CN110551702A

CN110551702A - 重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用

Info

Publication number: CN110551702A
Application number: CN201910716892.8A
Authority: CN
Inventors: 肖安风; 邵嫄; 茹毅; 张永辉; 翁惠芬; 杨秋明; 肖琼; 陈艳红
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2039-08-05
Also published as: CN110551702B

Abstract

本发明提供了一种重组塔宾曲霉单宁酶，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成。本发明还公开了编码该单宁酶的基因，含有该基因的表达载体、重组菌株；制备该单宁酶的方法以及该单宁酶的应用。根据本发明的实施例的重组塔宾曲霉单宁酶具有显著大于现有单宁酶的活性及热稳定性；根据本发明实施例的制备方法具有较高的单宁酶产率；根据本发明实施例的单宁酶能工业化量产没食子酸。

Description

重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用。

背景技术

单宁酶，又称单宁酰基水解酶(tannin acyl hydrolase，TAH，EC.3.1.1.20)，是一种用途广泛的生物催化剂，在生物转化中发挥重要的作用，在食品、污水处理、制革、制药，尤其是茶饮料处理方面具有广泛的应用价值，能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，解除单宁络合蛋白的效果。此外，FDA(美国食品及药品管理局)已经公布单宁酶为安全食品，同时日本也允许单宁酶应用于食品制造业。因此，近年来对单宁酶的研究备受关注，具有广阔的应用前景。

目前，工业化单宁酶的生产主要通过传统固态发酵和液态发酵两种方法，相比于液态发酵，固态基质中水不溶性成分高，为微生物尤其是丝状真菌提供了良好的附着位点，微生物生长环境良好，酶产量高且酶系丰富。但固态发酵存在一些不可避免的缺点，例如发酵过程中产生过多次级代谢产物，为后期纯化带来困难。基于此，利用毕赤酵母异源表达单宁酶可有效解决上述问题；与单宁酶发酵方式相比，利用异源表达系统生产单宁酶具有产量高、成本低、操作技术成熟、遗传背景清楚等优点。此外，构建异源表达载体时，利用高效强启动子对重组蛋白进行高效表达，能降低背景表达量，同时也可利用纯化标签(如His标签)解决纯化难题。因此，相比于传统发酵方式，利用异源表达系统进行外源蛋白的表达具有强大的优势。

然而，目前生产的单宁酶的酶活仍然较低，热稳定性也较差，无法用于工业化量产没食子酸。因而现有的单宁酶生产技术仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明的第一个目的在于提出一种重组塔宾曲霉单宁酶。

本发明的第二个目的是提出一种重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。

本发明的第三个目的是提出一种表达载体。

本发明的第四个目的是提出一种重组菌株。

本发明的第五个目的是提出一种制备重组塔宾曲霉单宁酶的方法。

本发明的第六个目的是提出重组塔宾曲霉单宁酶的用途。

在本发明的第一个方面中，根据本发明实施例，提供了一种重组塔宾曲霉单宁酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，该酶包括574个氨基酸。

根据本发明实施例的重组塔宾曲霉单宁酶，其具有较高的酶促活性，酶活为296.9U/mL，以及较好的热稳定性。

另外，在本发明的第二方面中，根据本发明实施例，提供一种重组塔宾曲霉单宁酶编码基因，其编码上述的重组塔宾曲霉单宁酶，且其包含下列核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明基于PCR的方法分离克隆了塔宾曲霉单宁酶基因，DNA全序列分析结果表明，重组塔宾曲霉单宁酶基因全长1725bp。

在本发明的第三方面中，根据本发明实施例，提供了一种表达载体，其包含上述重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。

在本发明的第四方面中，根据本发明实施例，提供了一种重组菌株，其包含上述重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。

在本发明的第五方面中，根据本发明实施例，提供了一种制备重组塔宾曲霉单宁酶的方法，其包括下列步骤：

S1、用上述的表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；

S2、培养重组菌株，诱导表达出重组塔宾曲霉单宁酶。

根据本发明的进一步实施例，所述步骤S1包括：

S11、构建表达载体pPIC9K-Tan；

S12、将表达载体pPIC9K-Tan线性化；

S13、将线性化的表达载体pPIC9K-Tan通过电击转化法转化至毕赤酵母感受态细胞内；

S14、将步骤S13获得的毕赤酵母感受态细胞利用G418抗性筛选，得重组菌株。

根据本发明的进一步实施例，所述步骤S2中诱导重组塔宾曲霉单宁酶表达采用甲醇诱导罐进行诱导表达，所述甲醇诱导罐诱导表达包括：甘油分批发酵阶段、饥饿阶段及甲醇流加阶段。

根据本发明实施例，本发明通过设计了一对特异引物，将编码塔宾曲霉单宁酶成熟蛋白(其编码的氨基酸序列表如SEQ ID NO：1所示)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：2所示)用PCR方法从塔宾曲霉基因中扩增出来，克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K，构建表达载体pPIC9K-Tan，采用电击转化毕赤酵母GS115获得重组菌株，经甲醇发酵诱导表达出酶活高和热稳定好的重组塔宾曲霉单宁酶。

在本发明的第六方面中，根据本发明实施例，本发明还提出了上述重组塔宾曲霉单宁酶在没食子酸生产中的应用，将上述重组塔宾曲霉单宁酶用在五倍子单宁酸提取过程中进行酶法处理，生产没食子酸，相对于酸法来说，更加环保、省时、节能。

根据本发明的进一步实施例，生产没食子酸包括：取5g粉碎后的五倍子置于烧杯中，加入250mL蒸馏水，调pH至6.5-7.0，而后加入重组单宁酶粗酶液，维持pH至6.5-7.0，于50℃水浴浸提75min，得没食子酸。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为提取塔宾曲霉基因组结果；

