CN112391389B - 飞蝗C型清道夫受体基因及其靶向dsRNA与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及飞蝗C型清道夫受体基因及其靶向dsRNA与应用。本发明提供一种昆虫特有的C型清道夫受体基因全长序列及其在保护dsRNA中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取C型清道夫受体基因片段，进一步调取获得序列为SEQ ID NO：1基因全长。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，该基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示序列，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，导致飞蝗血细胞对外源dsRNA的吞噬能力显著降低，对靶基因的沉默效率显著提高。由于本发明C型清道夫受体基因仅节肢动物昆虫特有，哺乳动物等高等生物并不存在，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。

Description

飞蝗C型清道夫受体基因及其靶向dsRNA与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及飞蝗C型清道夫受体基因及其靶向 dsRNA的合成及其在保护dsRNA中的应用。
背景技术
飞蝗是一种重要的农业害虫，主要分布于我国河北、山东、江苏、广西等省份，因其取食性广，繁殖力强，迁飞能力强，对农业生产造成严重危害。大量使用化学杀虫剂防治蝗虫造成了长期的农药选择压力。一方面，导致飞蝗抗药性增加，防治成本增高；另一方面，导致环境污染和农药残留，引发食品安全隐患。随着人民生活水平的提高，科学技术的进步，研发新型害虫防治方法迫在眉睫。
RNA干扰(RNAi)技术可靶向沉默目标基因，造成目标基因功能缺失，该技术为临床疾病治疗和作物害虫防治提供了新方向。由于该技术对靶基因的高效性、特异性及易操作性等特点，目前在害虫防治等领域具有潜在的应用价值。通过RNA干扰进行害虫防治具有如下优点：1)专一性，选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等生物和人类安全；2)环保性，对环境无害，RNA在自然界极易降解，无残留；3)经济性，生产成本低，应用广泛。因此，利用RNA干扰技术开发生物农药是完全可行性的，目前，已作为第四代新型生物农药dsRNA 杀虫剂在美国上市。
然而，由于昆虫拥有天然免疫系统，保护自身免受外界病原体侵染，因此大大降低dsRNA作为新型生物农药的应用步伐。清道夫受体基因作为昆虫免疫系统第一道防控开关，发挥吞噬和清除外源病原体的功能，在昆虫免疫系统中起着重要作用。C型清道夫受体基因在昆虫体内特异表达，在高等生物及哺乳动物中并不存在，因此，本发明采用RNA干扰技术，特异沉默C型清道夫受体基因，使新型生物农药dsRNA杀虫剂免受被吞噬和降解的命运，大大提升dsRNA 的基因沉默效率，用最低剂量的dsRNA杀虫剂达到高效的杀虫效果，大幅提高经济成本，在飞蝗防治中具有重要作用。
发明内容
针对上述问题本发明首先提供了飞蝗C型清道夫受体基因，然后根据飞蝗 C型清道夫受体基因设计并合成其对应的靶向dsRNA，将该靶向dsRNA注射进飞蝗体腔内后，飞蝗C型清道夫受体基因在mRNA水平的表达显著降低，进而飞蝗吞噬外源dsRNA的能力显著减弱。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供了飞蝗C型清道夫受体基因全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。
上述飞蝗C型清道夫受体基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。该氨基酸序列是对SEQ ID NO：1进行生物信息学分析后预测得到。生物信息学分析表明飞蝗C型清道夫受体基因编码763个氨基酸，分子量为82.5KD，理论等电点为9.82。
进一步，所述飞蝗C型清道夫受体基因获得方法，包括以下步骤：
步骤1，基于飞蝗转录组数据库，搜索搜索其Unigene，经NCBI Blastx分析后，获得飞蝗C型清道夫受体基因的片段；
步骤2，对步骤1搜索获得的片段通过GeneDoc软件进行拼接；
步骤3，根据步骤2的拼接结果，设计并合成对应的上游引物SEQ ID NO： 3和下游引物SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：3：CTGCCGCTATGTCATGCTCCTAAA；
SEQ ID NO：4：AATGAACGATACTAATTTGACAGACC
步骤4，提取飞蝗的RNA并反转录成cDNA，得到PCR扩增所需模板；
步骤5，采用步骤4获得的模板和步骤3合成的引物，经PCR扩增反应获得飞蝗C型清道夫受体。
进一步，所述步骤4中模板制备的过程如下：选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞蝗若虫直接冷冻于液氮中。4头一个生物学重复，随后置于研钵中进行研磨，依照TaKaRaTrizol试剂盒提取RNA。采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得PCR反应所需模板。
