CN112662690B - 飞蝗Rab5基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及飞蝗Rab5基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。本发明具体通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取飞蝗小GTP酶基因5的片段，进一步设计合成其对应的引物，进行PCR扩增，扩增产物测序后，得到飞蝗Rab5基因，序列如SEQ ID NO：1所示。进一步，依据SEQ ID NO：1，设计并合成相应的引物，PCR扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因片段，将该基因片段按照试剂盒说明书体外转录合成dsRNA，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，使飞蝗在蜕皮时死亡，多次实验表明其致死率达到100％。由于本发明dsRNA的特异性及高效的致死率，对于飞蝗防治具有重要的现实意义，可为飞蝗防治提供新的途径。

Description

飞蝗Rab5基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种飞蝗Rab5基因及其在飞蝗防治中的应用。

背景技术

飞蝗由于迁飞、繁殖能力强和食性杂等特点导致其分布范围极广，蝗灾一旦暴发会对粮食生产造成严重危害。目前对于蝗灾的防治主要是化学杀虫剂，长期使用化学杀虫剂带来了蝗虫抗药性的产生、农药残留、食品安全隐患以及环境污染等多方面的问题。因此，研发绿色环保有效的新型生物杀虫剂迫在眉睫。

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的特异性转录后基因沉默现象，这一现象在1998年被Andrew Fire和Craig C.Mello两位科学家正式命名，并于2006年获得诺贝尔生理及医学奖。由于该技术对靶基因的高效性、特异性及易操作性等特点，已经在基因功能研究、基因治疗药物的开发及作物病虫害的防治方面展示了广阔的应用前景。采用RNA干扰技术进行害虫防治具有如下优点：1)杀虫专一性强，对非靶标生物无杀伤作用；2)绿色环保性，RNA在自然界极易降解，无残留。因此，学者将其称为第四代新型杀虫剂的核心技术。基于RNA干扰进行害虫防治的关键是筛选靶标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。

生物体为保证细胞各种功能的有序进行，一些关键的功能蛋白需要被准确的招集到细胞特定的位置来发挥作用，研究表明小GTP酶Rab5在这一过程中发挥着重要作用。Rab5是细胞内各种膜组分(membrane component)运输的关键调节因子，主要参与质膜和早期内含体之间物质的运输。在无活性的GDP结合形式和有活性的GTP结合形式之间循环，不同状态的Rab5可以募集不同的下游效应物。越来越多的研究表明，Rab5在调控细胞自噬、线粒体稳态维持、染色质排列整合等具有重要作用。沉默该靶标基因后昆虫生命活动不能正常进行，导致其不能正常发育最终死亡。

发明内容

针对上述问题本发明首先提供了一种飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)，本发明还提供了基于LmRab5基因全长序列合成的dsRNA及其在飞蝗防治中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明提供一种飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)，其全长的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该序列长1130bp，包含645bp开放阅读框，编码214个氨基酸。

本发明提供一种飞蝗Rab5基因的获得方法，包括以下步骤：

步骤1，基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法搜索飞蝗Rab5基因的序列；

步骤2，根据步骤1获得的序列，设计并合成其上、下游引物；

步骤3，提取飞蝗3龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，获得PCR扩增反应所需模板；

步骤4，利用步骤2的引物和步骤3的模板，通过PCR扩增反应获得飞蝗Rab5基因。

进一步，所述步骤2中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。

本发明提供一种基于飞蝗Rab5基因合成的dsRNA，该dsRNA其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供一种用于合成上述dsRNA的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，均含有T7启动子，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示。

本发明提供上述dsRNA的合成方法，包括以下步骤：根据飞蝗Rab5基因设计如SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示的上、下游引物，以测序正确的LmRab5全长质粒作为模板，，PCR扩增后，扩增产物经试剂盒纯化，按照试剂盒说明体外转录合成dsRNA。