图2为从塔宾曲霉基因中PCR扩增的单宁酶基因结果；1：PCR扩增的单宁酶基因；M：1kb DNAmaeker；

图3是重组克隆质粒pMD19T-Tan；

图4是线性化表达载体pPIC9K-Tan；

图5是线性化表达载体pPIC9K-Tan鉴定电泳结果；

图6是整合了表达载体pPIC9K-Tan的重组毕赤酵母GS115菌株PCR鉴定电泳结果a：特异性引物验证；b：通用引物验证；

图7是重组毕赤酵母GS115菌株经甲醇诱导表达产重组塔宾曲霉单宁酶曲线图；

图8是重组塔宾曲霉单宁酶的最适反应温度曲线；

图9是重组塔宾曲霉单宁酶的50℃和60℃的热稳定性曲线图；

图10是重组塔宾曲霉单宁酶的70℃的热稳定性曲线图；

图11是重组塔宾曲霉单宁酶的最适pH曲线图；

图12是重组塔宾曲霉单宁酶的酸碱稳定性曲线图；

图13是酸法提取没食子酸曲线图；

图14是重组塔宾曲霉单宁酶酶法提取没食子酸曲线图；

图15是料液比对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；

图16是加酶量对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；

图17是pH对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；

图18是温度对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；

图19是提取时间对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；

图20是单宁酶Ao-Tan的最适反应温度曲线；

图21是单宁酶Ao-Tan的热稳定曲线；

图22是单宁酶Ao-Tan的最适pH曲线；

图23是单宁酶Ao-Tan的酸碱稳定曲线。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

单宁酶

根据本发明的一个实施例，提供了一种重组塔宾曲霉单宁酶，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。与NCBI上公布的单宁酶基因(XM_001401772)所编码的单宁酶相比，本发明的重组塔宾曲霉单宁酶的碱基序列有133个不同，其相似性达92％；氨基酸序列相似性达96.86％，不相同的氨基酸有18个。将本发明的单宁酶与单宁酶(XM_001401772)相比，具有更高的单宁酶活性和更好的热稳定性，使得本发明的单宁酶可用于工业化量产没食子酸。

编码基因

在本文中所使用的术语“基因”可以包括DNA或者RNA，它们可以是单链或者多链的。本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的基因能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的基因编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知方法对基因进行修饰，以增强本发明编码基因在体内的活性或者存活期。

根据本发明的实施例，提供了一种重组塔宾曲霉单宁酶的编码基因，其可以编码一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本领域技术人员可以根据遗传密码表，基于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，设计多种基因，进而获得氨基酸序列如SEQID NO：1所示、具有单宁酶活性的蛋白质。

表达载体

本文中所使用的术语“表达载体”是指含有有效连接到控制元件的基因的构建体。所述控制元件能够影响基因在适当宿主中的表达。这类所述的控制元件包括影响转录的启动子，控制转录的可选操纵子序列，编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。本发明的表达载体包括质粒、基因组、线粒体DNA、病毒或核酸片段。根据本发明的实施例，采用pPIC9K-Tan质粒作为表达载体，由此便于在宿主例如大肠杆菌中表达期望的蛋白质(单宁酶)。此处所使用的术语“质粒”通常指一种环状双链(ds)DNA构健体，其在许多细菌和真核细胞中都能够形成染色体外自主复制遗传元件。

根据本发明实施例，提供了一种表达载体，其包含根据本发明实施例的编码重组塔宾曲霉单宁酶的基因，其中所编码的重组塔宾曲霉单宁酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在本发明的一个具体实施例中，所述表达载体包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。当然，本发明的表达载体也可以包含其他编码单宁酶的核苷酸。

重组菌株

在本文中，所采用的术语“重组菌株”是指接受了外源遗传物质(质粒等)使遗传特性发生了改变的宿主细胞。根据本发明的实施例，提供一种重组菌株，其能够表达具有SEQID NO：1所示氨基酸序列的单宁酶。根据本发明的一些具体实施例，采用毕赤酵母作为宿主细胞，这样便于转化宿主细胞，以及方便回收和纯化所表达的重组塔宾曲霉单宁酶。

在本发明中使用的术语“转化”应作广义理解，可以是指任何能够使得宿主细胞表达外源基因的方法。可以采用任何传统的方法，将表达载体导入宿主细胞中，例如电机转化法。经过转化体转化的宿主细胞中的载体可以以游离地形式存在，即表达单宁酶的基因在表达载体上主要由表达载体上携带的表达控制元件进行表达单宁酶。根据本发明的实施例，表达重组塔宾曲霉单宁酶的基因也可以整合到宿主细胞的基因组中，由宿主细胞的基因组控制其表达。在宿主细胞中含有多拷贝的游离型的载体。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1塔宾曲霉DNA提取

用Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒(购自杭州博日科技有限公司)提取塔宾曲霉基因组DNA。使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。

塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 2651。

实验方法：

1)将抽滤好的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)刮下，放入预冷的研钵，加入液氮充分研磨成粉末。

2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700uL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3)加入700uL氯仿(三氯甲烷)，充分混匀，12000rpm离心5min。

4)将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700uL缓冲液GP2，充分混匀。

5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rmp离心1min，弃掉废液。

6)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入600uL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)重复操作步骤7)。

9)将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。超净工作台放置，大风吹30min。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200uL洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

11)用酶标仪检测DNA浓度以及纯度，确定基因组是否提取成功。结果如下表：

组别	1	2	3	4
					OD<sub>260</sub>	0.009	0.024	0.003	0.001
OD<sub>280</sub>	0.006	0.015	0.004	0.003
					OD<sub>260</sub>/OD<sub>280</sub>	1.381	1.581	0.821	0.406
浓度ng/μL	8.874	24.134	3.286	1.351

取上表中第1、2组进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如下图1所示，1和2泳道是提取的2管塔宾曲霉基因组DNA，都达到15000bp，且条带单一，提取效果理想，可用于后续实验。

实施例2单宁酶基因的PCR扩增

根据NCBI上公布的单宁酶基因(XM_001401772)序列信息，利用Premier公司的Primer Premier 5设计引物，引物序列如下：

Tan-F：5’-ATGCGCTCACCCACTCGAGTTTCC-3’；(SEQ ID NO：3)