进一步，所述步骤5中经PCR扩增反应获得飞蝗C型清道夫受体基因的过程为：采用步骤4获得的模板和步骤3合成的引物，通过PCR扩增获得C型清道夫受体基因全长片段。通过Gel Extroaction Kit(Omega)将上述PCR产物进行纯化，将纯化后的产物克隆到pEASY-T3 Cloning vector(全式金公司)中，转入感受态细胞，扩大菌液培养，采用Plasmid MiniKit1(Omega)提取质粒，检测后将菌液送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序，得到飞蝗C型清道夫受体基因序列。该基因核苷酸长度为2839bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。
更进一步，所述步骤5中PCR扩增反应的体系为：PrimeSTAR Max Premix (2X)10μL，上下游引物各0.2μL，模板1μL，双蒸水8.6μL，总体积20μL；
反应程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸150s，循环35次。
本发明还提供飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA，该靶向dsRNA其中一条的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示序列。
进一步，所述靶向dsRNA的合成方法，包括如下步骤：
步骤1，按照飞蝗C型清道夫受体基因的核苷酸序列，通过primer premier5.0 软件设计含有T7启动子(斜体部分)的上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7；
SEQ ID NO：6：taatacgactcactatagggCGTCAAGAAGAGGATGAGGC
SEQ ID NO：7：taatacgactcactatagggTTCTGAAGCTTGCCGTACCT
步骤2，通过PCR扩增获得一段长度为506bp的两端均为T7启动子的DNA 片段(SEQID NO：5)，经试剂盒纯化后按照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System (Promega)试剂盒说明体外转录合成得到飞蝗C型清道夫受体基因的靶向 dsRNA。
更进一步，所述步骤2中PCR扩增的体系为：2*taq PCR MasterMix II 25μL, 上下游引物各1μL，双蒸水21μL，cDNA模板2μL，总体积为50μL；
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火 30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃终延伸7min。
本发明提供飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA用于保护外源dsRNA 的应用。
进一步，所述靶向dsRNA保护外源dsRNA是通过微量进样器将合成的靶向dsRNA注射进飞蝗体腔内从而敲低C型清道夫受体基因表达水平来实现的。结果表明：注射dsRNA后飞蝗C型清道夫受体基因的mRNA表达显著降低，飞蝗吞噬外源dsRNA的能力显著减弱，靶基因的沉默效率显著提高。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
飞蝗三龄若虫注射C型清道夫受体基因合成的靶向dsRNA后，可保护外源 dsRNA免受血细胞的吞噬和降解。本发明飞蝗C型清道夫受体基因仅节肢动物昆虫特异表达，哺乳动物及人类等高等生物不存在，合成的C型清道夫受体基因的靶向dsRNA大大减弱了飞蝗对外源dsRNA的降解能力，大幅提升了外源 dsRNA对靶基因的沉默效率，实现用最低剂量的dsRNA杀虫剂达到高效的杀虫效果，对于害虫防治具有重要的现实意义和经济效益。
附图说明
图1：dsLmSRC注射24h后对飞蝗C型清道夫受体基因(LmSRC)转录的影响，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图2：沉默飞蝗C型清道夫受体基因后，血细胞和血淋巴液(无血细胞)对外源dsGFP吸收的影响。
图3：注射dsLmSRC后三龄若虫血细胞溶酶体对dsGFP-Fluorescence降解吞噬能力的影响。
图4：外源dsRNA对靶基因沉默效率的影响。左图dsGFP+dsGFP为对照组1，dsGFP+dsLmLgl为对照组2，dsLmSRC+dsLmLgl为处理组；右图 dsGFP+dsGFP为对照组1，dsGFP+dsLmKnk为对照组2，dsLmSRC+dsLmKnk 为处理组。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明，但并不用以限制本发明。
实施例1
飞蝗C型清道夫受体基因(LmSRC)cDNA全长序列获得及其氨基酸序列分析
1、飞蝗C型清道夫受体基因cDNA片段获得
基于飞蝗的转录组数据库，对其Unigene进行搜索，经NCBI Blastx分析后，确定获得1个飞蝗C型清道夫受体基因的片段。
2、飞蝗C型清道夫受体基因cDNA全长序列获得
1)PCR扩增所需引物的设计：
将上述基因片段通过GeneDoc软件进行拼接，并采用primer premier5.0软件设计上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
2)PCR扩增所需模板制备：
选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞蝗若虫直接冷冻于液氮中。4 头一个生物学重复，随后置于研钵中进行研磨，依照TaKaRaTrizol试剂盒提取 RNA。采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得PCR 反应所需模板。
