CN109022461A - 一种PTEN基因的上游开放阅读框45aa-uORF核苷酸序列及其编码的多肽的应用 - Google Patents

一种PTEN基因的上游开放阅读框45aa-uORF核苷酸序列及其编码的多肽的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及PTEN(phosphatase and tensin homolog)基因的上游开放读码框(uORF,up–stream open reading frame)及其编码蛋白的应用。发明人发现了PTEN的5`UTR存在一个潜在的138个碱基的开放读码框(45aa‑uORF)，可以编码45个氨基酸的短肽(命名为PTEN‑45aa)，其在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用。本发明为与PTEN表达调控相关的疾病，尤其是神经胶质瘤提供了新的诊断、治疗方法和药物筛选平台。本发明还提供了一种多肽，用于PTEN表达调控相关的疾病治疗。

Description

一种PTEN基因的上游开放阅读框45aa-uORF核苷酸序列及其 编码的多肽的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及PTEN(phosphatase and tensin homolog)基因的上游开放读码框(uORF,up–stream open reading frame)及其编码蛋白的应用。
背景技术
中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的恶性肿瘤是人类所有肿瘤中预后最差的类型之一，造成了肿瘤中最高的潜在寿命损失(高达约20年)(Rouse et al.,2016)。其中以恶性胶质瘤(Malignant Glioma,MG)最为常见，每年发病率约为7.2/10万人(Sturm et al.,2014)。胶质瘤根据组织学形态分为WHO I-IV级，其中第IV级又被称为多形性胶质母细胞瘤(GBM)(Louis et al.,2016a)，占恶性胶质瘤的半数以上，预后极差，即使经过最及时有效的手术及放化疗之后病人生存期中位数仅为12.1-14.6个月，而仅仅3-5％的病人能存活超过3年(Krex et al.,2007)。由于目前的治疗手段仍然不能显著改善病人生存期，因而发现并阐明胶质瘤的发生发展机制成为了目前胶质瘤研究领域的重点内容。我们期待通过揭示胶质瘤的发生发展过程来为临床治疗提供新的思路，为有效治疗方案的开发奠定基础。
神经胶质瘤的具体发病机制目前虽仍然未知，但过去十年间有关胶质瘤的遗传学与表观遗传学研究方面取得了重大进展，为其病因学研究指明了方向。多项大型多平台研究发现数个突变基因和细胞信号传导通路的异常与恶性胶质瘤的发生发展有关(CancerGenome Atlas Research,2008；Ceccarelli et al.,2016；Parsons et al.,2008；Polivkaet al.,2016)。其中最为重要的遗传学与表观遗传学异常发生在以下信号传导通路中：1)Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog(KRAS)和Phosphoinositide 3-kinase(PI3K)致癌通路(占GBM的88％)；2)p53通路(占GBM的87％)；3)细胞周期调控通路(占GBM的78％)；以及4)新发现的若干代谢通路的改变，包括异柠檬酸脱氢酶1和2(IsocitrateDehydrogenase 1/2，IDH1/2)突变(占GBM的10％)。IDH1/2突变更成为一个GBM中重要的独立预后因子，在最新的CNS肿瘤WHO分型中被强烈推荐为胶质瘤临床治疗中的重要参考指标(Louis et al.,2016b；Polivka et al.,2014；Xia et al.,2015)。