Tan-R：5’-CTAGTACACAGGCATGGGAACCGCA-3’；(SEQ ID NO：4)

以实施例1获取的塔宾曲霉基因组DNA作为模板，对单宁酶基因进行扩增。反应总体积为50μL，在0.2mL PCR管中加入下列成分：

混匀，瞬时离心，反应条件为：94℃变性5min，然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸4min，28个循环后72℃保温5min，4℃保存。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图2所示，目标产物条带在1500bp至2000bp之间，约1700bp，且为单一条带，说明单宁酶基因的PCR扩增是成功的。

实施例3重组克隆质粒pMD19T-Tan的构建

1)将实施例2获得的塔宾曲霉单宁酶基因扩增产物片段两端加ploy A

反应总体积为20μL，在0.2mL PCR管中加入下列成分：

ddH2O	3.75μL
		dNTPs	1μL
单宁酶基因扩增产物片段	15μL
		rTaq DNA polymerase	0.25μL

混匀，瞬时离心，反应条件：72℃反应30min，4℃保存。

2)单宁酶基因扩增产物与克隆载体的连接

将步骤1)获得的单宁酶基因扩增产物与pMD19-T Simple vector(购自Takara公司)连接构建重组克隆质粒。连接反应按照pMD19-T Simple vector连接试剂盒提供的说明书进行。在0.2mL PCR管中依次加入下列成分：

pMD19-T Simple vector	1μL
		Tan基因片段(两端加ploy A)	4μL
Ligation Solution I	5μL

混匀，瞬时离心，16℃连接4h，获得连接产物，备用。

3)大肠杆菌化学转化感受态细胞的制备(用Takara公司的试剂盒)

从LB平板(在胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g中，加入蒸馏水900mL，充分溶解后，定容至1L，121℃高压灭菌20min)上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于5mL LB液体培养基(在胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g中，加入蒸馏水900mL，充分溶解后，定容至1L，121℃高压灭菌20min)中，37℃振荡培养12h。

将上述培养物以1：100的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5左右。

将菌液转入4℃预冷的离心管中，冰上放置10min，4000rpm 4℃离心10min，弃去上清。

用100μL预冷的Solution A溶液(试剂盒内配置的溶液)轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，4000rpm 4℃离心10min。

弃去上清，用100μL预冷的Solution B溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。4000rpm4℃离心10min，即成感受态。

冰上将感受态细胞分装成50μL/管，-80℃保存。

4)重组克隆质粒的转化

从-80℃冰箱中取感受态细胞E.coli DH5α，迅速冰浴解冻。取10μL连接产物加入50μL感受态细胞E.coli DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴中热击90sec，再迅速冰浴3min。之后，加入1mL无抗LB液体培养基，混匀，37℃金属浴2h，3000rpm冷冻离心1min，吸取部分上清，留200μL，吸打混匀。取100μL涂布于含有氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)的LB平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃下培养12-16h，得如图3所示的重组克隆质粒pMD19T-Tan。

5)重组克隆质粒pMD19T-Tan阳性菌株的鉴定

重组质粒鉴定的方法很多，本试验选用了菌液PCR扩增和测序方法。分别挑取几个单克隆质粒接种于5mL的液体LB培养10h。以菌液为模板，反应总体积为20μL，在0.2mL PCR管中依次加入下列成分：

ddH2O	15.7μL
		10×PCR buffer	2μL
dNTPs	0.4μL
		Tan-F	0.3μL
Tan-R	0.3μL
		菌液	1μL
rTaq DNA polymerase	0.3μL

混匀，瞬时离心，反应条件：94℃变性5min；94℃变性30Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸4min，28个循环；接下来72℃保温5min，4℃保存。挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌株进行核苷酸测序，由厦门铂瑞生物科技有限公司完成。

6)测序结果分析：从塔宾曲霉基因组中克隆到的单宁酶基因，其成熟蛋白基因序列为1725bp，编码574个氨基酸。在NCBI中采用Blast进行序列比对和单宁酶同源性分析。核苷酸序列相似性最高为98％(XM_025527764.1)，氨基酸序列相似性最高为99％(GAQ37839.1)。

实施例4表达载体pPIC9K-Tan构建

1)设计去信号肽双酶切引物

由于信号肽会对毕赤酵母异源表达造成干扰，因此利用SignalP 4.1 Server信号肽预测服务器对实施例1获得的单宁酶碱基序列进行在线信号肽预测，重新设计引物通过PCR扩增去除信号肽，引物序列如下(划线部分为酶切位点，划线前面为保护碱基)：

SMQ P-F：5’-CGCCCTAGGGCAACTCCTTCCACGTTGGCAGAG-3’；(SEQ ID NO：5)保护碱基为CGC，酶切位点为AvrⅡ。

SMQ P-R：5’-ATTTGCGGCCGCCTAGTACACAGGCATGGGAACCGC-3’；(SEQ ID NO：6)保护碱基为ATTT，酶切位点为NotⅠ

2)重组pMD19T-Tan质粒提取

挑选测序正确的阳性克隆进行pMD19T-Tan质粒提取，方法按照小量质粒提取试剂盒(购自Takara公司)提供的操作步骤进行。

3)待插入的单宁酶基因片段的制备：

以pMD19T-Tan重组质粒作为模板，反应总体积为15μL，在0.2mL PCR管中加入下列成分：

ddH2O	4.5μL
		SMQ P-F	1μL
SMQ P-R	1μL
		pMD19T-Tan重组质粒	1μL
pfu DNA polymerase	7.5μL

混匀，瞬时离心，反应条件：94℃变性5min；94℃变性30Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸4min，28个循环；接下来72℃保温5min，4℃保存。

4)PCR产物的回收与纯化

用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购自Takara公司)，操作按产品说明书提供的步骤进行。

