CN111534592A - 一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法 - Google Patents

一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，通过考察m6A修饰相关基因在卵巢癌中的遗传学变异和表达改变，确定m6A阅读器YTHDF1为主要研究对象；进一步在卵巢癌细胞和小鼠模型中研究YTHDF1的功能；并通过综合运用多种高通量分析方法筛选和确定YTHDF1的靶基因；进一步探索以YTHDF1作为卵巢癌分子靶标的临床应用可行性。本发明将为阐明m6A与卵巢癌的关系，明确YTHDF1的致癌功能提供理论依据，并有可能为卵巢癌的临床诊治提供新的有效靶点。

Description

一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的 方法
技术领域
本发明涉及一种RNA表观遗传与妇科肿瘤，尤其涉及一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法。
背景技术
卵巢癌(ovarian cancer，OC)是一类来源于卵巢上皮细胞的生殖系统实体肿瘤。其临床表现隐匿、发展迅速、预后不佳，是妇科恶性肿瘤中导致女性死亡的主要原因。70％以上的卵巢癌患者发现时已为晚期。全球统计结果发现，每年大约20万卵巢癌新增病例，11.5万死亡病例，病死率高达60％。目前，临床治疗卵巢癌的主要手段是手术切除并联合以铂类为基础的化疗，但部分晚期患者尤其是复发患者往往对化疗药物产生耐药性，这也是卵巢癌复发和治疗失败的主要因素。近年来，卵巢癌的分子病因学研究虽取得一定进展，包括有部分的分子靶向治疗方法问世，但尚缺乏充分的临床证据表明其可行性和安全性；因此，卵巢癌发生发展的详细分子机制仍有待揭示。
RNA分子的修饰广泛存在于真核生物中，现已发现150余种不同的修饰方式。其中以RNA分子腺嘌呤的第6位氮原子上的甲基化修饰(N6-methyladenosine，m6A)最为常见，m6A于40年前在细菌的DNA中被发现，后续研究表明，其在从酵母、植物、果蝇到哺乳动物的真核生物RNA中具有广泛的保守性。通过对哺乳动物细胞RNA进行m6A测序(m6A-seq)发现m6A广泛存在于mRNA和多种非编码RNA分子中。m6A修饰广泛参与基因表达的转录后水平调控，并参与包括细胞分化和细胞重编程、生物钟调节、DNA损伤修复、细胞分化、增殖和凋亡等在内的多种生命活动中，是一类极为重要的RNA表观遗传修饰方式。近年来，关于m6A修饰相关蛋白的研究不断增多，目前常见的m6A修饰相关蛋白包括：METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、FTO、YTH家族等。这些蛋白通过调节m6A修饰参与多种分子生物学过程，包括RNA定位和稳定性、RNA结构、RNA剪接、primary-miRNA加工等等。
在人体内，m6A修饰主要由甲基转移酶复合体完成，该复合体由两种甲基化酶METTL3(Methyltransferase-like 3)和METTL14(Methyltransferase-like14)与另外一个调控因子WTAP(Wilm’s tumour 1associating protein)组成，随后，两种m6A去甲基化酶(FTO和ALKBH5)的发现，证实m6A甲基化修饰是可逆的，并有可能动态控制了mRNA的代谢过程。在人类和小鼠组织中揭示的m6A图谱(甲基化组)表明m6A常常富集在长外显子中及终止密码子附近，进一步提示其基础的调控作用。虽然，m6A的精确生物功能直到现在尚未完全明确，但越来越多的研究已证实其在多种生命活动中的重要性。例如：在酵母细胞中，不充分的甲基化会使其减数分裂过程受损。而在斑马鱼胚胎中，注射METTL3或者WTAP的反义寡核苷酸(MOs)则导致出现多种发育障碍现象，包括眼、大脑和心室等。当小鼠胚胎干细胞缺乏METTL3和METTL14后将失去自我更新能力。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)体内的甲基化复合体对卵子发生也是至关重要，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中使用抑制甲基化的试剂使胚的发育失败。
不仅如此，近年来科学家们逐渐发现m6A修饰与人类疾病的关系也颇为密切：低氧是肿瘤微环境的一个关键特征，乳腺癌的低氧条件通过m6A去甲基化(诱导ALKBH5表达)诱导乳腺癌干细胞表型。最近的研究同样发现m6A在恶性胶质瘤干性维持中的重要作用。M6A甲基化转移酶METTL3在肝癌中表达上调，可促进肝癌细胞的增殖和侵袭。M6A去甲基化酶FTO在含PML-RARA，MLL融合基因以及FLT3-ITD/NPM1-mut的AML亚型中表达升高，并通过调节mRNA m6A水平，促进PML-RARA和MLL融合基因型白血病的发展。同样作为m6A甲基化转移酶复合体的重要组分的METTL14在携带有t(11q23)，t(15；17)或者t(8；21)的AML亚型中有较高的表达水平，并且在AML的发展以及维持过程中必不可少。
