ORM2蛋白表达显著升高。
ORM2蛋白氨基酸序列为序列表中序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
4、肝脏损伤后ORM2蛋白变化情况的验证
经过上述iTRAQ蛋白质谱技术初步筛选出ORM2蛋白。为了增加实验的严谨性，通过荧光实时定量PCR技术和Western Blot技术验证四氯化碳0.2ml/kg引起小鼠肝损伤后ORM2蛋白表达情况(n＝10)。
四氯化碳0.2ml/kg引起小鼠肝损伤：使用四氯化碳(可以引起小鼠肝脏损伤的经典药物)，经小鼠腹腔注射(按0.2ml/kg小鼠的剂量)；3天后处死收集小鼠肝脏。
1)荧光实时定量PCR技术
提取小鼠肝脏的总RNA作为模板，以ORM2上5-GTCATGGTGAGCCTCCTGCCG-3；和ORM2下5-GGGTTTAGGACAGCCGCACCAAT-3引物，进行扩增Q-PCR检测(具体见前述实施方法)。
结果如图3B所示，可以看出，四氯化碳治疗后第3天，在肝脏中ORM2基因的表达量明显增加，可达对照组的约18倍(P<0.05)；
2)Western Blot技术检测ORM2蛋白水平变化
具体见前述实施方法，结果如图3B所示，可以看出，从蛋白质水平证实ORM2蛋白的表达量明显增加，表达灰度值是对照组的2倍(P<0.05)。
上述结果表明，四氯化碳治疗后(肝脏损伤)第3天在肝脏中ORM2含量明显增加。
5、化疗药奥沙利铂引起小鼠肝脏损伤后ORM2蛋白变化的情况
结合之前的研究的内容，四氯化碳可以引起ORM2表达增多，为了证明引起肿瘤转移增多的奥沙利铂是否会引起ORM2增多，进行如下实验：
奥沙利铂(按5mg/kg小鼠的剂量)经小鼠腹腔注射(n＝10)；3天后处死小鼠，取出肝脏并通过通过荧光实时定量PCR技术检测肝脏内ORM2基因的表达。
1)荧光实时定量PCR技术
提取小鼠肝脏的总RNA作为模板，以ORM2上5-GTCATGGTGAGCCTCCTGCCG-3；和ORM2下5-GGGTTTAGGACAGCCGCACCAAT-3引物，进行扩增Q-PCR检测(具体见前述实施方法)。
结果如图3C所示，可以看出，与对照组相比较，奥沙利铂处理后ORM2转录水平可达到对照组的约30倍(P<0.001)；
2)ELISA技术检测奥沙利铂处理后小鼠肝脏中的ORM2含量情况
具体见前述实施方法，结果如图3C所示，可以看出，奥沙利铂腹腔注射小鼠处理后，肝脏中ORM2蛋白含量也明显增加，比对照组增多了约1.6倍(P<0.001)。
上述结果表明，引起肝脏损伤的化疗药物奥沙利铂可以增加机体ORM2的表达。
实施例2、ORM2蛋白在促进肿瘤转移中的研究
1、ORM2蛋白过表达病毒载体注射后在小鼠器官分布及表达的情况
为了探索ORM2蛋白是否可以促进肿瘤肝转移，需要将ORM2特异地过表达在小鼠肝脏部位(ORM2主要表达在肝脏组织)。因此采用带有荧光素酶的腺相关病毒作为载体，利用其不同血清型可以相对特异感染不同器官的特点，将ORM2过表达在肝脏(载体选择paav2)。
表达ORM2的腺相关病毒：购买于北京丽科利生物技术公司(序列1所示的ORM2蛋白编码基因)，病毒滴度为5x1012cfu/ml；
对照病毒：空载体病毒(对应表达ORM2的腺相关病毒的空载体病毒，空载病毒颗粒)购买于北京丽科利生物技术公司，病毒滴度为5x1012cfu/ml；
过表达ORM2小鼠(AVV-ORM2)组：将上述表达ORM2的腺病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到过表达ORM2小鼠；
空载体对照组小鼠(AVV-Con)：将上述对照病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到对照小鼠组；
每组10只小鼠。
注射21天后采取小鼠活体成像的方式观察各组小鼠不同器官感染结果，结果如图4A所示，可以看出，小鼠的肝脏和肺脏部位有明显得荧光成像，而其他部位未见明显荧光。
同时摘取注射21天后各组小鼠不同器官，采用荧光实时定量PCR技术(具体见实施方法)检测小鼠不同器官的ORM2表达情况。
收集小鼠外周血浆，并利用全自动生化分析仪检测评价肝功能的ALT和AST两个指标。
ALT和AST两个指标结果如图4B所示，与对照组比较，过表达ORM2并未改变肝功能指标，没有明显的肝损伤。
ORM2表达情况结果如图4C所示，与对照组比较，小鼠肝脏ORM2基因表达量显著增加，可达对照组ORM2基因的表达量的约20倍(P<0.001)。与对照组比较，小鼠肺脏得ORM2基因表达量也明显增加，可达对照组ORM2基因表达量的约2倍(P<0.05)。