5)PCR产物双酶切及其回收

根据设计的上下游引物所带的酶切位点，选用AvrⅡ和NotⅠ对所回收纯化的单宁酶基因PCR产物进行双酶切，20μL酶切体系，如下：

ddH2O	12μL
		AvrⅡ	1μL
NotⅠ	1μL
		回收纯化PCR产物	5μL
10×H Buffer	2μL

混匀，离心，37℃过夜酶切。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。在紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，放入1.5mL离心管中。

6)双酶切产物的回收与纯化：用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购自Takara公司)，操作按产品说明书提供的步骤进行。

7)毕赤酵母表达载体pPIC9K(购自Invitrogen公司)双酶切及其回收

根据构建表达载体时选用的酶切位点AvrⅡ和NotⅠ，对pPIC9K进行双酶切，20μL酶切体系，如下：

ddH2O	1μL
		AvrⅡ	1μL
NotⅠ	1μL
		pPIC9K	15μL
10×H Buffer	2μL

混匀，离心，37℃过夜酶切。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果：在紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，放入1.5mL离心管中，按照小量DNA片段快速胶回收试剂盒产品说明书提供的步骤进行双酶切产物的回收与纯化。

8)酶切片段与酶切载体的连接

将经AvrⅡ和NotⅠ双酶切的单宁酶基因，插入到经同样双酶切的表达载体pPIC9K中，构建成表达载体pPIC9K-Tan。连接体系如下：

ddH2O	5μL
		T4DNA连接酶	1μL
T4Buffer	2μL
		Tan双酶切产物	8μL
双酶切线性化pPIC9K	4μL

混匀，离心，16℃连接20min；得如图4所示的表达载体pPIC9K-Tan。

9)连接产物(表达载体pPIC9K-Tan)转入大肠杆菌感受态细胞中扩增获得多拷贝数：

从-80℃冰箱中取实施例3的感受态细胞E.coli DH5α，迅速冰浴解冻。取连接产物加入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，冰浴30min，42℃热击90s，取出后立即冰浴2min，加入1mL无抗LB培养基，37℃金属浴，300rpm摇1h，3000rpm冷冻离心1min，吸出一部分浓缩。浓缩后涂氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)的LB平板上，于37℃培养12-16h，筛选阳性转化子。

10)对筛选的阳性转化子进行菌液PCR和测序验证：

将挑选的阳性转化子放入带氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养过夜，用菌液进行PCR，然进行凝胶电泳分析。体系如下：

混匀，瞬时离心，反应条件：94℃变性5min；94℃变性30Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸4min，28个循环；接下来72℃保温5min，4℃保存。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果：在紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，放入1.5mL离心管中，按照小量DNA片段快速胶回收试剂盒产品说明书提供的步骤进行PCR产物的回收与纯化。核苷酸测序，由厦门铂瑞生物科技有限公司完成。

实施例5表达载体pPIC9K-Tan转化毕赤酵母GS115

1)表达载体pPIC9K-Tan的提取

挑选测序正确的阳性克隆进行pPIC9K-Tan质粒提取，方法按照小量质粒提取试剂盒(购自Takara公司)提供的操作步骤进行。

2)单酶切线性化表达载体pPIC9K-Tan

用限制性内切酶SalⅠ对表达载体pPIC9K-Tan单酶切线性化，体系如下：

ddH2O	37μL
		10×Q Green Buffer	5μL
表达载体pPIC9K-Tan(150ng/μL)	7μL
		Q Cut SalⅠ	1μL

混匀，瞬时离心，反应条件：37℃反应1h。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定，结果如图5所示，从图中可以看到，对照组，即未经过单酶切的质粒在电泳图上呈现两条带，这是因为环状的质粒在溶液中有不同的存在形式(线性、超螺旋和环状)导致的，1、2、3、4是实验组，经过单酶切线性化得到了单一条带，这表明实验组的质粒被完全线性化。

3)毕赤酵母GS115(购自北京华越洋生物科技有限公司)感受态细胞制备：

将存放于-80℃保种的GS115菌液在YPD平板上划线，在30℃培养箱中倒置培养2-3天。

从平板上挑取单菌落置于10mLYPD液体培养基中，30℃，200rpm培养18-20h。

0.1％接种量接种至100mLYPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜，至OD₆₀₀达到1.3-1.5，取出置于冰上10min，使之完全冷却至0℃。

在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。

用40mL预冷的超纯水轻轻重悬菌体，在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。40mL预冷的超纯水：先加10mL吸打混匀，再补足至40mL。

用20mL预冷的超纯水轻轻重悬菌体，在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。20mL预冷的超纯水：先加10mL吸打混匀，再加10mL。

用1mL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液轻轻重悬菌体，在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。1mL预冷的超纯水：每个50mL离心管加1mL，分装到2个1.5mL EP管中。

用300uL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液轻轻重悬菌体，置于冰上，当天使用。300uL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液：先加300uL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液轻轻重悬菌体，加入第二管中，吸打混匀，不要有气泡。

4)线性化表达载体pPIC9K-Tan电转化毕赤酵母GS115感受态细胞：

取80uL毕赤酵母GS115感受态细胞与线性化回收的表达载体pPIC9K-Tan混合均匀，放入0.2cm的电击杯，水浴5min。(设置一个对照，即只加80uL毕赤酵母感受态细胞)。

擦干水汽，置于电转仪中，设置电转条件(1500V，fungi，pic)进行电击。

立即加入1mL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液，将混合液转移到1.5mL灭菌离心管中，置于30℃静置培养2h。然后4℃，3000r/min下，离心5min，弃去400uL上清，吸打混匀。

吸取200uL菌液涂于MD平板上，在30℃培养箱中倒置培养2-3天，观察单菌落生长情况。

5)用G418抗性平板筛选阳性转化子：

从MD平板上挑选单菌落点于YPD(已加入G418抗性)平板上，平板底部用直尺划线，分成不同的区域以方便点板。放置在30℃恒温培养箱倒置培养2天。

6)挑选阳性转化子于试管培养并进行破壁菌液PCR并送测序：

将挑选的阳性转化子放入YPD液体试管(5-7mL)中，培养18h。取1mL菌液于1.5mL离心管中，4℃，12000rpm离心2min，去除上清。

加入500uL毕赤酵母破壁缓冲液重悬沉淀，4℃，12000rpm离心2min，去除上清。

加入20uL毕赤酵母破壁缓冲液重悬沉淀，沸水浴10min，冰上放置10min，4℃，12000rpm离心2min，将上清(即为PCR所用模板)转移到一个新的离心管中，备用。破壁菌液PCR体系如下(特异性引物)：