3)PCR扩增反应
采用步骤2)获得的模板和步骤1)合成的引物，通过PCR扩增获得C型清道夫受体基因全长片段。
PCR体系为：PrimeSTAR Max Premix(2X)10μL，上下游引物各0.2μL，模板1μL，双蒸水8.6μL，总体积20μL。
反应程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸150s，循环35次。
通过Gel Extroaction Kit(Omega)将上述PCR产物进行纯化，将纯化后的产物克隆到pEASY-T3 Cloning vector(全式金公司)中，转入感受态细胞，扩大菌液培养，采用Plasmid Mini Kit1(Omega)提取质粒，检测后将菌液送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序得到飞蝗C型清道夫受体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
3.飞蝗C型清道夫受体基因氨基酸序列分析
通过ExPaSy在线软件对已获得的清道夫受体基因进行翻译，预测C型清道夫受体基因的开放阅读框编码763个氨基酸，分子量为82.5KD，等电点为9.82。功能域预测发现C型清道夫受体基因具有2个跨膜结构域，2个CCP结构域,1 个MAM结构域。测序得到氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
实施例2
飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA的合成：
1、飞蝗C型清道夫受体基因靶向dsRNA引物的设计
基于飞蝗C型清道夫受体基因序列，采用primer premier5.0软件设计其靶向dsRNA的引物。得到引物的序列如下(斜体部分为T7启动子)：
上游引物SEQ ID NO：6：
taatacgactcactatagggCGTCAAGAAGAGGATGAGGC
下游引物SEQ ID NO：7：
taatacgactcactatagggTTCTGAAGCTTGCCGTACCT
所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
2、飞蝗C型清道夫受体基因特异性dsRNA合成
以从上述质粒提取的C型清道夫受体基因为模板，用上述合成的含有T7启动子序列的上下游引物进行PCR扩增。得到一段长度为506bp基因片段(SEQ ID NO：5)。
PCR扩增的体系为：2*taq PCR MasterMix II 25μL,上下游引物各1μL，双蒸水21μL，cDNA模板2μL，总体积为50μL。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s；60℃退火 30s；72℃延伸45s,循环35次；72℃终延伸7min。
采用Gel Extraction Kit(Omega)试剂盒将PCR产物纯化后按照T7RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA (dsLmSRC)。使用NaNoDrop 2000(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到2.5μg/μL。保存于-80℃超级低温冰箱备用。
实施例3
飞蝗C型清道夫受体基因dsRNA降低血细胞吞噬能力及对靶基因干扰效率的影响
1、特异性dsLmSRC注射
选取15头生长健康、大小一致的3龄第1天若虫进行实验。处理组使用10μL 规格微量注射器将2μL(5μg)合成的dsRNA轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间，设置5个生物学重复，每个生物学重复3头虫；同时选取15头若虫设立为对照组，注射与处理组dsRNA相同体积和浓度的dsGFP，同样设置5 个生物学重复，每个生物学重复3头虫。将注射后飞蝗置于30℃恒温培养室中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)，对照和处理组每天均饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。
2、飞蝗C型清道夫受体基因沉默检测
各收集9头注射dsGFP和dsRNA(dsLmSRC)，24h后取若虫血淋巴依照 TaKaRaTrizol试剂盒进行总RNA提取，并采用M-MLV反转录酶将其反转录成第一链cDNA，采用Real-timePCR方法分别检测目的基因(LmSRC)和管家基因(EF1a)的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。每组设置3个生物学重复，每个生物学重复3头若虫。
Real-time PCR方法的反应体系为：SYBR Green mixture 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板4μL，去离子水4.4μL，共20μL。
反应程序为：95℃预变性1min；95℃解链15s；60℃退火及延伸31s，循环40次；60℃进行荧光检测，DNA熔解分析60-95℃，每步上升1℃。
图1结果表明，与对照组比较，注射dsRNA后，处理组C型清道夫受体基因表达显著降低。表明该dsRNA片段可显著沉默靶基因(LmSRC)的表达水平， dsRNA片段有效，可用于后续研究。
3、血细胞对外源dsGFP吸收的影响
将三龄若虫对照组注射dspEASY-Blunt Zero，处理组注射dsLmSRC，24h后均注射dsGFP，检测dsGFP进入血细胞(hemocytes)及残留在血淋巴 (hemolymph)液中的数量。