结果提示:腺相关病毒作为载体感染小鼠肝脏促进ORM2过表达符合预期结果，可以继续后续实验，过表达ORM2小鼠模型成功，且过表达ORM2基因主要分布在肝脏和肺脏中表达。
2、机体过表达ORM2蛋白对肿瘤肝转移的影响
过表达ORM2小鼠(AVV-ORM2)：将上述表达ORM2的腺病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到过表达ORM2小鼠；
空载体对照组小鼠(AVV-Con)：将上述对照病毒按照1x1011 cfu/只小鼠尾静脉注射，得到对照小鼠组；
每组10只小鼠。
注射14天后，采取经小鼠脾脏注射CT26细胞1x106个细胞/小鼠，14天后观察小鼠肝脏肿瘤成瘤情况(n＝10)并计数小鼠肝脏表面的肿瘤数量。同时，分别称量小鼠的肝脏重量和小鼠体重，小鼠肝脏重量除以小鼠体重的数值(称作为小鼠肝脏指数)，进行结果统计。
小鼠肝脏肿瘤成瘤情况结果如图5所示，对照组几乎少见肉眼可见的肿瘤，与对照组相比较，过表达ORM2蛋白后的肝脏肿瘤数量明显增多(P<0.05)。
计数肝脏表面的肿瘤灶点数量如图5(单位：个)所示，与对照组比较，过表达ORM2蛋白后的，肝脏肿瘤灶点的数量是其的约20倍(P<0.05)。
小鼠肝脏的指数结果如图5所示，与对照组小鼠相比较，小鼠肝脏的指数也发生了明显增高，约是对照组小鼠的1.2倍(P<0.05)。
小鼠肝脏重量结果如图5所示，与对照组小鼠相比较，小鼠肝脏的重量也发生了明显增高，约是对照组的1.5倍(P<0.05)。
结果提示:ORM2的过表达明显促进了肿瘤肝转移。
3、机体过表达ORM2蛋白对肿瘤肺转移影响
根据1的实验结果，注射腺相关病毒的时候，肝脏组织大量过表达ORM2，肺部组织也有ORM2的表达增多，且ORM2作为分泌性的蛋白，作用器官不止在肝脏组织。因此，借此观察一下ORM2的过表达增多是否也会增加小鼠的肿瘤肺转移。
过表达ORM2小鼠(AVV-ORM2)：将上述表达ORM2的腺病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到过表达ORM2小鼠；
空载体对照组小鼠(AVV-Con)：将上述对照病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到对照小鼠组；
每组小鼠12只。
注射14天后，采取经小鼠尾静脉注射CT26细胞1x106个细胞/小鼠，随后21天时候观察结果。处死小鼠采取肉眼观察小鼠肺脏，并对肺组织进行石蜡包埋进行HE染色。观察小鼠肺脏中：(1)是否有肿瘤；(2)如果有则计数肺脏表面肿瘤数量。
结果如图6A所示，与对照组比较，过表达ORM2的小鼠组，肺部肿瘤转移数量明显增多。
HE染色结果如图6A所示，为了进一步观察肿瘤情况，在HE染色下观察小鼠肺脏的病理结果，发现与对照组比较，过表达ORM2小鼠小鼠的肺部肿瘤数量明显增多，可以微小的肿瘤灶，对照组几乎看不到肿瘤的发生。
对肺部肿瘤表面的肿瘤灶点进行统计，结果如图6B(单位：个)所示，过表达ORM2小鼠肺部肿瘤灶点计数明显增加，为对照组的约60倍(P<0.001)。
结果提示:ORM2的过表达明显促进了肿瘤细胞的肺部转移。
4、肝脏特异性敲除ORM2对药物性肝损伤引起的肿瘤肝转移的影响
1)敲除ORM2小鼠的制备
肿瘤转移的靶点综合以上结果，ORM2在肿瘤转移中发挥关键作用，那么它是否可以成为预防药物性肝损伤引起肿瘤转移关键靶点，使用Cas9腺相关病毒，敲除表达ORM2蛋白的基因(n＝10)。具体如下：
敲除ORM2的Cas9腺相关病毒：购买于北京丽科利生物公司，Cas9腺相关病毒中的sgRNA的靶序列为ACCCTGAGCTGG，sgRNA为5‘-GGGCAGGCACTTACCCAGCTCAGGGT-3’。
Cas9空病毒对照：对应敲除ORM2的Cas9腺相关病毒的空载体病毒(空载病毒颗粒)购买于北京丽科利生物公司。
敲除ORM2小鼠(AAV-Cas9-ORM2)：将上述敲除ORM2的Cas9腺相关病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到敲除ORM2小鼠；
空载体对照组小鼠(AVV-Con)：将上述Cas9空病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到空载体对照组小鼠；
手术摘取敲除ORM2小鼠(AAV-Cas9-ORM2)和空载体对照组小鼠(AVV-Con)的肝脏组织，提取肝脏组织总蛋白，使用Western Blot检测肝脏ORM2蛋白敲除效果(具体见实施方法)，抗体为ORM2抗体(affinity抗体公司公司及产品目录号DF8280)。
结果如图7A所示，使用AAV-Cas9-ORM2敲除小鼠肝脏21天后，小鼠中ORM2基因的表达量显著下降，是对照组，表达量的0.5倍(P<0.01)。证明敲除ORM2小鼠制备成功。