破壁菌液PCR体系如下(通用引物)：

ddH2O	4.5μL
		3′Aox	1μL
5′Aox	1μL
		破壁菌液	1μL
预混rTaq DNA polymerase	7.5μL

PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30Sec，62℃退火30Sec，72℃延伸4min，28个循环；接下来72℃保温5min，4℃保存。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定，结果如图6所示，(a)为特异性引物得到的产物电泳图，(b)为通用引物3′Aox/5′Aox得到的产物电泳图，从图中可以看出所挑选的阳性转化子条带在1500至2000bp之间，都符合要求。阳性转化子的核苷酸测序，由厦门铂瑞生物科技有限公司完成。

7)重组毕赤酵母GS115的保种

YPD液体试管(5-7mL)中，培养18h的上述转化获得的重组毕赤酵母GS115，然后取700μL加入1.5mL的离心管中，并加入300μL 80％的甘油，放在-80℃冰箱保种。

8)诱导表达

取甘油保种的重组毕赤酵母GS115菌液200uL接种到7mL YPD液体试管中，培养18-24h至OD₆₀₀值至3.0-6.0(5.0最佳)。1％接种量转接至BMGY培养基中。30℃180rpm培养16-18h，从摇床中取出，沉降5-6h，倒掉上清液，将底部的菌体洗入BMMY培养基中并在BMMY培养基中加入500uL甲醇作为诱导物进行诱导产酶。培养一定天数后离心取上清得到粗酶液。

实施例6发酵罐上诱导表达

罐上发酵培养基：85％磷酸80.1mL，CaSO₄ 2.79g，K₂SO₄ 54.6g，KOH 12.39g，MgSO₄·7H₂O 44.7g，甘油120g，酵母膏15g，蛋白胨15g，消泡油3mL，溶解后定容至3L，注入发酵罐中，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。用于毕赤酵母的培养。

(1)将筛选得到的重组菌株GS115接种于YPD培养基中进行活化，30℃，250rpm培养16-18h。

(2)将活化后的菌种按1％的接种量接种于YPD种子培养基内，30℃，250rpm培养16-18h，得到150mL的种子液。

(3)配制3L发酵培养基，加入发酵罐灭菌，冷却后加入微量元素PTM 13.2mL，在罐上用氨水调整pH为5.2。

(4)甘油分批发酵阶段：于30℃和溶解氧(DO)>40％下发酵培养(转速：600rpm；通气量：4L)，直至培养基中甘油耗尽(表现为DO迅速回升)，补加甘油至菌体量达到180mg/mL。

(5)饥饿阶段：甘油流加培养至菌体达到所需密度后，停止补加甘油，溶氧(DO)迅速回升，此时不添加碳源，保证菌体饥饿状态30min，以避免影响菌体对甲醇的利用。

(6)甲醇流加阶段：饥饿30min后，将发酵温度调整为至28℃，pH维持在5.0左右，开始甲醇诱导阶段。诱导前12h，甲醇(含1.2％PTM)按3mL/L/2h添加；经12h诱导后，甲醇按3mL/L/h添加，诱导四天(96h)后，可以获得发酵的重组单宁酶粗酶液。

(7)甘油补加阶段每隔8h取样测定生物量，甲醇诱导阶段每隔8h取样测定酶活力及生物量，结果如图7所示，随着诱导时间的延长，酶活力呈显著增长的趋势，在第80h到达296U/mL。而生物量则增长较为缓慢80h只增长了约60mg/mL。

(8)重组单宁酶活性测定

1)取空白管、对照管、测试管，各加入0.25mL的底物没食子酸丙酯(0.01mol/L)。

3)空白管中加入pH 5.0的柠檬酸缓冲液0.25mL，测试管中加入经稀释一定倍数的重组单宁酶粗酶液0.25mL，对照管中加入经沸水浴灭活的重组单宁酶酶液0.25mL，所有试管置于30℃水浴5min。

4)三支试管中均加入的6.67g/L甲醇绕丹宁溶液0.3mL，所有试管置于30℃水浴5min。

5)三支试管均加入0.7mol/LKOH 0.2mL，所有试管置于30℃水浴5min。

6)所有试管中加入蒸馏水4mL，振荡均匀后30℃水浴10min。

7)所有试管在520nm处以蒸馏水为空白测吸光值，测三组平行，结果取算术平均值。

8)将30℃条件下每分钟产生1μmol没食子酸所需要的酶量定义为一个酶活单位U。

实施例7重组塔宾曲霉单宁酶的最适反应温度及热稳定性测定

最适反应温度：保持底物添加量为0.25mL，与0.25mL重组塔宾曲霉单宁酶酶液混匀，使反应体系为0.5mL，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下反应5min，测定酶活力。以最高酶活力为100％，灭活10min的酶液为空白对照。结果如图8所示，该重组单宁酶的最适温度是70℃，当温度高于或低于70℃时，酶活都有所下降。

热稳定性：重组塔宾曲霉单宁酶酶液在50、60、70℃条件下处理一段时间后，在30℃，pH＝5.0条件下测定酶活力。以最高酶活力为100％，灭活10min的酶液为空白对照，温度稳定性结果见图9和图10，在70℃时，酶活随时间的增加降低很快，仅仅30min就会完全失活；在60℃时，酶活稳定性较强，即使维持32h，活力依然保持100％以上；在50℃时，活力保持不断上升的趋势，维持32h活力会升高约34％；使得该酶可用于工业化量产没食子酸，工业化量产没食子酸的温度较高，需酶具有较好的热稳定性。

