CN116970623A - 用于防控小麦茎基腐病的基因片段及其应用 - Google Patents

用于防控小麦茎基腐病的基因片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于防控小麦茎基腐病的基因片段及其应用。其中，假禾谷镰孢菌Fp487基因序列如SEQ ID NO.1所示，经实验证实，该基因是防控小麦茎基腐病的关键靶点基因，针对该基因实施基因沉默可以有效防控假禾谷镰孢菌导致的小麦茎基腐病。用于防控小麦茎基腐病的基因片段序列如SEQ ID NO.3所示，以该基因片段为靶标合成的dsRNA可用于防控小麦茎基腐病，同时本发明能高效合成该dsRNA。本发明以假禾谷镰孢菌Fp487基因为基础，合成获得的dsRNA能有效降低病菌的侵染能力从而防控小麦茎基腐病。本发明利用大肠杆菌实现了在短时间内大规模合成dsRNA，克服现有技术难以大规模生产的缺点。

Description

用于防控小麦茎基腐病的基因片段及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于防控小麦茎基腐病的基因片段及其应用，属于农业真菌病害防治技术领域。
背景技术
小麦茎基腐病(Fusarium crown rot，FCR)主要是由假禾谷镰孢菌(Fusariumpseudograminearum)引起的一种土传病害。近年来，小麦茎基腐病在我国小麦主产区连年暴发成灾。据调查，该病在我国年均发生面积超过9000万亩，发病严重麦田减产率高达52％，且发生区域逐年扩大，发生程度逐年加重，对小麦产业的安全生产和健康发展构成严重威胁。目前，抗茎基腐病的小麦品种缺乏，可供选择的防控茎基腐病的化学杀菌剂种类有限，亟待开发新的防控措施。
近年来，基于RNA技术研发的RNA农药备受关注。RNA农药使用dsRNA分子来抑制害虫或病原体的基因表达，从而达到控制害虫或病害的目的。相比于传统的化学农药，RNA农药具有高效、低毒性、不会对环境造成污染等优点。同时，由于RNA农药的作用机理是特异性靶向，能够精准作用于目标生物体，进一步保证其安全性。因此，RNA农药在未来的农业生产和植物保护中有着广阔的应用前景。
本发明的发明人课题组致力于研发专门针对小麦茎基腐病的RNA农药，目前已有研究成果，并以此来申请本发明专利。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于防控小麦茎基腐病的基因片段，以该基因片段为靶标合成dsRNA，直接滴注于小麦茎基部即可防控小麦茎基腐病。同时还提供该基因片段的应用。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
假禾谷镰孢菌Fp487基因，其特征是，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
发明人课题组经实验证实，假禾谷镰孢菌Fp487基因是防控小麦茎基腐病的关键靶点基因，针对该基因实施基因沉默可以有效防控假禾谷镰孢菌导致的小麦茎基腐病。
前文所述假禾谷镰孢菌Fp487基因的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取假禾谷镰孢菌CF14047菌株的菌丝，提取其总DNA；
第二步、以第一步获得的总DNA为模板，采用SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQID NO.5所示的下游引物，通过PCR反应获得假禾谷镰孢菌Fp487基因。
采用该方法可制备获得假禾谷镰孢菌Fp487基因。
本发明还提供：
由前文所述假禾谷镰孢菌Fp487基因编码的蛋白，其特征是，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
该蛋白含有646个氨基酸，分子量为70.704kD，等电点为8.62；包含2个结构域：GAL4结构域和MAC结构域。
本发明还提供：
一种用于防控小麦茎基腐病的基因片段，其特征是，该基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
以该基因片段为靶标合成的dsRNA可用于防控小麦茎基腐病。
一种用于防控小麦茎基腐病的dsRNA制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、以假禾谷镰孢菌CF14047菌株的总DNA为模板，或者以前文所述假禾谷镰孢菌Fp487基因为模板；采用SEQ ID NO.6所示的上游引物和SEQ ID NO.7所示的下游引物，通过PCR反应获得PCR产物；
第二步、采用限制性内切酶NotⅠ和HindⅢ对L4440载体进行双酶切，获得线性化L4440载体；所述L4440载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
第三步、将第一步所得PCR产物与第二步所得线性化L4440载体以同源重组酶连接，获得重组连接产物；将重组连接产物转入工程菌感受态细胞中，经培养、检测后，继续培养含有正确重组质粒的细胞，然后从中提取出重组质粒；将重组质粒转化到表达型菌株中，经培养、验证后，将正确菌种予以保存；
第四步、将第三步所得菌种进行培养和诱导表达；之后，先从所得菌体中提取总RNA，再从总RNA中提取并纯化获得dsRNA。
现有技术合成dsRNA的主要手段是T7试剂盒，成本高，合成量低，不能大规模生产；本发明上述方法利用工程菌进行体内合成dsRNA，成本低，效率高，可以实现靶标dsRNA的大规模合成。
