CN112662689B - 飞蝗Rab11A基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及飞蝗Rab11A基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取小GTP酶基因11A的片段，进一步进行克隆、测序后，得到飞蝗Rab11基因，序列为SEQ ID NO：1。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，该dsRNA其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，飞蝗在蜕皮时死亡，多次实验表明其致死率达到100％。由于本发明的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可为害虫防治提供新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种飞蝗Rab11A基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。
背景技术
飞蝗是我国传统农业害虫，由于迁飞性和杂食性等特点，一旦暴发蝗灾会对农业经济生产造成严重危害。使用化学杀虫剂防治蝗灾导致农药残留、环境污染、食品安全，长期使用还会使蝗虫产生明显的抗药性。因此，研发高效绿色环保的新型杀虫剂是解决目前现状的重要途径。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术，是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的特异性转录后基因沉默现象。该现象于1998年被Andrew Fire和CraigC.Mello两位科学家正式命名，并于2006年获得诺贝尔生理及医学奖。RNAi技术具有靶基因特异性、高效性以及易操作性等特点，已成为生命科学研究的热门技术，在基因功能的研究、基因治疗药物的开发及作物病虫害的防治等领域取得大量成果。采用RNA干扰技术研发新型生物杀虫剂具有如下优点：1)专一性强，对非靶标生物安全；2)绿色环保，对环境友好，双链RNA在自然环境中易降解，无残留；3)经济节约，生产成本低，防治效果持续性长。因此，国际学者已公认该技术为第四代新型杀虫剂的核心技术。基于RNA干扰进行害虫防治的关键是筛选靶标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。
Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一个亚家族成员，在动物细胞中主要定位于多种内膜系统如：再循环内体、高尔基体反面网状结构和质膜等。研究表明Rab11参与细胞内蛋白质及其受体的再循环、胞质分裂、机体免疫活动及细胞内信号传递等多种生命活动的进行，从而使生物体的各种活动能够正常有序的进行。沉默该靶标基因后昆虫的多种生命活动不能正常进行，导致其不能正常发育最终死亡。因此，本发明采用RNA干扰技术，针对Rab11A基因的dsRNA分子靶标相对安全，在飞蝗防治中具有重要作用。
发明内容
针对上述问题本发明首先提供了一种飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)，本发明还提供了基于LmRab11A基因全长序列合成的dsRNA及其在飞蝗防治中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)，其全长的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。该序列长2046bp，编码215个氨基酸。
本发明提供一种飞蝗Rab11A基因的获得方法，包括以下步骤：
步骤1，基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法搜索飞蝗Rab11A基因的序列；
步骤2，根据步骤1获得的序列，设计并合成其上、下游引物；
步骤3，提取飞蝗3龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，获得PCR扩增反应所需模板；
步骤4，利用步骤2的引物和步骤3的模板，通过PCR扩增反应获得飞蝗Rab11A基因。
进一步，所述步骤2中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。
本发明提供一种基于飞蝗Rab11A基因合成的dsRNA，该dsRNA其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供一种用于合成上述dsRNA的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，均含有T7启动子，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示。
本发明提供上述dsRNA的合成方法，包括以下步骤：根据飞蝗Rab11A基因设计如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的上、下游引物，以以LmRab11A全长质粒作为模板，PCR扩增后，扩增产物经试剂盒纯化，按照试剂盒说明体外转录合成dsRNA。
本发明提供上述dsRNA在飞蝗防治中的应用。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
采用RNA干扰技术研发新型生物杀虫剂具有如下优点：1)专一性强，对非靶标生物安全；2)绿色环保，对环境友好，双链RNA在自然环境中易降解，无残留；3)经济节约，生产成本低，防治效果持续性长。
本发明基于飞蝗小GTP酶基因11A合成的dsRNA对飞蝗具有高的特异性和致死率，飞蝗三龄若虫注射基于LmRab11A合成的dsRNA后，与对照组相比，处理组Rab11A基因表达显著降低，三龄若虫有20％的虫体不能正常发育到四龄，后续持续饲养观察发现100％的虫体不能发育到成虫，致死率达到100％；而对照组虫体在三龄第5天全部成功蜕皮至四龄若虫，且蜕皮后成虫发育状态良好，后续80％的虫体可以持续蜕皮发育直至成虫。由于本发明dsRNA的特异性及高效的致死率，对于飞蝗防治具有重要的现实意义，可为飞蝗防治提供新的途径。
附图说明
图1：三龄飞蝗注射dsRNA24h后对Rab11A基因的转录影响(dsEGFP为注射dsEGFP的对照组，dsLmRab11A为注射dsLmRab11的实验组)，EF1a为内参基因。其中*P<0.05。
图2：dsRNA对三龄飞蝗若虫生长发育的影响(dsEGFP为注射dsEGFP的对照组，dsLmRab11A为注射dsLmRab11A的实验组)。
具体实施方式
实施例1
飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)的序列及其dsRNA的获得
1、飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)序列的获得
1)飞蝗Rab11A基因的序列在飞蝗转录组数据库的搜索
基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗Rab11A基因的序列进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得1条飞蝗Rab11A基因的序列。