实施例8重组塔宾曲霉单宁酶的最适反应pH及酸碱稳定性测定

最适pH：将酶液用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液稀释到合适的倍数后，取0.25mL与等体积底物(用同样缓冲液配置)混匀，在30℃下测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，不同pH条件下灭活10min的酶液为空白对照。结果如图11所示，在pH值较低时，重组单宁酶的活力也很低，而pH值过高也会影响其活力；当pH在6时，重组单宁酶活力达最大值，说明近中性偏酸对重组单宁酶的活力的影响是有利的；而过酸或过碱条件都会显著影响重组单宁酶的酶活，特别是当pH值在9时，酶活力基本丧失。

pH稳定性：将酶液用pH 3.0、5.0、7.0的缓冲液稀释到合适的倍数后4℃条件下，放置24h、48h、72h、96h、120h，取0.25mL与等体积底物混匀，在30℃下测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，不同pH条件下灭活10min的酶液为空白对照。结果如图12所示，在pH为3时，放置120h后其酶活力残留依然有约80％；在pH为5时，放置120h后其酶活力残留依然有约82％；在pH为7时，放置120h后其酶活力残留依然有约86％。这表明该重组单宁酶的pH稳定性较好，pH对其稳定性的影响较小，有利于其长期储存。

实施例9重组塔宾曲霉单宁酶在生产没食子酸中的应用

提取工艺：

(1)将五倍子用粉碎机磨碎，过60目筛，得五倍子粉末。

(2)取5g五倍子粉末置于烧杯中，加入250mL蒸馏水调pH至6.5-7.0，而后加入重组塔宾曲霉单宁酶粗酶液(每克粉末加入酶液1280U)，维持pH至6.5-7.0。

(3)烧杯于50℃水浴浸提75min，浸提过程中每隔15min取样，反应过程中不断调节pH至6-7之间。

(4)将浸提后的溶液于7000rpm下，离心1min，取上清稀释一定倍数，取样测没食子酸含量，得没食子酸。

结果如图13和图14所示，酶法提取五倍子单宁转化没食子酸，其提取率能达到48.5％，相较于酸法的48.3％来说更高。提取效果相对于酸法来说更加环保，省时，节能。

实施例10料液比对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响

方法：称取0.5g五倍子粉末分别溶于10mL、15mL、20mL、25mL、30mL蒸馏水中，调pH至6.5-7.0。加入5mL活力为160U/mL的单宁酶，维持pH在6.5-7.0之间，50℃水浴提取75min。每个料液比做3个平行。

结果如图15所示，料液比过低不利于没食子酸的转化提取，当料液比为1:50时达到最大转化提取率64％，相比于没优化的提高了16％，表明优化料液比是很有必要的。料液比在1:50的时候明显高于1:30以及1:40，这说明提高料液比有利于五倍子单宁的提取和没食子酸的转化。继续提高料液比没食子酸的生产量和提取率不在有明显的变化，这说明料液比对提取效率的影响是有极限的，在极限范围内，提取效率会随着料液比的增大而增大，当超出极限范围之后，其对提取效率的影响微乎其微。

实施例11加酶量对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响

方法：称取0.5g五倍子粉末分别溶于25mL、24mL、23mL、22mL、21mL、20mL、19mL、18mL蒸馏水中，调pH至6.5-7.0。分别加入0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL活力为160U/mL的单宁酶，使加酶量分别为0、160、320、480、640、800、960、1120(U)。维持pH在6.5-7.0之间，50℃水浴提取75min。每个加酶量做3个平行。

结果如图16所示，加酶量对提取转化有着很大影响，不加酶的时候提取效率很低，加入160U的酶，则提取效率提升了1倍；加入640U的酶时，提取效率提高了2倍多。没食子酸的产率在加酶量为800U时达到最大值64.5％。但是其于加酶量640U的效果相差甚微，所以从节约成本的角度考虑，加酶量为640U最佳。

实施例12pH对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响

方法：称取0.5g五倍子粉末溶于21mL蒸馏水中，调pH分别为4.0-5.0、5.0-6.0、6.0-7.0、7.0-8.0、8.0-9.0。加入4mL活力为160U/mL的单宁酶，维持上述pH范围的稳定，50℃水浴提取75min。测没食子酸浓度，每个pH做3个平行。

结果如图17所示，pH对没食子酸的转化提取有显著的影响，且在pH为6-7时达最大值，提取率约73％，增大或降低pH会使提取率显著下降，当pH8-9时，提取率只有16％，这可能是过高的pH影响了单宁酶的活力，从而使生成没食子酸的前体物质无法高效的转化为没食子酸，影响了没食子酸的转化提取率。

实施例13温度对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响

方法：称取0.5g五倍子粉末溶于21mL蒸馏水中，调pH为6.0-7.0。加入4mL活力为160U/mL的单宁酶，维持上述pH范围的稳定，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃水浴提取75min。测没食子酸浓度，每个温度做3个平行。

结果如图18所示，温度也显著影响着没食子酸的转化提取率，当温度较低为40℃时，没食子酸的转化提取率仅为50％；而当温度提高到50℃时，提取率达到了约74％，提高了24％；继续提高温度，提取率没有明显变化，这可能是在50-60℃温度范围内，酶的活力趋于稳定，且在短时间内(75min)不会发生显著变化，所以没食子酸的转化提取率也不会发生显著改变。

实施例14提取时间对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响

方法：称取0.5g五倍子粉末溶于21mL蒸馏水中，调pH为6.0-7.0。加入4mL活力为160U/mL的单宁酶，维持上述pH范围的稳定，50℃水浴分别提取45min、60min、75min、90min、105min。测没食子酸浓度，每个时间做3个平行。

结果如图19所示，随着时间的延长，提取的效果会变好，但最终趋于稳定在75％左右，这表明提取已经到了一种饱和，继续增加提取时间不能提高没食子酸的产率。说明溶于水中的单宁酸以及没食子酸衍生物的多酚类物质已经大部分被单宁酶水解了，剩余的小部分由于其结构问题很难被单宁酶水解，或水解效率很慢，所以在75min之后没食子酸的量还会有些许的上升。