优选地，第一步中，上游引物序列中含有NotⅠ酶切位点，下游引物序列中含有HindⅢ酶切位点；第三步中，所述工程菌感受态细胞为E.coli DH5α，所述表达型菌株为E.coliHT115；第四步中，所述诱导表达采用的诱导物为IPTG，采用Trizol法提取总RNA；从总RNA中提取并纯化获得dsRNA的过程包括：向总RNA中加入RNase A并反应，加入DNaesⅠ并反应，加入由苯酚、氯仿、异戊醇混合而成的混合溶液，振荡后离心取上清，加入NaAC及核酸沉降剂，混合均匀，加入无水乙醇，混匀后离心弃上清，以预冷的70±2％乙醇洗涤后，离心收集沉淀，干燥后以无核酸酶水溶解，即得dsRNA。
更优选地，第三步的具体过程为：
将第一步所得PCR产物与第二步所得线性化L4440载体以同源重组酶连接，获得重组连接产物；将重组连接产物转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于LB固体培养基平板上，在37℃培养箱中倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测，及琼脂糖凝胶电泳检测；将含有目标基因片段的单菌落进行测序分析，检测重组质粒序列的准确性；将鉴定正确的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜摇培12h；利用质粒DNA提取试剂盒提取重组质粒，以琼脂糖凝胶电泳检测；将重组质粒转化到表达型菌株E.coli HT115中，涂板，37℃培养箱中过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测及琼脂糖凝胶电泳检测验证，将正确菌种以等比例1：1加入50％甘油后予以保存；
第三步中，LB固体培养基由10g/L氯化钠、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、12g/L琼脂粉、100μg/mL氨苄青霉素以及水制备而成；LB液体培养基由10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素以及水制备而成；
第四步的具体过程为：
将第三步所得菌种按1：100的比例接种于LB液体培养基中，在摇床37℃，200rpm下培养；当OD600＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃下诱导表达4～5h；第四步中，LB液体培养基由10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素、12.5μg/mL四环素以及水制备而成；
利用Trizol法提取菌体的总RNA；加入终浓度为1μg/mL RNase A和0.1μg/μLDNaesⅠ，分别在37℃下反应1h和30min，去除单链RNA和基因组DNA；加入等体积的由苯酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1混合而成的混合溶液，振荡100s以上，离心取上清；加入1/10样品体积的3M pH＝5.2的NaAC溶液，加入4μL核酸沉降剂，混合均匀；加入750μL无水乙醇，充分混匀，离心弃上清；用预冷的70％乙醇洗涤2次，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsRNA；以琼脂糖凝胶电泳检测及分光光度计测定浓度后，于-80℃保存dsRNA。
采用以上优选方案，可进一步优化制备方法的具体技术特征。
此外，本发明还提供：
一种用于防控小麦茎基腐病的dsRNA，其特征是，采用前文所述用于防控小麦茎基腐病的dsRNA制备方法制备获得。
前文所述的dsRNA用于防控小麦茎基腐病的应用。
优选地，所述应用包括以下步骤：将dsRNA滴注于小麦茎基部以抑制假禾谷镰孢菌Fp487基因的表达。
本发明在获得假禾谷镰孢菌Fp487基因的基础上，设计并合成的dsRNA对防控小麦茎基腐病有显著效果，能有效降低病菌的侵染能力，为防控小麦茎基腐病提供了新的途径。同时，本发明利用大肠杆菌实现了在短时间内大规模合成dsRNA，克服了现有技术难以大规模生产的缺点。此外，本发明技术方案成本低廉，适用范围广泛，操作简单，可以重复使用而不受限制。
附图说明
图1为本发明实施例3的检测结果图。
图2、图3为本发明实施例3的叶片抑菌实验结果图。
图4、图5为本发明实施例3的盆钵抑菌实验结果图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
本实施例为获取假禾谷镰孢菌Fp487基因序列。
本实施例的具体内容如下：
1、利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物，引物序列如下：
上游引物：SEQ ID NO.4：atgtcaacttttacggccct
下游引物：SEQ ID NO.5：tcaagaggcgatgccgcgca
引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
2、利用试剂盒提取CF14047基因组总DNA以作为扩增模板
选取2个生长5天接种假禾谷镰孢菌CF14047菌株的PDA平板，刮菌丝，置于液氮中速冻。利用研钵进行研磨，并依照上海浦迪生物科技有限公司新型基因组DNA提取试剂盒进行总DNA提取，作为PCR反应的模板。