同源性磷酸酶-张力蛋白(Phosphatase and Tensin homolog，PTEN)的编码基因PTEN位于染色体10q23.3，是人类多种肿瘤(如脑癌、乳腺癌、前列腺癌)中最常见的因为缺失或突变而下调的基因之一(Li et al.,1997)。作为一个抑癌基因，PTEN在调控细胞生长、侵袭、凋亡、DNA损伤修复以及肿瘤细胞放化疗抵抗力等方面发挥着重要的作用(Dean etal.,2005；Koul,2008；Mellinghoff et al.,2005；Ming and He,2012；Ortega-Molina andSerrano,2013)。PTEN表达的缺失被认为是胶质瘤发展中的早期事件，而PTEN突变发生在60％的GBM中，是其最常见的基因改变(Bianco et al.,2003；Srividya et al.,2011)。PTEN的主要功能是PI3K/Akt通路的负调控因子。与PI3K作用相反，PTEN通过去磷酸化将PIP3转变为PI-4,5-P2，通过降低Akt的活化而抑制下游所有由Akt调控的信号通路(Trotman et al.,2006)。过往研究显示，在胶质瘤中，PI3K/Akt通路的活化直接影响胶质瘤的恶性程度，并在GBM的发展恶化过程中起关键作用(Rodriguez et al.,2011；Sonodaet al.,2001)。尽管过往研究显示抑癌基因PTEN在胶质瘤中具备重要的调控作用，但具体机制依然不明确，因此发现PTEN在胶质瘤中的所有活性变异体并探索其抑癌机制对于揭示胶质瘤的发生发展过程具有重要的意义。
在传统概念中，“翻译”被限制于仅在编码蛋白的开放读码框(open readingframe,ORF)中，而随着高通量深度测序以及蛋白质谱分析技术的发展和进步，这一观念正在被新的研究成果改变。研究人员发现，在哺乳动物细胞中一些以往认为不能编码蛋白的区域存在很多小开放读码框(small open reading frame,smORF),可以编码100个氨基酸以下的多肽，并具备重要的生物学功能(Andrews and Rothnagel,2014；Chu et al.,2015；Slavoff et al.,2014)。这些区域包括编码基因mRNA的5’UTR非编码区uORF(upstreamORF)、3’UTR非编码区dORF(downstream ORF)，以及一些以往认为不能编码的ncRNA(non-coding RNA)。尽管smORF在其他物种的研究中已经取得了一定进展(Zanet et al.,2016)，目前smORF在人类癌症中的研究尚属空白。
2013年Science杂志报导了抑癌基因PTEN上游5’UTR非编码区存在一个以CTG为起始密码子进行翻译的加长PTEN蛋白PTEN-long，其比PTEN本体多出了173个氨基酸。和PTEN相同，PTEN-long也具有磷酸酶活性，且PTEN-long能由细胞分泌，再进入到其他细胞中发挥抑癌作用(Hopkins et al.,2013)。2014年，研究人员又发现PTEN-long在线粒体新陈代谢的过程中能诱导细胞色素C氧化酶的活性，从而诱导线粒体中ATP的产生(Liang et al.,2014)。早在2003年就有研究发现，单独将PTEN基因的5’UTR区转入肿瘤细胞后，细胞的增殖和周期均受到了显著的抑制和阻滞(Han et al.,2003)。由于当时的技术条件所限，研究人员认为这是由于PTEN 5’UTR区启动子的长度不同所造成的活性差异。
发明内容
本发明在人PTEN基因(NCBI号：NM_000314)的5`UTR区域发现一段开放138个碱基的开放读码框，命名为45aa-uORF，可以编码成45个氨基酸的短肽，我们命名为：PTEN-45aa(图1)。该微肽的分子量大约为5KD。所述的45aa-uORF具有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列；所述的PTEN-45aa具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了一种核酸片段45aa-uORF或其编码的多肽PTEN-45aa。
另一方面，本发明提供了PTEN基因的上游开放阅读框45aa-uORF核苷酸序列、或与其编码同等氨基酸序列的核苷酸序列、或其编码的多肽PTEN-45aa在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
另一方面，本发明还提供45aa-uORF或其编码的多肽PETN-45aa的检测试剂在制备用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂中的应用；优选地，所述的肿瘤诊断和/或预后判断的试剂包括：用于检测45aa-uORF的探针，或扩增45aa-uORF的引物，或者抗PTTN-45aa蛋白的抗体。
另一方面，本发明还提供了一种用于治疗或预防肿瘤的药物组合物，该药物组合物含有：45aa-uORF核苷酸序列、或与其编码同等氨基酸序列的核苷酸序列、或其编码的多肽PETN-45aa；任选地，所述的药物组合物还可以包括一种或多种药用赋形剂或药用载体，所述的载体如慢病毒等。