实施例15重组塔宾曲霉单宁酶与文献来源单宁酶Ao-Tan(文献：Yu X W and Li YQ,2008)的酶学特性进行比较

详细描述如下：

(1)最适温度测定：

保持底物添加量为0.25mL，与0.25mL单宁酶酶液混匀，使反应体系为0.5mL，分别在40、50、60、70、80、90℃条件下反应5min，测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，灭活10min的酶液为空白对照，研究单宁酶的最适反应温度。本发明的重组塔宾曲霉单宁酶的最适反应温度为70℃(图8)，单宁酶Ao-Tan的最适反应温度为70℃(图20)。

(2)温度稳定性测定：

单宁酶酶液在50℃、60℃、70℃条件下处理一段时间后，在30℃，pH＝5.0条件下测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，灭活10min的酶液为空白对照。本发明的重组塔宾曲霉单宁酶在70℃下处理30min后，会完全失去活力，50℃和60℃保温32h不会对酶活力造成显著性影响(图9)；单宁酶Ao-Tan在70℃的水浴环境中处理10min后，酶活力剩余10％左右，而在60℃和50℃的半衰期分别为8min和20min(图21)。以上结果表明，本发明的重组塔宾曲霉单宁酶在高温下具有更好的耐受性，其良好的热稳定性在工业高温加工过程中具有更大的应用潜力。

(3)最适pH测定

将酶液用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液稀释到合适的倍数后，取0.25mL与等体积底物混匀，在30℃下测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，不同pH条件下灭活10min的酶液为空白对照，研究单宁酶的最适pH。本发明的重组塔宾曲霉单宁酶的最适反应pH为6.0(图11)；单宁酶Ao-Tan最适反应pH为5.0(图22)。

(4)pH稳定性测定

将酶液用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液稀释后，4℃放置24h，在30℃条件下测定酶活力，以最高酶活力为100％，不同pH条件下灭活10min的酶液为空白对照，研究单宁酶的pH稳定性。本发明的重组塔宾曲霉单宁酶在酸性及中性范围内活力相对稳定，残余酶活80％以上(图12)。单宁酶Ao-Tan在pH为3.0时，残余酶活为30％；在pH范围3.0-7.0之间，残余酶活60％以上；但当pH达到9.0时酶活力基本丧失(图23)。综上，An-Tan具有更宽泛的pH稳定性范围，在工业应用上具有相对优势。

实施例16重组塔宾曲霉单宁酶酶学性质比较

据文献报道，不同来源的单宁酶的酶学性质存在差异。微生物来源的单宁酶温度稳定范围一般在30-60℃之间；最适温度大多为20-60℃。有关单宁酶酶学性质数据列于表1，对比表1中的大多数真菌来源的单宁酶，本发明的重组塔宾曲霉单宁酶最适温度高于绝大多数已报道的单宁酶，并且其在高温条件下具有非常好的稳定性，此特性使其在食品加工中有很大应用价值。

表1不同来源单宁酶酶学性质

注：NG表示文献中未给出的数据。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 集美大学

<120> 重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用

<130> 2019

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Ser Pro Thr Arg Val Ser Ile Ala Ile Thr Ala Leu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Asn Ala Ala Thr Pro Ser Thr Leu Ala Glu Leu Cys Thr Asp

20 25 30

Ser Val Val Lys Ala Ala Leu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Gln Gly Ile

35 40 45

Thr Ile Asp Ser Asp Ser Val Thr Thr Glu Val Val Thr Asn Ser Ser

50 55 60

Phe Ser Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Ala Thr Ile Asp Tyr Cys Asn Val

65 70 75 80

Thr Phe Ala Tyr Ser His Asp Gly Ile Asp Gly Asp Gln Val Leu Leu

85 90 95

Glu Ile Trp Leu Pro Ala Pro Thr Asp Phe Lys Asn Arg Trp Leu Ser

100 105 110

Thr Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Asp Gln Ser Leu Pro

115 120 125

Gly Gly Val Met Tyr Gly Ala Ala Ser Gly Met Thr Asp Gly Gly Phe

130 135 140

Gly Gly Phe Ser Asn Asn Ala Asp Thr Ala Met Leu Leu Ala Asn Gly

145 150 155 160

Thr Leu Asn Tyr Glu Thr Leu Tyr Met Phe Ala Tyr Lys Ala His Arg

165 170 175

Glu Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Leu Thr Arg Asn Val Tyr Gly Met

180 185 190

Ser Asp Ser Asp Lys Leu Tyr Ala Tyr Tyr Gln Gly Cys Ser Glu Gly

195 200 205

Gly Arg Glu Gly Trp Ser Gln Val Gln Arg Phe Gly Asp Glu Trp Asp

210 215 220

Gly Ala Ile Ile Gly Ala Pro Ala Phe Arg Trp Ser Phe Gln Gln Thr

225 230 235 240

Gln His Leu Tyr Ser Asn Ile Val Glu Lys Thr Leu Asp Tyr Tyr Pro

245 250 255

Pro Pro Cys Glu Leu Asp Lys Ile Val Asn Glu Thr Ile Ala Ala Cys

260 265 270

Asp Ala Met Asp Gly Lys Val Asp Trp Val Val Ala Arg Thr Asp Leu

275 280 285

Cys Leu Leu Asp Phe Asp Ile Ser Thr Ile Glu Gly Lys Pro Tyr Ser

290 295 300

Cys Ala Ala Ser Arg Gly Thr Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Ser Ala

305 310 315 320

Lys Gly Ile Glu Val Ala Lys Thr Ile Ile Asn Gly Leu His Asp Ser

325 330 335

Gln Gly Arg Arg Val Tyr Phe Ser Tyr Gln Pro Thr Ala Ala Phe Asp

340 345 350

Asp Ala Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Thr Gly Gln Trp Gly Leu Asp

355 360 365

Ile Asp Gln Leu Gly Gly Glu Tyr Ile Ala Leu Leu Val Asp Lys Asn

370 375 380

Ala Thr Thr Leu Asp Ser Leu Asp Gly Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Lys