以上研究表明m6A参与多种生理、病理过程的调控，但其与卵巢癌的关系还未见报道。目前，卵巢癌发生机制的研究多针对一些表观遗传修饰因子、转录因子、生长因子以及细胞信号传导蛋白展开。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，该方法将为阐明m6A与卵巢癌的关系，明确YTHDF1的致癌功能提供理论依据，并有可能为卵巢癌的临床诊治提供新的有效靶点。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，该方法包括如下步骤：
1)YTHDF1在卵巢癌组织及正常组织中的表达情况
研究YTHDF1在卵巢癌组织及正常卵巢组织中mRNA和蛋白水平的表达情况，推测YTHDF1在卵巢癌中的可能作用；
2)YTHDF1在卵巢癌中的功能研究
2.1)在多个卵巢癌细胞系中分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭，确定YTHDF1在卵巢癌细胞中的功能；
2.2)进行小鼠体内的功能实验，通过裸鼠皮下成瘤以及小鼠肝、肺转移实验研究YTHDF1的体内功能；
3)YTHDF1在卵巢癌中的作用机制研究
3.1)使用MeRIP-seq筛选在卵巢癌细胞中具有m6A修饰的mRNA分子；
3.2)使用RIP-seq筛选在卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA分子；
3.3)使用RNA-seq鉴定其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
3.4)使用polysome-profiling结合RNA-seq鉴定其翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
3.5)综合以上结果，初步确定YTHDF1所调控的靶mRNA分子，及其在卵巢癌中的功能；
4)YTHDF1作为预测卵巢癌分子靶标的研究
4.1)在大量卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达情况(组织芯片)，分析YTHDF1的表达水平与患者总体生存期以及无病进展生存期之间的相关性；
4.2)检测卵巢癌患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平(数字PCR)，发展通过检测血清或外泌体中YTHDF1 mRNA表达水平来预测卵巢癌患者的有效方法；
5)YTHDF1用于卵巢癌治疗的探索性研究
5.1)将卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下，并将皮下肿瘤组织原位移植于裸鼠卵巢建立卵巢癌动物模型；
5.2)在小鼠模型中注射靶向YTHDF1的siRNA，初步建立一套以YTHDF1为靶点的适用于卵巢癌的治疗新方法。
进一步，在步骤1)中，在卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达水平；
a)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，实时定量PCR检测其中YTHDF1的表达情况；
b)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，提取组织蛋白，进行Western Blot及免疫组化检测其中YTHDF1的表达情况。
进一步，步骤2.1)中，分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭等；
a)构建YTHDF1过表达载体与shRNA的重组慢病毒表达载体，与穿梭载体及病毒包装载体共转染293TN细胞，转染48h后离心收集病毒，并用PEG-it浓缩病毒颗粒。使用收获的重组病毒颗粒感染卵巢癌细胞，经流式分选获得稳定过表达和敲低YTHDF1的细胞株，用于后续功能检测；
b)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞增殖的影响：使用细胞计数和CCK8法检测细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线；
c)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞周期的影响：使用PI染色法检测细胞周期运行情况；
d)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞凋亡的影响：分别利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡情况，及TUNEL(TdT-mediated dUTP nick endlabeling)细胞凋亡检测试剂盒检测细胞中晚期凋亡情况；