另一方面，本发明还提供了一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有：用于检测45aa-uORF的探针，或扩增45aa-uORF的引物，或者抗PTTN-45aa蛋白的抗体。
另一方面，本发明还提供了编码PTEN-45aa的表达载体，以及表达该载体的宿主细胞,以及他们用于肿瘤抑制/预防/治疗的用途。
另一方面，本发明还提供了一种通过化学合成，或者重组表达产生多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。经实验证实，无论是化学合成的多肽或者是重组表达产生的多肽，均具有抑制肿瘤的功能。所述的肿瘤为PTEN调控相关的肿瘤；所述的PTEN调控具体为：PTEN参与PI3K/Akt通路的调控；优选地，所述的肿瘤为胶质瘤；更优选地，为神经胶质瘤。
本发明中，其中所述的肿瘤为PTEN调控相关的肿瘤。
或者，所述的肿瘤为脑癌、乳腺癌、前列腺癌；更优选的，所述的肿瘤为神经胶质瘤。
PTEN基因是人类多种肿瘤(如脑癌、乳腺癌、前列腺癌等)中最常见的因为缺失或突变而下调的基因之一(Li et al.,1997)。作为一个抑癌基因，PTEN在调控细胞生长、侵袭、凋亡、DNA损伤修复以及肿瘤细胞放化疗抵抗力等方面发挥着重要的作用。而上游开放读码框(uORF,up-stream open reading frame)可以调控其下游基因表达。因此，可以推知，本发明中PTEN的uOFR(45aa-uORF)，及其编码的多肽(PTEN-45aa)，在与PTEN调控的相关疾病中，可能发生调控作用，从而发挥抑瘤作用。
其中，所述的PTEN调控具体为：PTEN参与PI3K/Akt通路的负调控。PTEN通过去磷酸化将PIP3转变为PI-4,5-P2，通过降低Akt的活化而抑制下游所有由Akt调控的信号通路(Trotman et al.,2006)。而在胶质瘤中，PI3K/Akt通路的活化直接影响胶质瘤的恶性程度，并在GBM的发展恶化过程中起关键作用(Rodriguez et al.,2011；Sonoda et al.,2001)。因此PTEN被认为是一种重要的通过消极地调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的肿瘤抑制剂。
一方面，通过制备PTEN-45aa特异性抗体，我们在293和U251细胞内检测识别了该uORF编码的微肽。同时还发现该微肽在正常脑胶质细胞中的表达量远高于脑胶质瘤细胞(图2)。
一方面，本发明根据45aa-uORF碱基序列设计慢病毒过表达载体，包装过表达慢病毒载体并感染U251神经胶质瘤细胞，筛选得到稳定过表达45aa-uORF编码微肽的胶质瘤细胞系，并验证其细胞生物学功能。在U251神经胶质瘤细胞中过表达45aa-uORF编码微肽可以明显抑制胶质瘤细胞U251的生长、增殖以及克隆形成等(图3)。
一方面，人工合成45aa-uORF编码微肽可以进入U251神经胶质瘤细胞并且能够明显抑制U251胶质瘤细胞的生长增殖(图4)。
一方面，本发明通过动物学实验体内验证45aa-uORF编码微肽的抗肿瘤能力。小鼠皮下接种200万U251神经胶质瘤细胞，三十天后用化学合成的45aa-uORF编码微肽(25ug/瘤子)处理移植瘤，隔天给药，发现与对照多肽(将45aa-uORF编码多肽序列随机打乱后合成对照多肽)相比化学合成45aa-uORF编码微肽可以明显抑制U251神经胶质瘤移植瘤的生长和形成，说明45aa-uORF编码微肽在动物水平也显示很好地抗肿瘤活性(图5)。
在本发明中，所述的“多肽”、“微肽”、“短肽”应当理解为具有同样的含义，用来表述氨基酸片段。
除了具有上述SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的多肽，其余现有技术中常规修饰本发明序列的多肽，也应当理解为具有本发明所述的肿瘤抑制作用。如多肽治疗剂可能具有短的循环半衰期和蛋白水解降解以及低溶解度。为了改善本发明的生物药物的药代动力学和药效动力学特性，可以实施诸如操纵氨基酸序列等方法以降低或提高免疫原性和降低蛋白水解裂解；可以将肽融合或偶联到免疫球蛋白和血清蛋白，诸如白蛋白；还可以并入到用于生物药物(诸如本发明的肽)和抗体的药物递送载体中以保护并减慢释放；并且还设想了偶联到天然或合成聚合物。具体地，对于合成聚合物偶联，还设想了聚乙二醇化或酰化，诸如N-酰化、S-酰化、酰胺化等。