图2结果表明沉默C型清道夫受体基因后，dsGFP进入血细胞的数量显著减少；相反，与对照相比，dsGFP在血淋巴液(无血细胞)中的数量显著增多。表明C型清道夫受体基因介导dsGFP进入血细胞。
4、注射dsLmSRC后血细胞溶酶体对dsGFP吞噬能力的影响
三龄若虫对照组注射dsGFP，处理组注射dsRNA，24h后均注射带有绿色荧光的dsGFP-Fluorescence，观察溶酶体和dsGFP-Fluorescence共定位的情况。
图3显示，相比对照组，处理组溶酶体数量显著减少，dsGFP-Fluorescence 与溶酶体共定位情况减少，吞噬dsGFP-Fluorescence能力降低。表明C型清道夫受体基因介导dsGFP-Fluorescence进入血细胞后，大量dsGFP-Fluorescence 被溶酶体降解。相反，C型清道夫受体基因被沉默后，导致溶酶体数量显著降低， dsGFP-Fluorescence进入血细胞的数量也大大减少。
5、注射dsLmSRC后外源dsRNA对靶基因沉默效率的影响
分别选取飞蝗体内Knk和Lgl两个基因作为靶标基因，设置对照组1 dsGFP+dsGFP和对照组2dsGFP+dsLmKnk/dsLmLgl，处理组 dsLmSRC+dsLmKnk/LmLgl，二次注射dsRNA后，24h后检测靶基因沉默效率。
图4结果显示，与对照组相比，处理组沉默C型清道夫受体基因后靶基因沉默效率显著提高。表明降低C型清道夫受体基因的表达后，血细胞无法对 dsRNA进行免疫，大量dsRNA免受血细胞吞噬，使dsRNA有更多机会进入昆虫其他组织，从而发挥更高效的RNA干扰效率。
应当指出，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，都包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 山西大学
<120> 飞蝗C型清道夫受体基因及其靶向dsRNA与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2839
<212> DNA
<213> 飞蝗(Locusta migratoria)
<400> 1
ctgccgctat gtcatgctcc taaagtgaac taccgggaag tatttcaaca gacttgtgtg 60
aagtgtgttc cggaaaatga attactttac ggtaaccttg gcgttgctgt tgcttgcagt 120
gataccggca aatagtgtta ttagagacag aaagcgcacc aggccgtacc ggtgcccgcc 180
gctgagcctg accaacggct acacgcggat caagaacggc ggccaggagc tgcgcttcaa 240
gtgccagccc ggcttccgcc tgctgggcga ccagtacggc acgtgcgtgc gcggccgctg 300
gaacgtcgac atgcccgtct gcgtccgaag aggctgcgac gtgctgccgg accccacgag 360
cggctggtgg cagctgagca tgggcggcgc cgtggccacg ctcgtctgcg acccgggcta 420
cgcgctcgac agcgccgagg cggcgcaggt ctactgcaac ggccgcctct ggcgcccgcg 480
aacccaggac ccctcctgca gagctgtgat tacttcgccg aaaacctcct gcgactttga 540
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taattattct acaccttctg ggcatcttaa tactggtcca tcttatgacc acacatatgg 660
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taagaacggg cctgttgttc cggtgactgt cagctctaag ttaaattcca gtgccactac 1560
gtcagcttcg ttcaacatca ccacgcgtcc gacgactaaa cttacatcag ctcgcttctc 1620
tagttctact aagcttacgg ttacgactac aaagagtcct cccgcggttc cgacaactaa 1680
gagtcctccc gcggttccga caactaagag tcctcccacg gttccgacaa ctaagagtcc 1740
tcccacggtt ccgacaacta agagtcctcc aactgtcttg ataacccgga cgacactcgc 1800
ttcaacgaca ctaaccactc gtcgcccgac cacttcaact actgtgaaag tgaccgtccc 1860
gaaactgcca gtaacgaaac tggtaactaa gcctacagta gcctctactt tgccctcaaa 1920
agctacaacg ccatctacta ccacgtctat tcgttacaaa gtacaaaagg cgccaaccac 1980
tgttagaaca accaccactc ctacgacgct acgcaaccgt ttccttccta ccactgtgtc 2040
aacgaccacc ctccttcctt tagcaactac tggatccact aaaccagcat cacctacttt 2100