e)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞运动及侵袭的影响：划痕法检测细胞迁移能力和Transwell法检测细胞侵袭能力。
进一步，步骤2.2)中，裸鼠皮下成瘤实验；
a)购买5～6周龄的雌性裸鼠在动物房适应2～3天后，卵巢癌细胞株用磷酸盐缓冲液(1×PBS)悬浮细胞并在免疫缺陷裸鼠后侧皮下注射处于对数生长期的卵巢癌细胞株(3×106细胞/只)，实时观察瘤块的生长的大小，在瘤块生长到50mm3左右时进行后续实验；
b)挑选瘤块大小基本一致的裸鼠16只，随机分为4组，每组4只，分别注射过表达重组病毒颗粒及其对照，和敲低重组病毒颗粒及其对照于皮下，每隔3～4天注射一次，一共注射6次；并在第一次注射后10天开始测量肿瘤大小，然后每隔3天测量一次，测量6次；
c)在第28天时处死裸鼠，取瘤块，测定瘤块重量，并进行相关分析；
d)获取瘤块后，去一部分做H&E染色及免疫组化。
进一步，在步骤2.2)中，小鼠尾静脉转移实验；
a)构建卵巢癌转移小鼠模型：5～6周龄的雌性NOD/SCID小鼠在购买后在动物房适应2～3天后，将小鼠进行亚致死剂量X射线照射(250cGy)，照射当天尾静脉注射5×106个处于对数生长期的卵巢癌细胞，饲养大概三十天后，解剖小鼠肝，肺出现明显的肿瘤转移，证明小鼠肝、肺转移模型构建成功；
b)将小鼠随机分成5组:未处理组、过表达重组病毒颗粒及其对照组，和敲低重组病毒颗粒及其对照组；其中未处理组注射100μl的EDTA-PBS，对照组注射1×107IFU的空载体病毒颗粒，过表达及敲低组则注射1×107IFU的过表达及敲低的YTHDF1病毒颗粒；注射15天后将小鼠处死，分别收集其肝脏和肺用于检测相关指标。
进一步，在步骤3)中，YTHDF1在卵巢癌中的作用机制研究；
a)使用MeRIP-seq筛选在卵巢癌细胞中具有m6A修饰的mRNA分子；
使用特异性识别m6A修饰的抗体，在卵巢癌细胞系A2780中进行MeRIP实验，IP得到的RNA样品，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，得到卵巢癌细胞中m6A的整体分布情况；
b)使用RIP-seq筛选在卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA分子；
使用特异性识别YTHDF1的抗体，进行RIP免疫共沉淀实验，将IP得到的RNA，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，得到卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA；
c)使用RNA-seq鉴定其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
提取稳定过表达和敲低YTHDF1的卵巢癌细胞株的总RNA，poly A富集后，用NEBKit进行建库，后进行二代RNA测序；通过生物信息学分析，如差异表达基因分析、GO、KEGG及GSEA等分析，筛选在转录组整体水平其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
d)使用polysome-profiling结合RNA-seq鉴定其翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
提取稳定过表达和敲低YTHDF1的卵巢癌细胞株的总RNA，通过蔗糖梯度离心，分别分离出与40s、60s、80s和polysome结合的RNA，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，通过比对plolysome组分中mRNA分布的差异，找出翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
e)综合以上结果，初步确定YTHDF1所调控的靶mRNA分子，及其在卵巢癌中的功能；
综合上述分析结果，结合实验验证，筛选出YTHDF1在卵巢癌细胞中可能调节的下游靶基因；对筛选出来的靶基因进行细胞功能实验，及功能“Rescue实验”，确定YTHDF1与靶基因的调控关系。
进一步，步骤4)中，YTHDF1作为预测卵巢癌分子靶标的研究；
4.1)扩大卵巢癌患者的病例数，调查YTHDF1的表达水平与患者总体生存期以及无疾病进展生存期之间的相关性；
a)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，实时定量PCR及组织芯片检测其中YTHDF1的表达情况；
b)根据YTHDF1表达水平将患者分为YTHDF1高表达或低表达两组，分别统计两组患者的总体生存期以及无疾病进展生存期，与YTHDF1表达水平进行相关性统计分析；