3、PCR反应获得假禾谷镰孢菌Fp487基因序列
利用步骤1合成的上下游引物和步骤2获取的DNA模板，通过PCR反应获得假禾谷镰孢菌Fp487基因序列，反应体系如下：
PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃2min，循环35次；72℃10min，4℃永久循环。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，片段纯化回收，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR产物；并连接至T/A blunt vector载体(Vazyme,南京)上，转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于LB固体平板上，在37℃培养箱中，倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；将验证正确的菌液送至上海生工生物技术公司测序。
测序得到的假禾谷镰孢菌Fp487基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4、假禾谷镰孢菌Fp487基因氨基酸序列分析
通过ExPASy在线软件对测序获得的Fp487基因进行翻译，预测Fp487基因编码646个氨基酸，分子量为70.704kD，等电点为8.62。SMART在线预测Fp487蛋白包含2个结构域：GAL4结构域和MAC结构域，该蛋白的氨基酸序列如SED ID NO.2所示。
实施例2
本实施例为高效合成假禾谷镰孢菌Fp487基因的dsRNA。
本实施例的具体内容如下：
经实验研究确定选取假禾谷镰孢菌Fp487基因的核苷酸序列中的一段作为目的基因片段作为制备dsRNA的靶标基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
1、设计假禾谷镰孢菌Fp487基因的dsRNA引物
利用Geneious软件，在目的基因片段两端加上L4440载体的同源序列，设计PCR扩增引物，其中，上游引物包含NotⅠ酶切位点，下游引物包含HindⅢ酶切位点，序列如下：
上游引物：SEQ ID NO.6：
[ttcgagctccaccgcggtggcggccgc]catcaacaatacccagcgcg
下游引物：SEQ ID NO.7：
[tcgaggtcgacggtatcgataagctt]attggaatcgggctctgtcc
[]内的部分与L4440载体同源，下划线部分为酶切位点；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
2、PCR扩增目的片段
以CF14047总基因DNA(与实施例1相同)为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物。(注：也可以采用实施例1的PCR产物即假禾谷镰孢菌Fp487基因作为模板。)
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，循环35次；72℃10min，4℃永久循环。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，片段纯化回收，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR产物。
3、L4440载体线性化
利用两个限制性内切酶NotⅠ和HindⅢ进行L4440载体的双酶切，获得线性化的L4440载体。
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：在37℃下，反应30min。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收，利用DNA胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的L4440线性化载体。L4440载体序列如SEQ ID NO.8所示。
4、表达载体构建
利用同源重组酶连接纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体；将重组连接产物转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于LB固体平板上，在37℃培养箱中，倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；将含有目的基因片段的单菌落测序分析，检测重组载体序列的准确性；将鉴定正确的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜摇培12h；利用质粒DNA提取试剂盒提取L4440重组质粒，琼脂糖凝胶电泳检测；将重组质粒转化到表达型菌株E.coli HT115中，涂板，37℃培养箱中过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳验证，等比例1：1加入50％甘油保存菌种。
其中，LB固体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、12g/L琼脂粉和100μg/mL氨苄青霉素；LB液体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物和100μg/mL氨苄青霉素。