tcagcgagtt ctaaaaccga ggtggtcacc aaagagacgt caagttaagg cgcccccgcc 2160
gagcggccca tctgccaaga ctatcggcgc cgtggtggcc gtcgtcctga caggcctgct 2220
gctctgcgtg gtcgcgttct tcctcgtcaa gaagaggatg aggcagcgca ggcagcggaa 2280
cgtggcggag gactccgacg tccgctacct cacgtccgac gaaatcctcg acttcaactt 2340
ggcgcggccg gcagacgatg acgcgtgatg tcaccaccac agatgttcac ctacagattt 2400
cgttccctgt ctgcagatcc tctagcgaag tagaggttca cttgaaaata aaaaaaaaaa 2460
tacatacgag tcttttctct ataacatgtt tcttcgacag gaagttttat ggcgcgtgag 2520
ttattactgt aataatgtga aagagaaata tgaactcgat tccctcataa ttaattcatt 2580
aattacgtag gtgcagtgtt ggttcacaaa cacaacagaa tcaaatcgac tgttgagctg 2640
taccttgttc ggacatgctg aacgcactta cattaattcg agtaaaatga aggtacggca 2700
agcttcagaa ctgaacagta tcacgaagca ttaaatgaac tgtgaaagta tttttattct 2760
ccacacattc cgatctttta gaatatcatg cttgcagtag actataaagt acaggtctgt 2820
caaattagta tcgttcatt 2839
<210> 2
<211> 763
<212> PRT
<213> 飞蝗(Locusta migratoria)
<400> 2
Met Asn Tyr Phe Thr Val Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Val Ile
1 5 10 15
Pro Ala Asn Ser Val Ile Arg Asp Arg Lys Arg Thr Arg Pro Tyr Arg
20 25 30
Cys Pro Pro Leu Ser Leu Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Ile Lys Asn Gly
35 40 45
Gly Gln Glu Leu Arg Phe Lys Cys Gln Pro Gly Phe Arg Leu Leu Gly
50 55 60
Asp Gln Tyr Gly Thr Cys Val Arg Gly Arg Trp Asn Val Asp Met Pro
65 70 75 80
Val Cys Val Arg Arg Gly Cys Asp Val Leu Pro Asp Pro Thr Ser Gly
85 90 95
Trp Trp Gln Leu Ser Met Gly Gly Ala Val Ala Thr Leu Val Cys Asp
100 105 110
Pro Gly Tyr Ala Leu Asp Ser Ala Glu Ala Ala Gln Val Tyr Cys Asn
115 120 125
Gly Arg Leu Trp Arg Pro Arg Thr Gln Asp Pro Ser Cys Arg Ala Val
130 135 140
Ile Thr Ser Pro Lys Thr Ser Cys Asp Phe Glu Ser Glu Asp Ile Cys
145 150 155 160
Gly Trp Ser Gln Asp Ser Val Asn Asp Phe Leu Trp Ile Arg Asn Asn
165 170 175
Tyr Ser Thr Pro Ser Gly His Leu Asn Thr Gly Pro Ser Tyr Asp His
180 185 190
Thr Tyr Gly Ile Gly Tyr Gly Gly His Tyr Met Tyr Ile Glu Ser Ser
195 200 205
Ser Pro Arg Lys Glu Asn Asp Phe Ala Arg Leu Tyr Ser Pro Val Tyr
210 215 220
Gly Lys Asp Val Ala Asp Asp Gly Cys Phe Met Phe Trp Tyr Asn Met
225 230 235 240
Phe Gly Thr Thr Ile Gly Ser Leu Lys Ile Tyr Val Lys Pro Gln Thr
245 250 255
Gln Pro Phe Lys Asp Leu Val Pro Ala Phe Gln Lys Phe Gly Asn Gln
260 265 270
Gly Ala Arg Trp Leu Gln Gly Ile Val Ser Leu Thr Ser Val Asn Glu
275 280 285
Thr Phe Gln Val Ile Ile Glu Ala Thr Arg Gly Asn Gly Phe Leu Gly
290 295 300
Asp Ile Ala Val Asp Asp Val Ala Ile Arg Lys Gly Asp Asp Cys Leu