4.2)检测卵巢癌患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平，发展以血清或外泌体YTHDF1 mRNA表达水平预测卵巢癌的有效方法；
a)收集卵巢癌患者血清或外泌体标本，提取RNA，实时定量PCR检测YTHDF1mRNA的表达水平；
b)比较患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平与组织标本中YTHDF1表达水平的一致性；并分析血清或外泌体中YTHDF1 mRNA表达水平与患者总体生存期以及无疾病进展生存期的相关性。
进一步，步骤5)中，YTHDF1用于卵巢癌治疗的探索性研究；
5.1)建立卵巢癌小鼠模型；
a)将卵巢癌细胞细胞系A2780和SKOV3悬液分别接种于裸鼠腹腔；
b)于术后第6周处死，测量肿瘤体积，观察周围脏器侵袭及远处转移情况，确定卵巢癌模型建立成功；
5.2)在小鼠模型中实验注射靶向YTHDF1的siRNAs；
a)在上述卵巢癌小鼠模型中，经尾静脉注射靶向YTHDF1的siRNAs；
b)于治疗后第3周处死小鼠，检测YTHDF1表达情况，测量肿瘤体积，观察周围脏器侵袭及远处转移情况，判断治疗效果；初步建立一套以YTHDF1为靶点适用于卵巢癌的治疗运用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明在确定YTHDF1在卵巢癌发生发展中的表达及功能的基础上，进一步结合靶基因的确定和功能研究，探讨YTHDF1在卵巢癌发生发展中的具体分子机制；同时发展以YTHDF1表达为分子靶标预测卵巢癌发生，并实验通过外源干预YTHDF1表达改善卵巢癌发生发展的可行性。
2、本发明通过考察m6A修饰相关基因在卵巢癌中的遗传学变异和表达改变，确定m6A阅读器YTHDF1为主要研究对象；进一步在卵巢癌细胞和小鼠模型中研究YTHDF1的功能；并通过综合运用多种高通量分析方法筛选和确定YTHDF1的靶基因；进一步探索以YTHDF1作为卵巢癌分子靶标的临床应用可行性。本发明将为阐明m6A与卵巢癌的关系，明确YTHDF1的致癌功能提供理论依据，并有可能为卵巢癌的临床诊治提供新的有效靶点。
附图说明
图1为一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法的技术线路图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，首先确定YTHDF1在卵巢癌组织中的表达异常；进一步在卵巢癌细胞系、小鼠模型中研究YTHDF1参与卵巢癌发生发展的具体功能；通过MeRIP-seq结合RIP-seq、RNA-seq、polysome-profiling等方法确定YTHDF1调节的下游靶基因，阐明其作用机制；最后将上述研究结果在临床样本中进行验证，为临床诊治提供方向。技术线路如图1所示，该方法包括如下步骤：
1)YTHDF1在卵巢癌组织及正常组织中的表达情况
研究YTHDF1在卵巢癌组织及正常卵巢组织中mRNA和蛋白水平的表达情况，推测YTHDF1在卵巢癌中的可能作用。
2)YTHDF1在卵巢癌中的功能研究
2.1)在多个卵巢癌细胞系中分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭，确定YTHDF1在卵巢癌细胞中的功能。
2.2)进行小鼠体内的功能实验，通过裸鼠皮下成瘤以及小鼠肝、肺转移实验研究YTHDF1的体内功能。
3)YTHDF1在卵巢癌中的作用机制研究
3.1)使用MeRIP-seq筛选在卵巢癌细胞中具有m6A修饰的mRNA分子。
3.2)使用RIP-seq筛选在卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA分子。
3.3)使用RNA-seq鉴定其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子。
3.4)使用polysome-profiling结合RNA-seq鉴定其翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子。
3.5)综合以上结果，初步确定YTHDF1所调控的靶mRNA分子，及其在卵巢癌中的功能。
4)YTHDF1作为预测卵巢癌分子靶标的研究
4.1)在大量卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达情况(组织芯片)，分析YTHDF1的表达水平与患者总体生存期以及无病进展生存期之间的相关性。
4.2)检测卵巢癌患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平(数字PCR)，发展通过检测血清或外泌体中YTHDF1 mRNA表达水平来预测卵巢癌患者的有效方法。
5)YTHDF1用于卵巢癌治疗的探索性研究