如本文中所使用的，“药用赋形剂或药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将此种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则可以预期其在治疗组合物中的使用。补充活性成分也可以并入到该组合物中。将此种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则可以预期其在治疗组合物中的使用。补充活性成分也可以并入到该组合物中。
药物化合物可以以方便的方式给予，例如通过口服、静脉内(在水溶性的情况)、肌内、皮下、腹腔内、经鼻、皮内或栓剂途径或植入(例如，使用缓慢释放分子通过腹膜内途径或通过使用细胞或者慢病毒并继转移到接受者。根据给药途径，可能需要将活性组分包覆在材料中以保护其不受酶、酸和可能失活所述成分的其它天然条件的作用。
本发明的有益效果：
1.本发明首次发现了在PTEN的5’端存在上游小开放读码框(45aa-uORF)，可以编码45个氨基酸的短肽(PTTN-45aa)。制备PTTN-45aa的抗体发现45aa-uORF确实可以在胶质瘤细胞和正常脑胶质细胞中内源表达。同时检测多种胶质瘤样本和正常样本中45aa-uORF的表达量发现，与正常脑组织相比，胶质瘤组织样本中45aa-uORF的表达量明显减少。
2.更另人兴奋的是，无论是在体外实验，还是在活体动物实验身上；无论是重组表达的多肽(PTTN-45aa)，还是人工合成的多肽(PTTN-45aa)，均可以明显抑制胶质瘤细胞的生长和增殖。
3.本发明还提供了一种人工合成或者重组构建载体表达的多肽，该微肽的分子量特别小，可以很容易进入胶质瘤细胞和渗透到肿瘤组织，也能够很好的透过血脑屏障，治疗神经胶质瘤。
4.本发明基于新发现的上游开放读码框(45aa-uORF)，及其编码的微肽(PTTN-45aa)，可以为肿瘤治疗，尤其是神经胶质瘤的临床治疗或预防/提供一种新的多肽药物、新的思路和策略。
附图说明
图1显示了45aa-uORF在PTEN mRNA上位置示意图。
图2显示了45aa-uORF编码微肽的预测及内源表达鉴定；
A：45aa-uORF在PTEN mRNA上定位的示意图；
B：45aa-uORF编码微肽在不同物种中同源性分析；
C：45aa-uORF编码微肽特异性抗体western检测45aa-uORF在细胞内的内源性表达；
图3显示了45aa-uORF在胶质瘤细胞U251中作为抑癌多肽起作用；
A：过表达45aa-uORFU251细胞分别流式检测细胞周期；
B：对A的统计柱状图；其中，柱状图从上到下依次表示G2(DNA合成后期)，S(DNA合成期)，G1(DNA合成前期)；
C：检测CCK-8的OD值测生长曲线的变化；
D：平板克隆(CFA)和soft agar(SA)检测细胞的克隆形成能力；
E：对CFA和soft agar的定量。
图4显示了化学合成的45aa-uORF编码多肽能够进入U251细胞并明显抑制胶质瘤细胞生长；
A：45aa-peptide浓度：25μM；加入U251细胞，4小时后PBS洗掉多余多肽，免疫荧光检测多肽进细胞能力；
B：细胞继续培养72小时CCK-8检测细胞的活力。
图5显示了化学合成的45aa-uORF编码多肽可以明显抑制裸鼠U251皮下移植瘤的生长。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1 45aa-uORF编码微肽的内源表达与鉴定
通过ORF finder(http://www.bioinformatics.org/sms/orf_find.html)在PTENmRNA(NM_000314)第一个内含子区域的5`UTR发现一个138nt的开放读码框(Open ReadingFrame，ORF)，可以编码一个45个氨基酸的短肽，我们命名为：45aa-uORF，其编码的短肽命名为(PTTN-45aa)。通过蛋白质分子量预测软件http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html预测蛋白的分子量约为5KD。根据45aa-uORF的氨基酸序列设计特异识别该微肽并能用western blot方法检测的多克隆抗体。具体方法如下：通过化学合成多肽的方法，合成45aa-uORF其中一段MRDGGGRGPEPLSAC氨基酸序列作为免疫原，注射并免疫新西兰大白兔，然后纯化目的抗体用于检测细胞内的45aa-uORF编码微肽。CRISPR/Cas9在基因组上特异敲除45aa-uORF中间的一段，从基因组水平上沉默45aa-uORF微肽的表达，得到45aa-uORF敲除的293细胞系。用45aa-uORF特异性抗体通过western检测45aa微肽的内源表达及变化。