305 310 315 320
Val Met Pro Asp Gln Pro Ile Thr Ala Ala Ile Arg Gln Asp Gly Glu
325 330 335
Thr Ala Thr Arg Glu Pro Pro Val Lys Ser Phe Pro Thr Phe Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Pro Leu Pro Asp Leu Pro Pro Met Pro Pro Ala Ala Glu Ala
355 360 365
Ser Gln Thr Pro Ser Ala Thr His Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asn
370 375 380
His Ser Thr Phe Ser Leu Pro Ser Thr Pro Gln Thr Ala Val Ile Ala
385 390 395 400
Thr Ser Thr Ser Ser Leu Lys Ser Thr Asn Ser Thr Ala Thr Ser Ala
405 410 415
Pro Pro Leu Pro Asp Asn Pro Arg Gln Thr Thr Thr Ser Tyr Ala Thr
420 425 430
Asn Arg Thr Glu Thr Ala Thr Val Ala Phe Ser Val Ser Glu Arg Arg
435 440 445
Thr Val Ala Thr Asp Arg Pro Ser Thr Val Ala Ala Thr Glu Gly Asn
450 455 460
Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Thr Ala Gly Val Lys Asn Gly Pro Val
465 470 475 480
Val Pro Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Asn Ser Ser Ala Thr Thr Ser
485 490 495
Ala Ser Phe Asn Ile Thr Thr Arg Pro Thr Thr Lys Leu Thr Ser Ala
500 505 510
Arg Phe Ser Ser Ser Thr Lys Leu Thr Val Thr Thr Thr Lys Ser Pro
515 520 525
Pro Ala Val Pro Thr Thr Lys Ser Pro Pro Ala Val Pro Thr Thr Lys
530 535 540
Ser Pro Pro Thr Val Pro Thr Thr Lys Ser Pro Pro Thr Val Pro Thr
545 550 555 560
Thr Lys Ser Pro Pro Thr Val Leu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Ala Ser
565 570 575
Thr Thr Leu Thr Thr Arg Arg Pro Thr Thr Ser Thr Thr Val Lys Val
580 585 590
Thr Val Pro Lys Leu Pro Val Thr Lys Leu Val Thr Lys Pro Thr Val
595 600 605
Ala Ser Thr Leu Pro Ser Lys Ala Thr Thr Pro Ser Thr Thr Thr Ser
610 615 620
Ile Arg Tyr Lys Val Gln Lys Ala Pro Thr Thr Val Arg Thr Thr Thr
625 630 635 640
Thr Pro Thr Thr Leu Arg Asn Arg Phe Leu Pro Thr Thr Val Ser Thr
645 650 655
Thr Thr Leu Leu Pro Leu Ala Thr Thr Gly Ser Thr Lys Pro Ala Ser
660 665 670
Pro Thr Phe Gln Arg Val Leu Lys Pro Arg Trp Ser Pro Lys Arg Arg
675 680 685
Gln Val Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Pro Ser Ala Lys Thr Ile Gly
690 695 700
Ala Val Val Ala Val Val Leu Thr Gly Leu Leu Leu Cys Val Val Ala
705 710 715 720
Phe Phe Leu Val Lys Lys Arg Met Arg Gln Arg Arg Gln Arg Asn Val
725 730 735
Ala Glu Asp Ser Asp Val Arg Tyr Leu Thr Ser Asp Glu Ile Leu Asp
740 745 750
Phe Asn Leu Ala Arg Pro Ala Asp Asp Asp Ala
755 760
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgccgctat gtcatgctcc taaa 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatgaacgat actaatttga cagacc 26
<210> 5
<211> 506
<212> DNA
<213> 飞蝗(Locusta migratoria)