5.1)将卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下，并将皮下肿瘤组织原位移植于裸鼠卵巢建立卵巢癌动物模型。
5.2)在小鼠模型中注射靶向YTHDF1的siRNA，初步建立一套以YTHDF1为靶点的适用于卵巢癌的治疗运用。
具体内容为：
在步骤1)中，YTHDF1在卵巢癌组织及正常组织中的表达情况
1.1)在卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达水平
a)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，实时定量PCR检测其中YTHDF1的表达情况。
b)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，提取组织蛋白，进行Western Blot及免疫组化检测其中YTHDF1的表达情况。
在步骤2)中，YTHDF1在卵巢癌中的功能研究
2.1)分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭等。
a)构建YTHDF1过表达载体与shRNA的重组慢病毒表达载体，与穿梭载体及病毒包装载体共转染293TN细胞，转染48h后离心收集病毒，并用PEG-it浓缩病毒颗粒。使用收获的重组病毒颗粒感染卵巢癌细胞，经流式分选获得稳定过表达和敲低YTHDF1的细胞株，用于后续功能检测。
b)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞增殖的影响：使用细胞计数和CCK8法检测细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线。
c)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞周期的影响：使用PI染色法检测细胞周期运行情况。
d)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞凋亡的影响：分别利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡情况，及TUNEL(TdT-mediated dUTP nick endlabeling)细胞凋亡检测试剂盒检测细胞中晚期凋亡情况。
e)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞运动及侵袭的影响：划痕法检测细胞迁移能力和Transwell法检测细胞侵袭能力。
在步骤2.2)中，裸鼠皮下成瘤实验
a)购买5～6周龄的雌性裸鼠在动物房适应2～3天后，卵巢癌细胞株用磷酸盐缓冲液(1×PBS)悬浮细胞并在免疫缺陷裸鼠后侧皮下注射处于对数生长期的卵巢癌细胞株(3×106细胞/只)，实时观察瘤块的生长的大小，在瘤块生长到50mm3左右时进行后续实验。
b)挑选瘤块大小基本一致的裸鼠16只，随机分为4组，每组4只，分别注射过表达重组病毒颗粒及其对照，和敲低重组病毒颗粒及其对照于皮下，每隔3～4天注射一次，一共注射6次。并在第一次注射后10天开始测量肿瘤大小，然后每隔3天测量一次，测量6次。
c)在第28天时处死裸鼠，取瘤块，测定瘤块重量，并进行相关分析。
d)获取瘤块后，去一部分做H&E染色及免疫组化。
在步骤2.2)中，小鼠尾静脉转移实验
a)构建卵巢癌转移小鼠模型：5～6周龄的雌性NOD/SCID小鼠在购买后在动物房适应2～3天后，将小鼠进行亚致死剂量X射线照射(250cGy)，照射当天尾静脉注射5×106个处于对数生长期的卵巢癌细胞，饲养大概三十天后，解剖小鼠肝、肺出现明显的肿瘤转移，证明小鼠肝、肺转移模型构建成功。
b)将小鼠随机分成5组:未处理组、过表达重组病毒颗粒及其对照组，和敲低重组病毒颗粒及其对照组。其中未处理组注射100μl的EDTA-PBS，对照组注射1×107IFU的空载体病毒颗粒，过表达及敲低组则注射1×107IFU的过表达及敲低的YTHDF1病毒颗粒。注射15天后将小鼠处死，分别收集其肝脏和肺用于检测相关指标。
在步骤3)中，YTHDF1在卵巢癌中的作用机制研究
3.1)使用MeRIP-seq筛选在卵巢癌细胞中具有m6A修饰的mRNA分子。
使用特异性识别m6A修饰的抗体，在卵巢癌细胞系A2780中进行MeRIP实验，IP得到的RNA样品，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，得到卵巢癌细胞中m6A的整体分布情况。
3.2)使用RIP-seq筛选在卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA分子。
使用特异性识别YTHDF1的抗体，进行RIP免疫共沉淀实验，将IP得到的RNA，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，得到卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA。