5、诱导表达
将含有表达载体的E.coli HT115菌液按1：100的比例接种于LB液体培养基中，在摇床37℃，200rpm下培养；当OD600＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃下诱导表达4～5h。其中，LB液体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素。
6、dsRNA的提取和纯化
利用Trizol提取菌体的总RNA；加入终浓度为1μg/mL RNase A和0.1μg/μL DNaesⅠ，分别在37℃下反应1h和30min，去除单链RNA和基因组DNA；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)溶液，振荡100s以上，离心取上清；加入1/10样品体积的3M NaAC(pH＝5.2)加入4μL核酸沉降剂，混合均匀。加入750μL无水乙醇，充分混匀，离心弃上清；用70％冷乙醇洗涤2次，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水(RNase free water)溶解，获得纯化后的dsRNA；琼脂糖凝胶电泳检测及分光光度计测定浓度，-80℃保存。
实施例3
本实施例为验证假禾谷镰孢菌Fp487基因的dsRNA的抑菌效果。
本实施例的具体内容如下：
1、dsRNA的滴注
平板抑菌实验：将假禾谷镰孢菌CF14047菌碟接种于PDA平板上，使用移液枪将150μL dsRNA(浓度为100ng/μL)接种于菌碟处，设置3个生物学重复，作为处理组；选取同样的平板接种与处理组相同体积的无菌水(即ddH2O)，设置3个生物学重复，作为对照组。
叶片抑菌实验：选取二叶期大麦叶片，将小麦茎基腐病菌(即假禾谷镰孢菌)菌碟接种于叶片上，使用移液枪将50μL dsRNA(浓度为100ng/μL、1600ng/μL)接种于菌碟处，设置3个生物学重复，作为处理组；选取同样的大麦叶片接种与处理组相同体积的无菌水(即ddH2O)，设置3个生物学重复，作为对照组。
盆钵抑菌实验：选取已接种小麦茎基腐病菌孢子液的二叶期小麦，使用移液枪将20μL dsRNA(浓度为100ng/μL、1600ng/μL)接种于小麦茎基部，设置3个生物学重复，作为处理组；选取同样已接种小麦茎基腐病菌孢子液的二叶期小麦，接种与处理组相同体积的无菌水，设置3个生物学重复，作为对照组；选取未接种小麦茎基腐病菌孢子液的二叶期小麦，设置3个生物学重复，作为未处理组。
2、假禾谷镰孢菌Fp487基因的沉默检测
采用平板抑菌实验样本，利用qPCR技术分别检测Fp487基因和内参基因actin的相对表达量，采用2-ΔΔCt法计算假禾谷镰孢菌Fp487基因的沉默检测。
与Fp487基因和内参基因actin对应的引物序列如下：
Fp487上游引物：SEQ ID NO.9：
catcaacaatacccagcgcg
Fp487下游引物：SEQ ID NO.10：
attggaatcgggctctgtcc
内参基因actin上游引物：SEQ ID NO.11：
accgtgagaagatgac
内参基因actin下游引物：SEQ ID NO.12：
cgaaaccctcgtaaatg
反应体系(20μL)为：SYBR Green Master Mix(诺唯赞,南京)10μL，上下游引物(10pmol/L)各0.4μL，cDNA模板1μL，RNase-free H2O补足余量。
反应程序：95℃30s；95℃10s，60℃30s，循环40次；95℃15s，60℃60s，95℃15s形成溶解曲线。
每个样品设置3个生物学重复及3个技术重复。
如图1所示，结果表明，处理组(滴加dsRNA)与对照组(滴加ddH2O)相比，假禾谷镰孢菌Fp487基因的表达量显著降低，因此，滴加Fp487基因的dsRNA对该基因具有明显的沉默效应。
3、滴注dsRNA对小麦茎基腐病菌生长发育的影响
叶片抑菌实验结果如图2、图3所示，盆钵抑菌实验结果如图4、图5所示，这些结果显示，各抑菌实验的处理组在滴注dsRNA后，小麦茎基腐病菌的侵染程度显著降低。根据各实验所得数据进行计算，叶片抑菌实验中，处理组(注射dsRNA)与对照组(注射ddH2O)相比，小麦茎基腐病菌侵染程度显著下降，达到约67％；盆钵抑菌实验中，未处理组的小麦状态正常，处理组(注射dsRNA)与对照组(注射ddH2O)相比，小麦茎基腐病菌侵染程度显著下降，达到约40％。
以上结果表明，Fp487基因在小麦茎基腐病菌侵染过程中起到重要作用，而Fp487基因的dsRNA能够沉默Fp487基因从而明显抑制小麦茎基腐病菌侵染。
在真菌中，Zn(II)2Cys6锌簇转录因子(transcription factors)可参与调节真菌的基础代谢、次级代谢、药物抗性及减数分裂等过程，在丝状真菌次级代谢过程中发挥着重要的调控作用。发明人课题组专门针对假禾谷镰孢菌进行研究，发现其中的Fp487基因属于Zn(II)2Cys6家族转录因子，影响真菌生长发育及分生孢子产生，显著影响致病性；通过实验证明，Fp487基因可作为RNA农药的靶标，用于小麦茎基腐病的防控。