<400> 5
taatacgact cactataggg cgtcaagaag aggatgaggc agcgcaggca gcggaacgtg 60
gcggaggact ccgacgtccg ctacctcacg tccgacgaaa tcctcgactt caacttggcg 120
cggccggcag acgatgacgc gtgatgtcac caccacagat gttcacctac agatttcgtt 180
ccctgtctgc agatcctcta gcgaagtaga ggttcacttg aaaataaaaa aaaaaataca 240
tacgagtctt ttctctataa catgtttctt cgacaggaag ttttatggcg cgtgagttat 300
tactgtaata atgtgaaaga gaaatatgaa ctcgattccc tcataattaa ttcattaatt 360
acgtaggtgc agtgttggtt cacaaacaca acagaatcaa atcgactgtt gagctgtacc 420
ttgttcggac atgctgaacg cacttacatt aattcgagta aaatgaaggt acggcaagct 480
tcagaataat acgactcact ataggg 506
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg cgtcaagaag aggatgaggc 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatacgact cactataggg ttctgaagct tgccgtacct 40

Claims (9)

1.飞蝗C型清道夫受体基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。
2.权利要求1所述的飞蝗C型清道夫受体基因的获得方法，其特征在于，通过以下步骤获得：
步骤1，基于飞蝗转录组数据库，搜索其Unigene，经NCBI Blastx分析后，获得飞蝗C型清道夫受体基因的片段；
步骤2，对步骤1搜索获得的片段通过GeneDoc软件进行拼接；
步骤3，根据步骤2的拼接结果，采用primer premier 5.0软件设计并合成对应的上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4；
步骤4，提取飞蝗的RNA并反转录成cDNA，得到PCR扩增所需模板；
步骤5，采用步骤4获得的模板和步骤3合成的引物，经PCR扩增反应获得飞蝗C型清道夫受体基因。
3.权利要求1所述的飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA，其特征在于：所述靶向dsRNA的其中一条的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示序列。
4.权利要求3所述的飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，按照飞蝗C型清道夫受体基因的核苷酸序列，通过primer premier5.0软件设计含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7；
步骤2，通过PCR扩增获得两端均为T7启动子的模板DNA片段，经试剂盒纯化后体外转录合成得到飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA。
5.根据权利要求3所述的飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA的应用，其特征在于：用于保护外源dsRNA。
6.根据权利要求5所述的飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA的应用，其特征在于：所述靶向dsRNA保护外源dsRNA是通过微量进样器将合成的靶向dsRNA注射进飞蝗体腔内从而敲低C型清道夫受体基因表达水平来实现的。
7.根据权利要求2所述的飞蝗C型清道夫受体基因的获得方法，其特征在于，所述步骤4中模板制备的过程如下：选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞蝗若虫直接冷冻于液氮中，随后置于研钵中进行研磨，依照试剂盒提取RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，从而获得PCR反应所需模板。
8.根据权利要求2所述的飞蝗C型清道夫受体基因的获得方法，其特征在于，所述步骤5中PCR扩增反应的体系为：PrimeSTAR Max Premix,2X 10μL，上下游引物各0.2μL，模板1μL，双蒸水8.6μL，总体积20μL；反应程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸150s，循环35次。
9.根据权利要求4所述的飞蝗C型清道夫受体基因的靶向dsRNA的合成方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增反应的体系为：2*taq PCR MasterMix II 25μL,上下游引物各1μL，双蒸水21μL，cDNA模板2μL，总体积为50μL；反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃终延伸7min。
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