CN115011577A

CN115011577A - 昆虫m6A甲基化转移酶METTL3基因片段及其dsRNA和应用

Info

Publication number: CN115011577A
Application number: CN202210702177.0A
Authority: CN
Inventors: 杨美玲; 王慧敏; 周宇
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-06-21
Also published as: CN115011577B

Abstract

本发明提供一种昆虫m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段及其dsRNA和应用。先对昆虫的m⁶A甲基化转移酶基因进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO：1的编码m⁶A甲基化转移酶METTL3的核苷酸序列，然后选择序列为SEQ ID NO：2的基因片段，用于dsRNA的合成。将设计并合成的dsRNA注入昆虫体腔后，昆虫出现发育变缓及蜕皮困难死亡两种表型。本发明筛选获得的METTL3基因可作为昆虫防治的重要分子靶标，为安全、高效、环保的害虫防治方法的研制提供新的途径。

Description

昆虫m6A甲基化转移酶METTL3基因片段及其dsRNA和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段及其dsRNA和应用。

背景技术

害虫综合防治作为农业生产的一项重要策略，在农业可持续发展中具有重要作用。近年来，我国农业严重害虫种类不断增加，虫灾日益频繁，危害越来越严重。而目前，在害虫的防治工作中，仍以化学防治为主。随着各类化学杀虫剂的长期大量使用，昆虫逐渐产生较高的抗药性从而降低防治效率，进一步促使化学杀虫剂的过度使用，造成严重的环境污染，威胁人类的健康和破坏农业生态平衡。因此，开发安全、无毒、环境兼容性好的替代产品是目前亟待解决的关键问题之一。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA分子介导的同源RNA高效特异性降解的现象，2006年获得诺贝尔奖。RNAi技术由于其对靶标基因沉默的特异性和高效性，自一出现便显示出强大的应用潜力，不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。基于RNA干扰技术进行害虫防治具有如下特点：1)杀虫具有专一性，选择对害虫专一的基因进行干扰，对非靶标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解、无残留，对环境无毒无害，相对安全。

研究表明，RNA干扰技术不改变研究对象的基因组，目前已广泛用于有效控制特殊的植物害虫，在害虫防治领域具有重要的发展前景。而实现基于RNAi进行害虫有效控制的关键是筛选对昆虫高效致死的dsRNA。

m⁶A甲基化修饰是一种在自然界中广泛存在的RNA甲基化修饰类型，其作为表观遗传学研究的重要内容，承载着许多生物学功能。近几年的研究表明，在昆虫中，m⁶A甲基化修饰通过改变基因的表达方式，可以直接参与昆虫本身的生长发育、生理代谢和免疫等多种生物学过程。采用RNA干扰技术，开展m⁶A甲基化转移酶dsRNA在害虫防治中的应用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控昆虫蜕皮发育的m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段及其dsRNA和应用。

本发明提供的一种昆虫m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段1，其核苷酸序列是SEQID NO：1。获得方法包括以下步骤：基于昆虫的转录组数据库，采用生物信息学方法对昆虫m⁶A甲基化转移酶METTL3基因进行搜索，经过序列分析和比对后，获得编码m⁶A甲基化转移酶METTL3的核苷酸序列SEQ ID NO：1，设计上下游引物，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4，PCR扩增获得，命名为METTL3，其长度为1470bp，编码489个氨基酸。

本发明提供的一种昆虫m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2，其核苷酸序列是SEQID NO：2，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物序列SEQ ID NO：5和下游引物序列SEQ ID NO：6，通过PCR扩增获得。进一步通过相关试剂盒合成METTL3基因的dsRNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明提供的昆虫m⁶A甲基化转移酶METTL3基因的dsRNA，可以显著抑制昆虫m⁶A甲基化转移酶METTL3基因的表达，从而导致昆虫发育变缓，并且蜕皮困难死亡。