本发明通过获得假禾谷镰孢菌Fp487基因设计dsRNA，利用RNAi技术抑制Fp487基因的表达，防控小麦茎基腐病菌的侵染，这可能是未来的新型防控小麦茎基腐病的方法之一。同时，现有技术合成dsRNA的主要手段是T7试剂盒，成本高，合成量低，不能大规模生产，本发明利用工程菌(大肠杆菌)进行体内合成dsRNA，成本低，效率高，可以实现靶标dsRNA的大规模的合成。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.假禾谷镰孢菌Fp487基因，其特征是，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述假禾谷镰孢菌Fp487基因的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取假禾谷镰孢菌CF14047菌株的菌丝，提取其总DNA；
第二步、以第一步获得的总DNA为模板，采用SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ IDNO.5所示的下游引物，通过PCR反应获得假禾谷镰孢菌Fp487基因。
3.由权利要求1所述假禾谷镰孢菌Fp487基因编码的蛋白，其特征是，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种用于防控小麦茎基腐病的基因片段，其特征是，该基因片段的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
5.一种用于防控小麦茎基腐病的dsRNA制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、以假禾谷镰孢菌CF14047菌株的总DNA为模板，或者以权利要求1所述假禾谷镰孢菌Fp487基因为模板；采用SEQ ID NO.6所示的上游引物和SEQ ID NO.7所示的下游引物，通过PCR反应获得PCR产物；
第二步、采用限制性内切酶NotⅠ和HindⅢ对L4440载体进行双酶切，获得线性化L4440载体；所述L4440载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
第三步、将第一步所得PCR产物与第二步所得线性化L4440载体以同源重组酶连接，获得重组连接产物；将重组连接产物转入工程菌感受态细胞中，经培养、检测后，继续培养含有正确重组质粒的细胞，然后从中提取出重组质粒；将重组质粒转化到表达型菌株中，经培养、验证后，将正确菌种予以保存；
第四步、将第三步所得菌种进行培养和诱导表达；之后，先从所得菌体中提取总RNA，再从总RNA中提取并纯化获得dsRNA。
6.根据权利要求5所述的dsRNA制备方法，其特征是，第一步中，上游引物序列中含有NotⅠ酶切位点，下游引物序列中含有HindⅢ酶切位点；第三步中，所述工程菌感受态细胞为E.coliDH5α，所述表达型菌株为E.coliHT115；第四步中，所述诱导表达采用的诱导物为IPTG，采用Trizol法提取总RNA；从总RNA中提取并纯化获得dsRNA的过程包括：向总RNA中加入RNase A并反应，加入DNaesⅠ并反应，加入由苯酚、氯仿、异戊醇混合而成的混合溶液，振荡后离心取上清，加入NaAC及核酸沉降剂，混合均匀，加入无水乙醇，混匀后离心弃上清，以预冷的70±2％乙醇洗涤后，离心收集沉淀，干燥后以无核酸酶水溶解，即得dsRNA。
7.根据权利要求6所述的dsRNA制备方法，其特征是，第三步的具体过程为：
将第一步所得PCR产物与第二步所得线性化L4440载体以同源重组酶连接，获得重组连接产物；将重组连接产物转入感受态细胞E.coliDH5α中，涂布于LB固体培养基平板上，在37℃培养箱中倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测，及琼脂糖凝胶电泳检测；将含有目标基因片段的单菌落进行测序分析，检测重组质粒序列的准确性；将鉴定正确的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜摇培12h；利用质粒DNA提取试剂盒提取重组质粒，以琼脂糖凝胶电泳检测；将重组质粒转化到表达型菌株E.coliHT115中，涂板，37℃培养箱中过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测及琼脂糖凝胶电泳检测验证，将正确菌种以等比例1：1加入50％甘油后予以保存；
第三步中，LB固体培养基由10g/L氯化钠、10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、12g/L琼脂粉、100μg/mL氨苄青霉素以及水制备而成；LB液体培养基由10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素以及水制备而成；
第四步的具体过程为：
将第三步所得菌种按1：100的比例接种于LB液体培养基中，在摇床37℃，200rpm下培养；当OD600＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃下诱导表达4～5h；第四步中，LB液体培养基由10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素、12.5μg/mL四环素以及水制备而成；