本发明提供上述dsRNA在飞蝗防治中的应用。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

采用RNA干扰技术进行害虫防治具有如下优点：1)杀虫专一性强，对非靶标生物无杀伤作用；2)绿色环保性，RNA在自然界极易降解，无残留。

本发明基于飞蝗小GTP酶基因5合成的dsRNA对飞蝗具有高的特异性和致死率，飞蝗三龄若虫注射基于LmRab5合成的dsRNA后，处理组Rab5基因表达显著降低，飞蝗在蜕皮时死亡，三龄若虫不能正常蜕皮出现死亡表型，多次实验表明其致死率达到100％，同时发现注射dsLmRab5基因的飞蝗排泄物为粉红色，进一步解剖发现虫体肠道出现萎缩。由于本发明dsRNA的特异性及高效的致死率，对于飞蝗防治具有重要的现实意义，可为飞蝗防治提供新的途径。

附图说明

图1：三龄飞蝗注射dsRNA 24h后对Rab5基因的转录影响(dsEGFP为注射dsEGFP的对照组，dsLmRab5为注射dsLmRab5的实验组)，EF1a为内参基因，其中*P<0.05。

图2：dsRNA对三龄飞蝗若虫生长发育的影响(dsEGFP为注射dsEGFP的对照组，dsLmRab5为注射dsLmRab5的实验组)。

具体实施方式

下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1

飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)的序列及其dsRNA的获得

1、飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)序列的获得

1)飞蝗Rab5基因的序列在飞蝗转录组数据库的搜索

基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗Rab5基因的序列进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得1条飞蝗Rab5基因的序列。

2)PCR扩增所需引物设计：

根据上述基因片段，并采用primer premier 5.0软件设计其上游引物和下游引物，引物序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

3)PCR扩增反应

提取飞蝗3龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶(TaKaRa)将所提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得PCR反应所需模板。

利用上述获得的模板和步骤2)设计的上下游引物，通过PCR扩增获得飞蝗Rab5基因全长片段，通过Gel Extroaction Kit(Omega)将PCR产物进行纯化，将纯化后的产物克隆到pEASY-T3 Cloning vector(全式金公司)中，转入感受态细胞，扩大菌液培养，采用Plasmid Mini Kit(Omega)提取质粒检测后将菌液送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序得到飞蝗Rab5基因全长的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2、飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)的dsRNA的合成

1)飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)的dsRNA的引物的设计

基于本研究所得到飞蝗Rab5基因的全长核苷酸序列SEQ ID NO：1，采用primerpremier5.0软件设计用于合成其dsRNA的上、下游引物(含有T7启动子)，引物序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

SEQ ID NO：5：taatacgactcactatagggCCAGAGACAAGCATCACCAA

SEQ ID NO：6：taatacgactcactatagggCCTGACTGCCAGGAATGTTT

斜体部分为T7启动子

2)飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)的dsRNA的合成

利用实施例1中步骤3)测序正确的LmRab5全长质粒作为模板，使用设计的用于合成dsRNA的上、下游引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行PCR扩增，PCR产物经GelExtraction Kit(Omega)试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明将上述PCR产物体外转录合成dsRNA。使用NaNoDrop 2000(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到3μg/μL。保存于-80℃超级低温冰箱备用。

PCR扩增体系：PCR Master Mix 25μl、上、下游引物分别为1μl、LmRab5全长质粒模板(5ng/μl)2μl、PCR水21μl，

反应程序为：94℃5min，一个循环；94℃30sec，58℃30sec，72℃40sec35个循环；72℃10min。

实施例2

飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)的dsRNA致死飞蝗实验

1.特异性dsRNA注射

将2μl(6μg)上述实施例1合成的dsRNA用10μl规格微量注射器注射到3龄飞蝗第2日龄若虫二、三腹节之间，作为实验组，共注射36头，雌雄各半。对照组注射相同体积和浓度的dsEGFP。将注射后飞蝗置于30℃恒温培养室中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)，对照和处理组每天均饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。