SEQ ID NO：1
homo-45aa-uORF(138nt)核苷酸序列
ATGAGAGACGGCGGCGGCCGCGGCCCGGAGCCCCTCTCAGCGCCTGTGAGCAGCCGCGGGGGCAGCGCCCTCGGGGAGCCGGCCGGCCTGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGTTTCTCGCCTCCTCTTCGTCTTTTCTAA
SEQ ID NO：2
homo-45aa-uORF编码的氨基酸序列(PTTN-45aa)
MRDGGGRGPEPLSAPVSSRGGSALGEPAGLRRRQRRRFSPPLRLF
详细方法：
1)CRISPR/Cas9敲除细胞系的建立
根据45aa-uORF的序列设计若干gRNA的序列分别靶向45aa-uORF的不同区域，特异性删除45aa-uORF的一段，获得基因组敲除45aa-uORF的细胞系。
具体的gRNA序列信息如下：
SEQ ID NO：3
45aa-cas9/gRNA-1：5`-AGCGCCUGUGAGCAGCCGCG-3`
SEQ ID NO：4
45aa-cas9/gRNA-2：5`-CAGGCCGGCCGGCUCCCCGA-3`
(克隆时加了g在5’-末端，以利于hU6启动子高效启动)
将pX330-Puro-PTEN-SgRNA质粒瞬时转染入HEK293T细胞，测序检测其效率，结果表明45aa-SgRNA2为高效率SgRNA，选择45aa-SgRNA2质粒进行后续实验，转染HEK293细胞，用puro霉素筛选然后挑选阳性克隆，DNA测序后，克隆子细胞中PTEN-45aa序列发生移码突变的克隆符合要求，获得基因组敲除45aa-uORF的细胞系。
2)细胞培养
HEK-293T细胞购于ATCC(CRL-11268TM)，培养于DMEM(Gibico，8113281)加10％的胎牛血清(FBS，Gibco,10099)、10U/mL的青霉素-链霉素(Gibco,15140-122)的培养基，并放置在一个5％CO2、37℃恒温湿润的细胞培养培养箱中培养。细胞每三天传代一次，传代比例1：4。
3)Western blot
用RAPA提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法对提取的蛋白进行定量；配置5％SDS-PAGE浓缩胶、15％SDS-PAGE分离胶，上样总蛋白为100微克；采用80V 20分钟、150V 1h跑蛋白电泳；转膜采用100V转膜2h；5％的脱脂牛奶封闭1h；45aa-uORF兔抗抗体(1:500)、β-actin抗体(abcam货号ab197345)(1:3000)；孵育4度过夜；第二天采用兔二抗(1:10000)常温孵育1h，TBST洗涤5遍每次5min，然后发光，显影，定影。
实验结果：
通过制备45aa-uORF特异性抗体，我们在检测识别了该uORF编码的微肽在细胞内的真实存在(图2)。同时还发现该微肽在正常脑胶质细胞中的表达量远高于脑胶质瘤细胞，提示该多肽可能具有抑癌功能(图2)。
实施例2 45aa-uORF微肽细胞生物学功能的确定
1)过表达45aa-uORF稳定细胞系的构建
合成过表达45aa-uORF-GFP的载体(载体骨架pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro)，与慢病毒骨架载体PSPAX2,PMD2G按照4：3：1比例转染到HEK-293T细胞中包装慢病毒。48小时和72小时候分别收取带慢病毒的培养基上清然后感染U251细胞(加8ug/ml polybrene增加感染效率)，puromycin(1mg/mL)筛选三天后撤掉嘌呤霉素，然后正常扩增细胞。细胞转染步骤：293T细胞50万个细胞接种于6孔板培养板中，24h细胞贴壁后可进行转染；转染前，将100微升无血清培养基DMEM和质粒制备成混合液；将100微升无血清培养基DMEM和5微升(2ug质粒/5uL lipo2000)liop2000脂质体均匀混合，做成脂质体混合液；将上述两种混合液等比例混合，室温放置20min；按照转染试剂操作说明书操作；最终6孔板中的孔终体积为1毫升，转染6小时候，换成正常培养基(10％胎牛血清加90％DMEM培养基加1％青霉素链霉素)1毫升，细胞培养条件37度，5％二氧化碳。