2)PCR扩增所需引物设计：
根据上述基因片段，并采用primer premier 5.0软件设计其上游引物和下游引物，引物序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
3)PCR扩增反应
提取飞蝗3龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶(TaKaRa)将所提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得PCR反应所需模板。
利用上述获得的模板和步骤2)设计的上下游引物，通过PCR扩增获得飞蝗Rab11A基因全长片段，通过Gel Extroaction Kit(Omega)将PCR产物进行纯化，将纯化后的产物克隆到pEASY-T3 Cloning vector(全式金公司)中，转入感受态细胞，扩大菌液培养，采用Plasmid Mini Kit(Omega)提取质粒检测后将菌液送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序得到飞蝗Rab11A基因全长的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2、飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)的dsRNA的合成
1)飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)的dsRNA的引物的设计
基于本研究所得到飞蝗Rab11A基因的全长核苷酸序列SEQ ID NO：1，采用primerpremier5.0软件设计用于合成其dsRNA的上、下游引物(含有T7启动子)，引物序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
SEQ ID NO：5：taatacgactcactatagggGGATCGTGTCACAGAAGCAA
SEQ ID NO：6：taatacgactcactatagggCGCAATTAGGAATGTCACCC
斜体部分为T7启动子
2)飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)的dsRNA的合成
利用实施例1中步骤3)测序正确的LmRab11A全长质粒作为模板，使用设计的用于合成dsRNA的上、下游引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行PCR扩增，PCR产物经GelExtraction Kit(Omega)试剂盒纯化后按照T7 RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明将上述PCR产物体外转录合成dsRNA。使用NaNoDrop 2000(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到3μg/μL。保存于-80℃超级低温冰箱备用。
PCR扩增体系：PCR Master Mix 25μl、上、下游引物各1μl、LmRab11A全长质粒模板(5ng/μl)2μl、PCR水21μl，
反应程序为：94℃5min，一个循环；94℃30sec，58℃30sec，72℃40sec35个循环；72℃10min。
实施例2
飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)的dsRNA致死飞蝗实验
1.特异性dsRNA注射
将2μl(6μg)上述实施例1合成的dsRNA用25μl规格微量注射器注射到3龄飞蝗第1日龄若虫二、三腹节之间，作为实验组，共注射39头，雌雄各半。对照组注射相同体积和浓度的dsEGFP。将注射后飞蝗置于30℃恒温培养室中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)，对照和处理组每天均饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。
2、飞蝗小GTP酶基因11A(LmRab11A)沉默检测
各收集9头注射dsEGFP(对照组)和dsLmRab11A(实验组)24h后的飞蝗，取若虫整虫进行总RNA提取，并反转录成第一链cDNA，采用Real-time PCR方法分别检测目的基因(LmRab11A)和管家基因(EF1a)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsRNA后，处理组LmRab11A基因表达显著降低(图1)。每组设置3个生物学重复，每个生物学重复3头若虫。
3、注射dsRNA后三龄若虫表型观察
三龄若虫注射dsLmRab1A1后，对照组虫体在三龄第5天全部成功蜕皮至四龄若虫，且蜕皮后成虫发育状态良好，后续80％的虫体可以持续蜕皮发育直至成虫。注射dsLmRab11A后，三龄若虫有20％的虫体不能正常发育到四龄，后续持续饲养观察发现100％的虫体不能发育到成虫，致死率达到100％(图2)。
序列表
SEQ ID NO：1
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SEQ ID NO：2
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SEQ ID NO：3
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SEQ ID NO：4
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SEQ ID NO：5
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SEQ ID NO：6
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序列表
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tgttggtgta cgacatagca aagcacctca catacgagaa tgtagagcgg tggctgagag 540
aacttcgtga ccatgctgac cagaatatag ttattatgct tgttggcaac aagtcggatt 600
taaggcactt gcgggcagtg ccgacagatg aagcaaagat gtttgctgaa cgcaacggcc 660
tttcctttat tgaaacatca gcacttgatt cgactaatgt tgaaactgcc ttccaaaaca 720
ttctgacaga gatctatcgg atcgtgtcac agaagcaaat aagagatcct cctgaaggag 780
acacgattcg gccccaaaat gtggaaccga ttgatgtgaa gccgacagtc aaccctgaca 840
gtgtgcgcaa gcaatgctgc cagtgaaaaa aatctaccgc atcgtttccc agaaacagat 900