2)敲除ORM2对药物性肝损伤引起的肿瘤肝转移的影响
敲除ORM2小鼠(AAV-Cas9-ORM2)：将上述敲除ORM2的Cas9腺相关病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到敲除ORM2小鼠；
空载体对照组小鼠(AVV-Con)：将上述Cas9空病毒按照1x1011cfu/只小鼠尾静脉注射，得到空载体对照组小鼠，分成两组；
使用生理盐水处理1组空载体对照组小鼠；使用奥沙利铂(5mg/kg)腹腔注射处理1组空载体对照组小鼠和敲除ORM2小鼠组，制备得到2组小鼠。3天后，3组小鼠经脾脏注射带荧光标记的CT26细胞5X105个/小鼠，使用活体成像仪第12天时候观察小鼠肝脏荧光发光情况(n＝24)。
结果如图7B所示，未处理奥沙利铂对照组相比，使用奥沙利铂可明显增加小鼠肿瘤肝转移程度，荧光强度是其约100倍(P<0.001)。若降低ORM2表达可以显著降低奥沙利铂肝损伤导致的肿瘤肝转移数量。
结果提示:降低ORM2表达可以显著降低由奥沙利铂引起的肿瘤细胞肝转移数量，ORM2蛋白是预防药物性肝损伤肿瘤肝转移的重要靶点。
实施例3、ORM2蛋白在临床结直肠癌患者中ORM2蛋白含量情况的检测
纳入标准，收集了临床患者的血液标本使用Elisa方法检测外周血浆的ORM2含量。分组:(1)正常人组:小于45周岁(n＝40)，大于45周岁(n＝40)；(2)单纯只有结直肠癌的肿瘤患者组(n＝32)；(3)单纯发生了肝转移的肿瘤患者(n＝32)；(4)单纯发生了肺转移的肿瘤患者(n＝20)。纳入标准:(1)血常规:a.白细胞(4-10)x109/L；b.中性粒细胞比值(50-70)％；c.淋巴细胞比值(17-50)％；d.红细胞(4.0-5.50)x1012/L；e.血小板(100-300)x109/L。(2)血糖:3.9-6.1毫摩尔/升(餐前空腹)。(3)血脂:a.总胆固醇(2.8-5.17)mmol/L；b.甘油三酯(0.56-1.7)mmol/L。(4)肌酐:a.男性(53-106)umol/L；b.女性为(44-97)umol/L。(5)肝功能:a.血清总蛋白(60-80)g/L；b.血清白蛋白(40-55)g/L；c.谷丙转氨酶(5-40)U/L；d.谷草转氨酶(8-40)U/L；f.γ-转肽酶<50U/L；g.总胆红素(1.71-17.1)μmol/L。
结果显示:与正常人组相比，患有单纯结直肠癌患者的ORM2外周血含量无显著性差异，但是如果发生了结直肠癌肝转移的患者则ORM2的含量显著上升，约为正常人和单纯结直肠癌患者含量的2倍(均为P<0.001，见图8A)。此外，如果发生了肺转移的患者ORM2血浆的含量是单纯结直肠癌患者的1.5倍(P<0.001，见图8B)。如果采取45周岁为年龄分界线，则无论大于(还是小于)45周岁，血浆中ORM2的含量无显著性差异(见图9)。
人源ORM2的氨基酸序列为序列表中序列3,编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4。
结果提示:ORM2含量在临床上跟结直肠癌转移密切相关，ORM2可能是促进临床结直肠癌患者转移的关键因素；可以通过判断待检者外周血浆的ORM2含量判断是否为结直肠癌转移患者。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京医院
<120> ORM2基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 624
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atggcactgc acatgattct tgtcatggtg agcctcctgc cgctgttgga agctcagaac 60
ccagaacatg tcaacatcac cataggcgac cctatcacca atgagaccct gagctggctc 120
tctgacaaat ggtttttcat tggtgcggct gtcctaaacc ctgattaccg gcaggaaatt 180
caaaagacgc agatggtatt ttttaacctt acccccaact tgataaatga cacgatggag 240
cttcgagagt atcacaccat agatgaccac tgtgtctata actccactca tctaggaatc 300
cagagagaga atgggaccct ctccaagtat gtaggaggag taaaaatctt tgcagacctg 360