利用Trizol法提取菌体的总RNA；加入终浓度为1μg/mL RNase A和0.1μg/μL DNaesⅠ，分别在37℃下反应1h和30min，去除单链RNA和基因组DNA；加入等体积的由苯酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1混合而成的混合溶液，振荡100s以上，离心取上清；加入1/10样品体积的3M pH＝5.2NaAC溶液，加入4μL核酸沉降剂，混合均匀；加入750μL无水乙醇，充分混匀，离心弃上清；用预冷的70％乙醇洗涤2次，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsRNA；以琼脂糖凝胶电泳检测及分光光度计测定浓度后，于-80℃保存dsRNA。
8.一种用于防控小麦茎基腐病的dsRNA，其特征是，采用权利要求5至7任一项所述用于防控小麦茎基腐病的dsRNA制备方法制备获得。
9.权利要求8所述的dsRNA用于防控小麦茎基腐病的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征是，所述应用包括以下步骤：将dsRNA滴注于小麦茎基部以抑制假禾谷镰孢菌Fp487基因的表达。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117777262A (zh) * 2024-02-23 2024-03-29 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaALDHase基因在调控小麦茎基腐病抗性中的应用
CN117958260A (zh) * 2024-03-28 2024-05-03 中国农业科学院作物科学研究所 去甲氧基姜黄素的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070011775A1 (en) * 2004-12-21 2007-01-11 Edwards Allen Double-stranded RNA stabilized in planta
CN112126630A (zh) * 2020-10-14 2020-12-25 河南农业大学 用于防治小麦茎基腐病的病毒粒子及其防治小麦茎基腐病的方法
CN115725559A (zh) * 2022-10-25 2023-03-03 江苏省农业科学院 一种细胞壁合成相关蛋白ugma及其编码基因与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070011775A1 (en) * 2004-12-21 2007-01-11 Edwards Allen Double-stranded RNA stabilized in planta
CN112126630A (zh) * 2020-10-14 2020-12-25 河南农业大学 用于防治小麦茎基腐病的病毒粒子及其防治小麦茎基腐病的方法
CN115725559A (zh) * 2022-10-25 2023-03-03 江苏省农业科学院 一种细胞壁合成相关蛋白ugma及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALINE KOCH等: "An RNAi-Based Control of Fusarium graminearum Infections Through Spraying of Long dsRNAs Involves a Plant Passage and Is Controlled by the Fungal Silencing Machinery", PLOS PATHOGENS, 13 October 2016 (2016-10-13), pages 1 - 22 *
GARDINER, D.M.等: "Fusarium pseudograminearum CS3096 chromosome 1, whole genome shotgun sequence", GENBANK数据库, pages 031951 *
GARDINER, D.M.等: "hypothetical protein FPSE_00487 [Fusarium pseudograminearum CS3096]", GENBANK数据库, pages 009251882 *
YANG XIAOYUE等: "Zn(Ⅱ)2Cys6 Family Transcription Factor Fp487 Modulate the Growth, Development and Pathogenicity of Fusarium Pseudograminearum", 中国植物病理学会2023年学术年会论文集, pages 108 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117777262A (zh) * 2024-02-23 2024-03-29 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaALDHase基因在调控小麦茎基腐病抗性中的应用
CN117777262B (zh) * 2024-02-23 2024-06-11 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaALDHase基因在调控小麦茎基腐病抗性中的应用
CN117958260A (zh) * 2024-03-28 2024-05-03 中国农业科学院作物科学研究所 去甲氧基姜黄素的用途

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