cccagacagc cccgacgagg acaacactcc ctcgggcaac atgaagccga tccacgtgga 960
gccgacggac gagagcagtg cggcgggtgc gaagcgcgcc tgctgcactc cgtaggcgct 1020
ccgccggcgc ccaccccgga gcgcctccgt gtcgcgacac gagagcgcgg aggtgccgga 1080
cacttttggg gggagggggc cttgggatct acagtgctgg ggcagaaaac agcagccttc 1140
gtcgtcaggg tgacattcct aattgcgtag cgtatttcca ctttagccgc tcgtgtgccc 1200
gatgtccggc taggtggtct cgtaacttat ttatcgatgc acccgagtaa tttagaggtc 1260
tttctggttt tcattttaga tttactgtat tgttaaattt ctatttctgc agaaactact 1320
gatttttccc tttttttgtt tttattttta aaactgtgag taaagtgaac aaagttatgt 1380
tagtcgtatt atttactcgt acagttatag tttagattgg aaagagtaac agacaaactg 1440
acatttttag ttttacgtgt cattcactcc tttttcctct gttatcgtgt gatattaaaa 1500
taatagtagt cgcaaaaaaa aagaatatac ttcggcggaa tgaattgccg aacactactt 1560
tacacgtggg tcgaggaaat tgagaacgta tcggactttg aaaggtgaga gctttccaga 1620
ttacataaat ggttgtaaga ggtaatagtc taaataatac taaggcacgt aagttgtttg 1680
atgattgtaa attgagatga tgtgaattcc attttttaaa aagttattgt ggttgctaat 1740
agacttgggg gattggtgaa ctgtatgtcg agaaatgaca tttcggaggg gaggagagag 1800
acattaattt gctatttttt aagcttgggt ggtaccctgc aagtgccaga tggtgacatg 1860
acccagtgga ggagccgttc cccctagatg aggattttgt ttgcctggtg ccatgtactt 1920
tctgctgcaa atgcaccttg cactgctgtc ttgactcgtc tgtctcgccc gcgggtgact 1980
ggtcacccct gtggcactgg ttgctttact tgaagtgagc tgctttctca aacacctgtg 2040
ctgtgc 2046
<210> 2
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatcgtgtc acagaagcaa ataagagatc ctcctgaagg agacacgatt cggccccaaa 60
atgtggaacc gattgatgtg aagccgacag tcaaccctga cagtgtgcgc aagcaatgct 120
gccagtgaaa aaaatctacc gcatcgtttc ccagaaacag atcccagaca gccccgacga 180
ggacaacact ccctcgggca acatgaagcc gatccacgtg gagccgacgg acgagagcag 240
tgcggcgggt gcgaagcgcg cctgctgcac tccgtaggcg ctccgccggc gcccaccccg 300
gagcgcctcc gtgtcgcgac acgagagcgc ggaggtgccg gacacttttg gggggagggg 360
gccttgggat ctacagtgct ggggcagaaa acagcagcct tcgtcgtcag ggtgacattc 420
ctaattgcg 429
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggcagcca tattgcaata tt 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcacagcaca ggtgtttgag 20
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg ggatcgtgtc acagaagcaa 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg cgcaattagg aatgtcaccc 40
Claims (7)
1.一种飞蝗Rab11A基因，其特征在于：所述飞蝗Rab11A基因全长的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种权利要求1所述的飞蝗Rab11A基因的获得方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法搜索飞蝗Rab11A基因的序列；
步骤2，根据步骤1获得的序列，设计并合成其上、下游引物；
步骤3，提取飞蝗3龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，获得PCR扩增反应所需模板；
步骤4，利用步骤2的引物和步骤3的模板，通过PCR扩增反应获得飞蝗Rab11A基因。
3.根据权利要求2所述的一种飞蝗Rab11A基因的获得方法，其特征在于，所述步骤2中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
4.一种基于权利要求1所述的飞蝗Rab11A基因合成的dsRNA，其特征在于：所述dsRNA其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.一种用于合成权利要求4所述的dsRNA的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，均含有T7启动子，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示。
6.一种权利要求4所述的dsRNA的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：根据飞蝗Rab11A基因设计用于合成其dsRNA的上、下游引物，引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，以LmRab11A全长质粒作为模板，PCR扩增后，扩增产物经试剂盒纯化，按照试剂盒说明书体外转录合成dsRNA。
7.一种权利要求4所述的dsRNA在飞蝗防治中的应用。
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