2、本发明提供的m⁶A甲基化转移酶METTL3基因的dsRNA用于害虫防治具有专一性和高效性，其仅对飞蝗有杀伤作用，不存在害虫产生抗药性导致防治效率降低的情况，并且其在自然界易降解、残留低，也不会破坏生态环境。

附图说明

图1：扩增本发明dsRNA的电泳图。

图2：本发明实施例试验中4龄第1天飞蝗若虫注射dsRNA后METTL3基因的表达量变化。β-actin为内参基因(左侧为注射dsGFP的对照组，右侧为注射dsRNA的实验组，**P<0.01)。

图3：本发明实施例试验中4龄第1天飞蝗若虫注射dsRNA后对飞蝗蜕皮发育影响的结果对照图(A图为干扰METTL3基因前后飞蝗由4龄蜕皮到5龄需要的天数；B图为干扰METTL3基因后飞蝗蜕皮困难死亡，上侧为注射dsGFP的对照组，下侧为注射dsRNA的实验组)。

图4：本发明实施例试验中4龄第1天飞蝗若虫注射dsRNA后对飞蝗生存曲线的影响。(“实线”为注射dsGFP的对照组，“虚线”为注射dsRNA的实验组)。

具体实施方式

实施例1：飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段1的获得

1)飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段1的获得

基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因进行搜索，经过序列分析和比对后，获得编码m⁶A甲基化转移酶METTL3的核苷酸序列。

2)采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4，所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

3)飞蝗总RNA的获得

选取大小一致雌雄各半飞蝗4龄若虫，在体式显微镜下将其表皮快速解剖下来，四头一组，六个生物学重复，冷冻于液氮中，提取RNA的具体操作步骤参照Invitrogen Trizol试剂盒。

4)飞蝗第一链cDNA的合成

利用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒去除基因组DNA，并进行反转录合成第一链cDNA。

5)PCR扩增

以上述第一链cDNA为模板，PCR扩增获得m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段1，克隆转化至大肠杆菌中，并送往华大生物科技有限公司测序，测序结果与转录组搜索结果比对，验证并获得编码该基因的核苷酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

实施例2：飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2的获得

根据实施例1获得的飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段1的核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性的引物，上游引物序列为SEQ ID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6，所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。以上述飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段1克隆载体质粒为模板，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为上下游引物，PCR扩增获得m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2，使用

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒进行纯化。

实施例3：飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2的dsRNA的获得

用实施例2获得的m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2，按照T7 RiboMAX^TM ExpressRNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA，得到的dsRNA用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其单一性，以绿色荧光蛋白基因GFP为对照，合成dsGFP，利用NanoDrop对dsRNA浓度、A260/280以及A260/230进行检测(图1)，并将dsRNA稀释至终浓度达到2.5μg/μl，保存于-80℃冰箱备用。

实施例4：飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因dsRNA致死飞蝗试验

1)飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因dsRNA注射

本发明选取大小均一、生长健康、雌雄各半4龄第1天飞蝗若虫作为实验对象。合成的dsRNA使用25μl规格微量注射器用于注射，顺着血液流动的方向，若虫侧腹部第2-3腹节的连接处作为注射点，注射时不可用力过大。注射剂量为5μg/头，并设置dsGFP(5μg)的对照组，实验组和对照组各25头。注射完毕后，将飞蝗若虫饲养在通风良好的15cm×15cm×13cm的塑料网状笼内，饲养条件为光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％，每天饲喂撒有麦麸的新鲜小麦幼苗。

2)飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因沉默效果检测

收集注射dsGFP和dsMETTL3的飞蝗若虫，每组5只，雌雄各半，实验组和对照组均取6个生物学重复。采用Trizol法提取总RNA，采用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser反转录获得第一链cDNA，利用Real-time PCR方法分别检测目的基因METTL3和管家基因β-actin的相对表达量，对其沉默效率进行计算。如图2所示，结果表明，与对照组比较，注射dsMETTL3后，实验组飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因表达显著降低，其沉默效率达到74.9％。