3.3)使用RNA-seq鉴定其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子。
提取稳定过表达和敲低YTHDF1的卵巢癌细胞株的总RNA，poly A富集后，用NEBKit进行建库，后进行二代RNA测序。通过生物信息学分析，如差异表达基因分析、GO、KEGG及GSEA等分析，筛选在转录组整体水平其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子。
3.4)使用polysome-profiling结合RNA-seq鉴定其翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子。
提取稳定过表达和敲低YTHDF1的卵巢癌细胞株的总RNA，通过蔗糖梯度离心，分别分离出与40s、60s、80s和polysome结合的RNA，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，通过比对plolysome组分中mRNA分布的差异，找出翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子。
3.5)综合以上结果，初步确定YTHDF1所调控的靶mRNA分子，及其在卵巢癌中的功能。
综合上述分析结果，结合实验验证，筛选出YTHDF1在卵巢癌细胞中可能调节的下游靶基因。对筛选出来的靶基因进行细胞功能实验，及功能“Rescue实验”，确定YTHDF1与靶基因的调控关系。
在步骤4)中，YTHDF1作为预测卵巢癌分子靶标的研究
4.1)扩大卵巢癌患者的病例数，调查YTHDF1的表达水平与患者总体生存期以及无疾病进展生存期之间的相关性。
a)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，实时定量PCR及组织芯片检测其中YTHDF1的表达情况。
b)根据YTHDF1表达水平将患者分为YTHDF1高表达或低表达两组，分别统计两组患者的总体生存期以及无疾病进展生存期，与YTHDF1表达水平进行相关性统计分析。
4.2)检测卵巢癌患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平，发展以血清或外泌体YTHDF1 mRNA表达水平预测卵巢癌的有效方法。
a)收集卵巢癌患者血清或外泌体标本，提取RNA，实时定量PCR检测YTHDF1mRNA的表达水平。
b)比较患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平与组织标本中YTHDF1表达水平的一致性。并分析血清或外泌体中YTHDF1 mRNA表达水平与患者总体生存期以及无疾病进展生存期的相关性。
在步骤5)中，YTHDF1用于卵巢癌治疗的探索性研究
5.1)建立卵巢癌小鼠模型。
a)将卵巢癌细胞细胞系A2780和SKOV3悬液分别接种于裸鼠腹腔。
b)于术后第6周处死，测量肿瘤体积，观察周围脏器侵袭及远处转移情况，确定卵巢癌模型建立成功。
5.2)在小鼠模型中实验注射靶向YTHDF1的siRNAs。
a)在上述卵巢癌小鼠模型中，经尾静脉注射靶向YTHDF1的siRNAs。
b)于治疗后第3周处死小鼠，检测YTHDF1表达情况，测量肿瘤体积，观察周围脏器侵袭及远处转移情况，判断治疗效果。初步建立一套以YTHDF1为靶点适用于卵巢癌的治疗运用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)YTHDF1在卵巢癌组织及正常组织中的表达情况
研究YTHDF1在卵巢癌组织及正常卵巢组织中mRNA和蛋白水平的表达情况，推测YTHDF1在卵巢癌中的可能作用；
2)YTHDF1在卵巢癌中的功能研究
2.1)在多个卵巢癌细胞系中分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭，确定YTHDF1在卵巢癌细胞中的功能；
2.2)进行小鼠体内的功能实验，通过裸鼠皮下成瘤以及小鼠肝、肺转移实验研究YTHDF1的体内功能；
3)YTHDF1在卵巢癌中的作用机制研究
3.1)使用MeRIP-seq筛选在卵巢癌细胞中具有m6A修饰的mRNA分子；
3.2)使用RIP-seq筛选在卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA分子；
3.3)使用RNA-seq鉴定其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
3.4)使用polysome-profiling结合RNA-seq鉴定其翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