2、飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)沉默检测

各收集6头注射dsEGFP(对照组)和dsLmRab5(实验组)24h后的飞蝗，取若虫整虫进行总RNA提取，并反转录成第一链cDNA，采用Real-time PCR方法分别检测目的基因(LmRab5)和管家基因(EF1a)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsRNA后，处理组LmRab5基因表达显著降低(图1)。每组设置3个生物学重复，每个生物学重复2头若虫。

3、注射dsRNA后三龄若虫表型观察

三龄若虫注射dsLmRab5后，对照组虫体在三龄第5天有86.7％的虫体成功蜕皮至四龄若虫，且蜕皮后成虫发育状态良好，后续可以持续蜕皮发育直至成虫。注射dsLmRab5后，三龄若虫不能正常蜕皮出现死亡表型，致死率达到100％；同时发现注射dsLmRab5基因的飞蝗排泄物为粉红色，进一步解剖发现虫体肠道出现萎缩(图2)。

序列表

SEQ ID NO：1

Gatgctgaaaggtgtgatagggccgcaagaaagtcgcccatgctcaaccatatattcagcagtcgtagtggctaattagttgtcggttctgaagtttgttttgcccttccattgcgtggctcttgcatctacgtcttatagtgtattaaaatcgattactggacattgtgtgtagtttgaaagggctttgtcatggccagtcgcggtggggcccagaggccaaatggatcaacacaaggaaaggtttgccagtttaaacttgttctgcttggtgaatctgccgtaggcaaatcaagtttagtcctcaggtttgttaaagggcagttccacgaataccaagaaagcacaatcggagctgcatttctaacacagaccgtttgtctggaagacacaactgtaaaatttgagatttgggatacagctggtcaagagagataccacagtttagcaccaatgtattacagaggtgcgcaagctgcaattgttgtgtacgatataacaaatcaggatacatttgcaagagccaaaacgtgggtgaaagaactccagagacaagcatcaccaaacattgtgattgctttagctgggaataagtctgatcttgctaacaagagagtggtagagcacgatgatgcgcagggctacgcagaagaaaatggccttctgttcatggaaacatctgctaagactgcaatgaatgtgaatgaaatcttcctggctattgccaagaaacttccaaagaatgaacaagtaacaggtgcaggcactagtggacaaggacgcagacttgtagagtcagaagggcaacagaaagcacctggaaattgctgcaagtgatccaccccaccagtcacttacagtttttcatcttattcaagtcaagtttgttccattattagctgggaggtggttgtccaactggcttctctctaaaccagtctggtcatctggcatttctgtggctggaaacattcctggcagtcaggacagagaaccttcacaagtggaaaggactcctattatgaattgattcccataaaaaataaacattggcagttataggtaatgtggaagtgtgtttgtaagaatatgctcttctcaaagcactgaacataaacgaacagtcacaa

SEQ ID NO：2

ccagagacaagcatcaccaaacattgtgattgctttagctgggaataagtctgatcttgctaacaagagagtggtagagcacgatgatgcgcagggctacgcagaagaaaatggccttctgttcatggaaacatctgctaagactgcaatgaatgtgaatgaaatcttcctggctattgccaagaaacttccaaagaatgaacaagtaacaggtgcaggcactagtggacaaggacgcagacttgtagagtcagaagggcaacagaaagcacctggaaattgctgcaagtgatccaccccaccagtcacttacagtttttcatcttattcaagtcaagtttgttccattattagctgggaggtggttgtccaactggcttctctctaaaccagtctggtcatctggcatttctgtggctggaaacattcctggcagtcagg

SEQ ID NO：3

gatgctgaaaggtgtgataggg

SEQ ID NO：4

ttgtgactgttcgtttatgttcag

SEQ ID NO：5

taatacgactcactatagggccagagacaagcatcaccaaSEQ ID NO：6

taatacgactcactatagggcctgactgccaggaatgttt

序列表

<110> 山西大学

<120> 飞蝗Rab5基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgctgaaa ggtgtgatag ggccgcaaga aagtcgccca tgctcaacca tatattcagc 60