3)注射dsRNA后飞蝗表型的观察

如图3所示，四龄若虫注射dsRNA后，对照组在11天后全部成功蜕皮至成虫，且蜕皮后生长发育状况良好。而实验组注射dsMETTL3后，飞蝗发育变缓(图3A)，有4头无法成功蜕皮直至死亡，同时有19头若虫可以成功蜕皮至五龄期，其中有8头若虫最终不能完成蜕皮导致死亡，有11头若虫可以成功蜕皮至成虫，但在成虫第6天时全部死亡(图3B)。

4)注入dsRNA后飞蝗死亡情况的观察

如图4所示，注射dsRNA的飞蝗实验组死亡率为100％。这与注射dsGFP的对照组(死亡率为16.7％)相比，致死效果明显。

序列表

<110> 首都师范大学

<120> 昆虫m6A甲基化转移酶METTL3基因片段及其dsRNA和应用

<141> 2022-06-16

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 1

atgtcagatg catgggaaga gattcaagct ataagaagta aacggaatat tattcgagag 60

aaactgaaga aaagaaagaa agaacggcag gatatcctaa accagtctgc tgtgtctatt 120

gttactgatg ttacaccagt ctccctaccg aagacaaagg ctttatcgac tgaaggcagt 180

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aataaaagtg ttcctcatct tgctgtgaca aatcttttgc agaaatttgc aacacagcag 420

ttgataagtg tgaaagagaa cagcaaagat ggaaaaccag cactagatgt tgtttctgca 480

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ttagaacaac caacagagga agttaatcga aaaagaaaat gtgaggggga acttgaggga 600

gaacctgcac ccaaggctat aaagactgca gcctctgaca gagataagga tccaaaggct 660

gctgatatta tgtcacttct ctccatgcct tcaatacgtg aaaaggagaa taagaaagtt 720

ggagaagaaa ttttagatct cctcagcaag cctacagcaa aggagcgatc acttgctgag 780

agattccgtt cacagggagg tgctcaggtg atggagtttt gtccacatgg gacgaaggtt 840

gagtgcatga aggttaactc tgctgaagcc tgcaagaagc ttcatttcaa aaagatcatt 900

cagaaacaca cagatgaatc acttggagat tgctctttcc taaatacatg ctttcatatg 960

gatacatgca agtatgtgca ttatgaggta gatggcccta ctgtgcagtt tccaaaggaa 1020

gctggtagta aaatagaaag tgttgaatgc aaagcacttg gtcgatctca agaaatgact 1080

atattgtatc ctcctcagtg gattcaatgt gatcttagat atctggatat gacagtatta 1140

ggtaagtttg ctgtaataat ggctgatcct ccatgggaca ttcacatgga gttgccttat 1200

ggtacaatgt ctgatgatga gatgagacaa ttaggcattc caacattaca ggatgaagga 1260

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tggggctatg aacgtgttga tgaaataatt tgggtaaaaa caaatcaact gcagaggata 1380

atcaggacgg gtcgcactgg ccactggctc aaccatggaa aggaacactg tttattgcag 1440

ttatctcctt ctggtggcta cactatgtag 1470

<210> 2

<211> 488

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 2

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tcgctgctgc tgtcggtaaa cagcttaata aaagtgttcc tcatcttgct gtgacaaatc 120

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 3

atgtcagatg catgggaaga g 21

<210> 4

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<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 4

ctacatagtg tagccaccag a 21

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 5

taatacgact cactatagga actcctgctt cgttgctt 38

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> Locusta migratoria

<400> 6

taatacgact cactataggc tttgctgtag gcttgctg 38

Claims

1.一种飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段1，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2.一种飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2。

3.如权利要求2所述的一种飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2合成的dsRNA。

4.如权利要求3所述的一种飞蝗m⁶A甲基化转移酶METTL3基因片段2合成的dsRNA在害虫防治中的应用。