3.5)综合以上结果，初步确定YTHDF1所调控的靶mRNA分子，及其在卵巢癌中的功能；
4)YTHDF1作为预测卵巢癌分子靶标的研究
4.1)在大量卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达情况，分析YTHDF1的表达水平与患者总体生存期以及无病进展生存期之间的相关性；
4.2)检测卵巢癌患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平，发展通过检测血清或外泌体中YTHDF1 mRNA表达水平来预测卵巢癌患者的有效方法；
5)YTHDF1用于卵巢癌治疗的探索性研究
5.1)将卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下，并将皮下肿瘤组织原位移植于裸鼠卵巢建立卵巢癌动物模型；
5.2)在小鼠模型中注射靶向YTHDF1的siRNA，初步建立一套以YTHDF1为靶点的适用于卵巢癌的运用。
2.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，在步骤1)中，在卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达水平；
a)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，实时定量PCR检测其中YTHDF1的表达情况；
b)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，提取组织蛋白，进行Western Blot及免疫组化检测其中YTHDF1的表达情况。
3.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，步骤2.1)中，分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭；
a)构建YTHDF1过表达载体与shRNA的重组慢病毒表达载体，与穿梭载体及病毒包装载体共转染293TN细胞，转染48h后离心收集病毒，并用PEG-it浓缩病毒颗粒；使用收获的重组病毒颗粒感染卵巢癌细胞，经流式分选获得稳定过表达和敲低YTHDF1的细胞株，用于后续功能检测；
b)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞增殖的影响；使用细胞计数和CCK8法检测细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线；
c)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞周期的影响；使用PI染色法检测细胞周期运行情况；
d)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞凋亡的影响；分别利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡情况，及TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测细胞中晚期凋亡情况；
e)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞运动及侵袭的影响；划痕法检测细胞迁移能力和Transwell法检测细胞侵袭能力。
4.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，步骤2.2)中，裸鼠皮下成瘤实验；
a)购买5～6周龄的雌性裸鼠在动物房适应2～3天后，卵巢癌细胞株用磷酸盐缓冲液(1×PBS)悬浮细胞并在免疫缺陷裸鼠后侧皮下注射处于对数生长期的卵巢癌细胞株(3×106细胞/只)，实时观察瘤块的生长的大小，在瘤块生长到50mm3左右时进行后续实验；
b)挑选瘤块大小基本一致的裸鼠16只，随机分为4组，每组4只，分别注射过表达重组病毒颗粒及其对照，和敲低重组病毒颗粒及其对照于皮下，每隔3～4天注射一次，一共注射6次；并在第一次注射后10天开始测量肿瘤大小，然后每隔3天测量一次，测量6次；
c)在第28天时处死裸鼠，取瘤块，测定瘤块重量，并进行相关分析；
d)获取瘤块后，去一部分做H&E染色及免疫组化。
5.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，在步骤2.2)中，小鼠尾静脉转移实验；
a)构建卵巢癌转移小鼠模型：5～6周龄的雌性NOD/SCID小鼠在购买后在动物房适应2～3天后，将小鼠进行亚致死剂量X射线照射，照射当天尾静脉注射5×106个处于对数生长期的卵巢癌细胞，饲养大概三十天后，解剖小鼠肝，肺出现明显的肿瘤转移，证明小鼠肝、肺转移模型构建成功；