2)流式测定细胞周期
U251神经胶质瘤细胞和慢病毒过表达45aa-uORF细胞150万个细胞接种于T25培养瓶中，细胞贴壁后再培养24小时，培养于DMEM(Gibico，8113281)加10％的胎牛血清(FBS，Gibco,10099)、10U/mL的青霉素-链霉素(Gibco,15140-122)的培养基，并放置在一个5％CO2、37℃恒温湿润的细胞培养培养箱中培养。胰酶消化细胞离心后PBS洗一遍，再离心去上清，沉淀重悬于1mL的PBS中，然后逐滴加入3mL﹣20℃预冷的100％乙醇固定细胞30min，离心，PBS洗一遍后将沉淀重悬于25ug/mL的溴化丙啶(PI，sigma)/PBS溶液中，避光染色30min后上机检测细胞周期分布情况。
3)CCK-8检测细胞增殖
将U251-GFP对照细胞或者U251-45aa-uORF-GFP细胞以2000个每孔的数量接种于96孔板中，每个样品5个重复，贴壁后每24h加入每孔加入10μL CCK-8(Dojindo，CK04)试剂37℃培养1-4h后检测450λm的吸光度(OD)。吸光度值与细胞数目成正比。
4)平板克隆形成实验(CFA，clone formation assay)
将U251-GFP对照细胞或者U251-45aa-uORF-GFP细胞以2000个每孔的数量接种于六孔板，在一个5％CO2、37℃恒温湿润的细胞培养培养箱中连续培养两周后结晶紫染色后拍照，同时统计形成克隆的数目。至少三次重复实验。
5)软琼脂克隆形成实验(soft agar assay)
先在六孔板中加入2mL0.6％(在DMEM中配)的低熔点琼脂糖，凝固后再加入含有20000U251-GFP对照细胞或者U251-45aa-uORF-GFP细胞的2mL 0.35％(在DMEM中配)的低熔点琼脂糖，轻轻混匀然后在一个5％CO2、37℃恒温湿润的细胞培养培养箱中连续培养两周后光学显微镜下拍照并统计克隆形成数目。至少三次重复实验。
实验结果：
在U251神经胶质瘤细胞中，过表达45aa-uORF编码微肽可以明显抑制胶质瘤细胞U251的生长、增殖(图3)。
实施例3验证微肽进细胞的能力
将U251细胞以50％的密度接种于载玻片上，加不同浓度的连接有FITC荧光基团的PTEN-45aa微肽处理细胞(微肽以DMSO溶解，浓度为20μg/μL，)4h，然后福尔马林固定并与荧光显微镜下观察拍照。发现对于PTEN-45aa微肽而言,20μM浓度就能在4h内顺利进入U251细胞，并且视野内所有细胞都有荧光(图4)。
实施例4动物水平验证45aa-uORF微肽的抑癌功能
将U251细胞以200万每个点接种于裸鼠的左右侧。三十天后观察瘤子的形成，然后将瘤子按照大小平均分成对照组和实验组(每组五只裸鼠，十个瘤子)，对照组隔天打对照多肽，实验组隔天打45aa-uORF多肽。每个瘤子打25ug人工合成多肽。给药前测量瘤子的长径和短径，给药5-6次后处死裸鼠并取瘤子拍照和称重。
瘤子体积＝1/2*长径*短径的平方
实验结果如图5所示，对照多肽(将45aa-uORF编码多肽序列随机打乱后合成对照多肽)相比化学合成45aa-uORF编码微肽可以明显抑制U251神经胶质瘤移植瘤的生长和形成，说明45aa-uORF编码微肽在动物水平也显示很好地抗肿瘤活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第一医院
<120> 一种PTEN基因的上游开放阅读框45aa-uORF核苷酸序列及其编码的多肽的应
用
<130> PT20170439
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 138
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgagagacg gcggcggccg cggcccggag cccctctcag cgcctgtgag cagccgcggg 60
ggcagcgccc tcggggagcc ggccggcctg cggcggcggc agcggcggcg tttctcgcct 120
cctcttcgtc ttttctaa 138