atagtcttga agatgcatgg ggccttcatg cttgcctttg acttgaagga tgagaagaaa 420
cggggactgt ccctcaatgc aaaaaggcca gatatcaccc cggagctgcg ggaagtattc 480
cagaaggctg tcacacacgt gggcatggat gaatcagaaa tcatatttgt cgactggaaa 540
aaggacaggt gcagtcagca ggagaagcag cagcttgagc tggagaagga gaccaagaaa 600
gatcctgagg aaggccaggc atga 624
<210> 2
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Ala Leu His Met Ile Leu Val Met Val Ser Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Glu Ala Gln Asn Pro Glu His Val Asn Ile Thr Ile Gly Asp Pro Ile
20 25 30
Thr Asn Glu Thr Leu Ser Trp Leu Ser Asp Lys Trp Phe Phe Ile Gly
35 40 45
Ala Ala Val Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Gln Glu Ile Gln Lys Thr Gln
50 55 60
Met Val Phe Phe Asn Leu Thr Pro Asn Leu Ile Asn Asp Thr Met Glu
65 70 75 80
Leu Arg Glu Tyr His Thr Ile Asp Asp His Cys Val Tyr Asn Ser Thr
85 90 95
His Leu Gly Ile Gln Arg Glu Asn Gly Thr Leu Ser Lys Tyr Val Gly
100 105 110
Gly Val Lys Ile Phe Ala Asp Leu Ile Val Leu Lys Met His Gly Ala
115 120 125
Phe Met Leu Ala Phe Asp Leu Lys Asp Glu Lys Lys Arg Gly Leu Ser
130 135 140
Leu Asn Ala Lys Arg Pro Asp Ile Thr Pro Glu Leu Arg Glu Val Phe
145 150 155 160
Gln Lys Ala Val Thr His Val Gly Met Asp Glu Ser Glu Ile Ile Phe
165 170 175
Val Asp Trp Lys Lys Asp Arg Cys Ser Gln Gln Glu Lys Gln Gln Leu
180 185 190
Glu Leu Glu Lys Glu Thr Lys Lys Asp Pro Glu Glu Gly Gln Ala
195 200 205
<210> 3
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Ala Leu Ser Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Glu Ala Gln Ile Pro Leu Cys Ala Asn Leu Val Pro Val Pro Ile Thr
20 25 30
Asn Ala Thr Leu Asp Arg Ile Thr Gly Lys Trp Phe Tyr Ile Ala Ser
35 40 45
Ala Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Ser Val Gln Glu Ile Gln Ala
50 55 60
Thr Phe Phe Tyr Phe Thr Pro Asn Lys Thr Glu Asp Thr Ile Phe Leu
65 70 75 80
Arg Glu Tyr Gln Thr Arg Gln Asn Gln Cys Phe Tyr Asn Ser Ser Tyr
85 90 95
Leu Asn Val Gln Arg Glu Asn Gly Thr Val Ser Arg Tyr Glu Gly Gly
100 105 110