b)将小鼠随机分成5组:未处理组、过表达重组病毒颗粒及其对照组，和敲低重组病毒颗粒及其对照组；其中未处理组注射100μl的EDTA-PBS，对照组注射1×107IFU的空载体病毒颗粒，过表达及敲低组则注射1×107IFU的过表达及敲低的YTHDF1病毒颗粒；注射15天后将小鼠处死，分别收集其肝脏和肺用于检测相关指标。
6.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，在步骤3)中，YTHDF1在卵巢癌中的作用机制研究；
a)使用MeRIP-seq筛选在卵巢癌细胞中具有m6A修饰的mRNA分子；
使用特异性识别m6A修饰的抗体，在卵巢癌细胞系A2780中进行MeRIP实验，IP得到的RNA样品，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，得到卵巢癌细胞中m6A的整体分布情况；
b)使用RIP-seq筛选在卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA分子；
使用特异性识别YTHDF1的抗体，进行RIP免疫共沉淀实验，将IP得到的RNA，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，得到卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA；
c)使用RNA-seq鉴定其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
提取稳定过表达和敲低YTHDF1的卵巢癌细胞株的总RNA，poly A富集后，用NEB Kit进行建库，后进行二代RNA测序；通过生物信息学分析，筛选在转录组整体水平其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
d)使用polysome-profiling结合RNA-seq鉴定其翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
提取稳定过表达和敲低YTHDF1的卵巢癌细胞株的总RNA，通过蔗糖梯度离心，分别分离出与40s、60s、80s和polysome结合的RNA，去除rRNA后，用于二代RNA测序分析，通过比对plolysome组分中mRNA分布的差异，找出翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子；
e)综合以上结果，初步确定YTHDF1所调控的靶mRNA分子，及其在卵巢癌中的功能；
综合上述分析结果，结合实验验证，筛选出YTHDF1在卵巢癌细胞中可能调节的下游靶基因；对筛选出来的靶基因进行细胞功能实验，及功能“Rescue实验”，确定YTHDF1与靶基因的调控关系。
7.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，步骤4)中，YTHDF1作为预测卵巢癌分子靶标的研究；
4.1)扩大卵巢癌患者的病例数，调查YTHDF1的表达水平与患者总体生存期以及无疾病进展生存期之间的相关性；
a)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，实时定量PCR及组织芯片检测其中YTHDF1的表达情况；
b)根据YTHDF1表达水平将患者分为YTHDF1高表达或低表达两组，分别统计两组患者的总体生存期以及无疾病进展生存期，与YTHDF1表达水平进行相关性统计分析；
4.2)检测卵巢癌患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平，发展以血清或外泌体YTHDF1 mRNA表达水平预测卵巢癌的有效方法；
a)收集卵巢癌患者血清或外泌体标本，提取RNA，实时定量PCR检测YTHDF1mRNA的表达水平；
b)比较患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平与组织标本中YTHDF1表达水平的一致性；并分析血清或外泌体中YTHDF1 mRNA表达水平与患者总体生存期以及无疾病进展生存期的相关性。
8.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，步骤5)中，YTHDF1用于卵巢癌治疗的探索性研究；
5.1)建立卵巢癌小鼠模型；
a)将卵巢癌细胞细胞系A2780和SKOV3悬液分别接种于裸鼠腹腔；
b)于术后第6周处死，测量肿瘤体积，观察周围脏器侵袭及远处转移情况，确定卵巢癌模型建立成功；
5.2)在小鼠模型中实验注射靶向YTHDF1的siRNAs；
a)在上述卵巢癌小鼠模型中，经尾静脉注射靶向YTHDF1的siRNAs；
b)于治疗后第3周处死小鼠，检测YTHDF1表达情况，测量肿瘤体积，观察周围脏器侵袭及远处转移情况，判断治疗效果；初步建立一套以YTHDF1为靶点适用于卵巢癌的治疗运用。
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