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Arg Asp Gly Gly Gly Arg Gly Pro Glu Pro Leu Ser Ala Pro Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg Gly Gly Ser Ala Leu Gly Glu Pro Ala Gly Leu Arg Arg
20 25 30
Arg Gln Arg Arg Arg Phe Ser Pro Pro Leu Arg Leu Phe
35 40 45
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcgccugug agcagccgcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
caggccggcc ggcuccccga 20

Claims (10)

1.一种核酸片段45aa-uORF或其编码的多肽PTEN-45aa；
优选地，所述的45aa-uORF具有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列；所述的PTEN-45aa含有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。
2.PTEN基因的上游开放阅读框45aa-uORF核苷酸序列、或与其编码同等氨基酸序列的核苷酸序列、或其编码的多肽PTEN-45aa在制备治疗/预防肿瘤的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的45aa-uORF核苷酸序列如SEQ ID NO：1；所述的PTEN-45aa具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。
4.45aa-uORF或其编码的多肽PETN-45aa的检测试剂在制备用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂中的应用；
优选地，所述的45aa-uORF具有SEQ ID NO：1所述的核酸序列；所述的PTEN-45aa具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列；
优选地，所述的肿瘤诊断和/或预后判断的试剂包括：用于检测45aa-uORF的探针，或扩增45aa-uORF的引物，或者抗PTTN-45aa蛋白的抗体。
5.一种用于治疗/预防肿瘤的药物组合物，该药物组合物含有：45aa-uORF核苷酸序列、或与其编码同等氨基酸序列的核苷酸序列、或其编码的多肽PETN-45aa；
优选地，所述的45aa-uORF核苷酸序列如SEQ ID NO：1；所述的PTEN-45aa具有SEQ IDNO：2所述的氨基酸序列；
优选地，所述的药物组合物还含有一种或多种药用赋形剂或药用载体。
6.一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有：用于检测45aa-uORF的探针，或扩增45aa-uORF的引物，或者抗PTTN-45aa蛋白的抗体；
优选地，所述的45aa-uORF具有SEQ ID NO：1所述的核酸序列；所述的PTEN-45aa具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。
7.根据权利要求2-6任一所述的应用/药物组合物/试剂盒，其特征在于所述的肿瘤为：
a)PTEN调控相关的肿瘤；或者，
b)脑癌、乳腺癌或前列腺癌；
优选地，a)所述的PTEN调控具体为：PTEN参与PI3K/Akt通路的调控；
优选地，所述的肿瘤为神经胶质瘤。
8.编码权利要求1所述的PTEN-45aa的表达载体、或含有该表达载体的宿主细胞，在制备治疗/预防肿瘤的药物中的应用。
9.SEQ ID NO：2所示的多肽在制备治疗/预防肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述的肿瘤为PTEN调控相关的肿瘤；
优选地，所述的PTEN调控具体为：PTEN参与PI3K/Akt通路的调控；
优选地，所述的癌症为脑癌、乳腺癌、前列腺癌；
更优选的，所述的肿瘤为神经胶质瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的多肽通过化学合成；或者，所述的多肽通过重组表达产生。
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