Arg Glu His Val Ala His Leu Leu Phe Leu Arg Asp Thr Lys Thr Leu
115 120 125
Met Phe Gly Ser Tyr Leu Asp Asp Glu Lys Asn Trp Gly Leu Ser Phe
130 135 140
Tyr Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr Lys Glu Gln Leu Gly Glu Phe Tyr
145 150 155 160
Glu Ala Leu Asp Cys Leu Cys Ile Pro Arg Ser Asp Val Met Tyr Thr
165 170 175
Asp Trp Lys Lys Asp Lys Cys Glu Pro Leu Glu Lys Gln His Glu Lys
180 185 190
Glu Arg Lys Gln Glu Glu Gly Glu Ser
195 200
<210> 4
<211> 606
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
atggcgctgt cctgggttct tacagtcctg agcctcctac ctctgctgga agcccagatc 60
ccattgtgtg ccaacctagt accggtgccc atcaccaacg ccaccctgga ccggatcact 120
ggcaagtggt tttatatcgc atcggccttt cgaaacgagg agtacaataa gtcggttcag 180
gagatccaag caaccttctt ttactttacc cccaacaaga cagaggacac gatctttctc 240
agagagtacc agacccgcca gaaccagtgc ttctataact ccagttacct gaatgtccag 300
cgggagaatg ggaccgtctc cagatacgag ggaggccgag aacatgttgc tcacctgctg 360
ttccttaggg acaccaagac cttgatgttt ggttcctacc tggacgatga gaagaactgg 420
gggctgtctt tctatgctga caagccagag acgaccaagg agcaactggg agagttctac 480
gaagctctcg actgcttgtg cattcccagg tcagatgtca tgtacaccga ctggaaaaag 540
gataagtgtg agccactgga gaagcagcac gagaaggaga ggaaacagga ggagggggaa 600
tcctag 606

Claims (3)

1.降低ORM2蛋白含量的物质或者抑制ORM2基因表达的物质在制备具有抑制肿瘤转移功能产品中的应用：
所述物质为如下1）或2）：
1）靶序列为ACCCTGAGCTGG的sgRNA；
2）含有所述sgRNA的重组载体或重组病毒；
所述肿瘤转移为肿瘤肝脏转移和/或肿瘤肺脏转移；
所述肿瘤为结直肠癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤肝脏转移为药物引发肿瘤肝脏转移。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物为引起肝损伤的药物。
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Non-Patent Citations (6)

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Title
Downregulation of orosomucoid 2 acts as a prognostic factor associated with cancer-promoting pathways in liver cancer;Han-Zhang Zhu 等;World Journal of Gastroenterology;第26卷(第8期);804-817 *
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张旭华 .iTRAQ定量蛋白质组学在结直肠癌患者血清中的应用研究.中国博士学位论文全文数据库.2012,(第12期),E072-107. *

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