385 390 395 400

Asp Trp Met Ile Ser Gly Leu Gln Glu Tyr Tyr Ser Thr Leu Gln Thr

405 410 415

Thr Trp Pro Asp Leu Thr Pro Phe His Asn Ala Gly Gly Lys Val Ile

420 425 430

His Tyr His Gly Asp Ala Asp Phe Ser Ile Pro Thr Ala Ala Ser Ile

435 440 445

Arg Tyr Trp Glu Ser Val Arg Ser Ile Met Tyr Pro Asn Gln Asp Tyr

450 455 460

Asn Ser Ser Ala Glu Ala Leu Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Tyr Thr Val

465 470 475 480

Pro Gly Ala Gly His Cys Ala Thr Asn Asp Ala Met Pro Asn Gly Pro

485 490 495

Phe Pro Gln Thr Asn Met Ala Val Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly

500 505 510

Val Val Pro Thr Thr Leu Asn Ala Thr Val Leu Gln Gly Glu Asn Glu

515 520 525

Gly Gln Asn Gln Gln Leu Cys Ala Trp Pro Leu Arg Pro Leu Trp Thr

530 535 540

Asn Asn Gly Thr Thr Met Glu Cys Val Tyr Asn Gln Arg Ser Ile Asp

545 550 555 560

Ser Trp His Tyr Asp Leu Asp Ala Val Pro Met Pro Val Tyr

565 570

<210> 2

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgctcac ccactcgagt ttccatagcc atcacagccc ttgcggcatt ggcaaatgct 60

gcaactcctt ccacgttggc agagctttgc actgattccg tcgtgaaggc agctctacca 120

ccctctgaat tcatccaagg cataacaatt gactcggact ctgtgacgac cgaagtcgta 180

acgaacagca gtttctccag cgacttttac ccaagcgcca cgattgacta ttgcaacgtc 240

acattcgcct actcccacga tggcattgac ggtgaccaag ttcttttgga aatctggctc 300

cccgcaccca cagatttcaa aaaccgctgg ctctccactg gcggaggtgg ttatgcaatc 360

aactccggag accaatcgtt gccaggtggt gtcatgtatg gggccgcgtc aggtatgaca 420

gatggcggtt ttggaggatt ctcaaacaat gcggacacgg ctatgctgtt ggccaatggc 480

acactcaact acgagacgct ttacatgttt gcatacaaag cgcatcggga gcttagcttg 540

cttggaaagg ccctgacccg gaatgtttac gggatgagcg acagcgataa gctgtatgcg 600

tattatcaag gctgctctga aggaggccgc gaaggttgga gtcaagtgca gcgattcggc 660

gatgaatggg acggagccat cattggcgct ccagcattcc gctggtcctt ccaacagact 720

caacatctct attccaacat cgtcgagaag acactggatt actacccacc cccctgtgag 780

ctggacaaga tcgtcaacga gaccatcgct gcctgtgatg ccatggacgg aaaggtagat 840

tgggtggttg cacggaccga tctctgcttg ctcgactttg acattagcac aatcgagggt 900

aagccctact cgtgcgctgc atccaggggc acccctgcac agaatggcac ggtctccgcc 960

aagggtatcg aagtcgcgaa aaccatcatc aatggattgc atgactccca aggtcgccgt 1020

gtctactttt cctaccagcc tacagccgcc ttcgatgatg ccgagacgca atacaactcc 1080

acaacaggcc aatggggact cgatatcgat cagcttggag gcgaatacat tgctctcttg 1140

gtagacaaga atgccactac actggacagc ctggatggaa ttacctatga cacgctcaag 1200

gactggatga tctccggctt gcaggaatac tacagcacct tgcagaccac atggccggac 1260

ctcacgccct tccacaatgc tggaggtaaa gtcatccatt accatggtga tgccgacttc 1320

agtattccca ccgccgcatc catccgctat tgggaatcag tacgcagcat tatgtacccc 1380

aatcaggact ataactccag tgctgaggcg ctcaatgagt ggtatcgcct gtacactgtc 1440

ccaggagcgg gtcattgtgc gaccaacgat gctatgccta acggcccctt cccacagacg 1500

aacatggctg tgatgattga ctgggtggag aacggagtag tgcctacaac gctgaatgcg 1560

accgtgctcc agggagagaa tgaaggacag aaccagcagc tctgtgcttg gccgctgcga 1620

cccttgtgga ccaacaatgg caccaccatg gagtgcgtgt ataaccagcg ttcaattgac 1680

agctggcatt atgacttgga tgcggttccc atgcctgtgt actag 1725

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcgctcac ccactcgagt ttcc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagtacaca ggcatgggaa ccgca 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagtacaca ggcatgggaa ccgca 25

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atttgcggcc gcctagtaca caggcatggg aaccgc 36

Claims

1.一种重组塔宾曲霉单宁酶，其特征在于，其氨基酸系列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组塔宾曲霉单宁酶编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的重组塔宾曲霉单宁酶。

3.如权利要求2所述的重组塔宾曲霉单宁酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。

5.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述的重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。

6.一种制备重组塔宾曲霉单宁酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、用权利要求4的表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；

S2、培养重组菌株，诱导表达出重组塔宾曲霉单宁酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：

S11、构建表达载体pPIC9K-Tan；

S12、将表达载体pPIC9K-Tan线性化；

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中诱导重组塔宾曲霉单宁酶表达采用甲醇诱导罐进行诱导表达，所述甲醇诱导罐诱导表达包括：甘油分批发酵阶段、饥饿阶段及甲醇流加阶段。

9.如权利要求1所述的重组塔宾曲霉单宁酶在生产没食子酸中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，生产没食子酸包括：取5g粉碎后的五倍子置于烧杯中，加入250mL蒸馏水，调pH至6.5-7.0，而后加入重组塔宾曲霉单宁酶粗酶液，维持pH至6.5-7.0，于50℃水浴浸提75min，得没食子酸。