agtcgtagtg gctaattagt tgtcggttct gaagtttgtt ttgcccttcc attgcgtggc 120

tcttgcatct acgtcttata gtgtattaaa atcgattact ggacattgtg tgtagtttga 180

aagggctttg tcatggccag tcgcggtggg gcccagaggc caaatggatc aacacaagga 240

aaggtttgcc agtttaaact tgttctgctt ggtgaatctg ccgtaggcaa atcaagttta 300

gtcctcaggt ttgttaaagg gcagttccac gaataccaag aaagcacaat cggagctgca 360

tttctaacac agaccgtttg tctggaagac acaactgtaa aatttgagat ttgggataca 420

gctggtcaag agagatacca cagtttagca ccaatgtatt acagaggtgc gcaagctgca 480

attgttgtgt acgatataac aaatcaggat acatttgcaa gagccaaaac gtgggtgaaa 540

gaactccaga gacaagcatc accaaacatt gtgattgctt tagctgggaa taagtctgat 600

cttgctaaca agagagtggt agagcacgat gatgcgcagg gctacgcaga agaaaatggc 660

cttctgttca tggaaacatc tgctaagact gcaatgaatg tgaatgaaat cttcctggct 720

attgccaaga aacttccaaa gaatgaacaa gtaacaggtg caggcactag tggacaagga 780

cgcagacttg tagagtcaga agggcaacag aaagcacctg gaaattgctg caagtgatcc 840

accccaccag tcacttacag tttttcatct tattcaagtc aagtttgttc cattattagc 900

tgggaggtgg ttgtccaact ggcttctctc taaaccagtc tggtcatctg gcatttctgt 960

ggctggaaac attcctggca gtcaggacag agaaccttca caagtggaaa ggactcctat 1020

tatgaattga ttcccataaa aaataaacat tggcagttat aggtaatgtg gaagtgtgtt 1080

tgtaagaata tgctcttctc aaagcactga acataaacga acagtcacaa 1130

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagagacaa gcatcaccaa acattgtgat tgctttagct gggaataagt ctgatcttgc 60

taacaagaga gtggtagagc acgatgatgc gcagggctac gcagaagaaa atggccttct 120

gttcatggaa acatctgcta agactgcaat gaatgtgaat gaaatcttcc tggctattgc 180

caagaaactt ccaaagaatg aacaagtaac aggtgcaggc actagtggac aaggacgcag 240

acttgtagag tcagaagggc aacagaaagc acctggaaat tgctgcaagt gatccacccc 300

accagtcact tacagttttt catcttattc aagtcaagtt tgttccatta ttagctggga 360

ggtggttgtc caactggctt ctctctaaac cagtctggtc atctggcatt tctgtggctg 420

gaaacattcc tggcagtcag g 441

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgctgaaa ggtgtgatag gg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtgactgt tcgtttatgt tcag 24

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg ccagagacaa gcatcaccaa 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg cctgactgcc aggaatgttt 40

Claims (7)

1.一种飞蝗Rab5基因，其特征在于：所述飞蝗Rab5基因全长的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种权利要求1所述的飞蝗Rab5基因的获得方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法搜索飞蝗Rab5基因的序列；

步骤2，根据步骤1获得的序列，设计并合成其上、下游引物；

步骤3，提取飞蝗3龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，获得PCR扩增反应所需模板；

步骤4，利用步骤2的引物和步骤3的模板，通过PCR扩增反应获得飞蝗Rab5基因。

3.根据权利要求2所述的一种飞蝗Rab5基因的获得方法，其特征在于，所述步骤2中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

4.一种基于权利要求1所述的飞蝗Rab5基因合成的dsRNA，其特征在于：所述dsRNA其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种用于合成权利要求4所述的dsRNA的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，均含有T7启动子，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示。

6.一种权利要求4所述的dsRNA的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：根据飞蝗Rab5基因设计用于合成dsRNA的上、下游引物，引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，以测序正确的LmRab5全长质粒作为模板，PCR扩增后，扩增产物经试剂盒纯化，按照试剂盒说明书体外转录合成dsRNA。

7.一种权利要求4所述的dsRNA在飞蝗防治中的应用。

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