CN102260656A

CN102260656A - 重组黑曲霉单宁酶及其表达和纯化方法

Info

Publication number: CN102260656A
Application number: CN201110143632XA
Authority: CN
Inventors: 乔家运; 陈龙宾; 李平; 王文杰
Original assignee: Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science
Current assignee: Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-05-31
Also published as: CN102260656B

Abstract

本发明公开一种重组黑曲霉单宁酶的表达及纯化方法。本发明通过PCR方法将编码黑曲霉单宁酶蛋白的核苷酸序列从黑曲霉基因组中扩增出来，克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a(+)，构建表达载体pET32a-Tan，采用化学转化法转化入大肠杆菌BL21获得重组菌株，采用液态培养的方法进行重组单宁酶的诱导表达。本发明采用Ni亲和层析纯化重组黑曲霉单宁酶，纯化后的单宁酶活性为13.2U/mL。本发明的重组黑曲霉单宁酶具有明显的生物学活性可以有效的降解水解单宁和没食子酸丙酯。

Description

重组黑曲霉单宁酶及其表达和纯化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及重组黑曲霉单宁酶及其在大肠杆菌中的表达、纯化，以及重组黑曲霉单宁酶的应用。

背景技术

单宁是植物的次级代谢产物，相对分子质量在500～3000 Da，是一种水溶性聚酚，根据结构和特性，通常分为缩合单宁、复合物单宁和水解单宁三类，也有人将其分为四类，即缩合单宁、复合物单宁、没食子酸单宁和鞣花单宁。单宁广泛存在于植物的根、叶、果实和种子当中。单宁广泛存在于食品和饲料中，是食品尤其是饲料中的主要抗营养因子之一。单宁的抗营养作用主要有三个方面。（1）单宁可以与蛋白质发生多种交联反应，与口腔起润滑作用的糖蛋白结合，形成不溶物，产生涩味，影响动物的食欲；（2）抑制单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶等多种消化酶的活性，从而降低饲料中营养物质的消化率；（3）与蛋白质形成络合物，影响蛋白质的消化和吸收。单宁与蛋白质复合物（Tannin Protein Complex）在哺乳动物肠道中，难以被蛋白酶等分解，排出体外，增加氮的排泄量。在水溶液清凉茶饮料的生产中，茶中富含的单宁引起茶乳沉淀。单宁与啤酒和果汁中的蛋白质生成沉淀，会引起产品混浊。在食品、饮料、禽畜饲料的生产中必须去除不必要的单宁成分。用单宁酶降解多余的单宁，是一种有广泛应用前景的工艺。

单宁是多种植物性饲料的主要组分，能够抑制许多微生物的生长，抵抗微生物的生物降解。但一些微生物对单宁有抗性，这些微生物通过各种机制和方法降解单宁。Knudson分离到黑曲霉(Aspergillus niger)及青霉(Penicillum sp.)具有降解单宁酸的作用，首次对单宁发酵降解进行研究。之后，单宁降解菌的研究逐步增多，Pourrat等（1987）筛选到一株能分泌单宁酶的黑曲霉，用此菌水解西西里漆树（Rhus coriaria L）中的没食子酸单宁。Oswa等（2000）从人的肠道微生物和食品中首次分离到具有单宁降解功能的乳酸杆菌，分别是植物乳酸杆菌（Lactobacillus palntarum）、类植物乳酸杆菌（Lactobacillus paraplantarum）、戊糖乳酸杆菌（Lactobacillus pentosus）。Bhat等（1996）从采食橡树叶的hill cattle粪便里面，分离到一株能降解单宁-蛋白质复合物的黑曲霉。

单宁酶，也称单宁酰基水解酶（EC3.1.1.20），是一种能够降解水解单宁中酯和缩酚酸之间的链接键，形成没食子酸和葡萄糖。单宁酶是单宁生物降解的关键酶。单宁酶的研究始于20世纪60年代。先后从米曲霉和黑曲霉，念珠菌中分离纯化到单宁酶。也从某些细菌培养液中分离单宁酶。

单宁酶在工业生产中用途广泛，日益受到人们的关注。在食品工业，如茶、啤酒、果汁等制作过程发挥重要作用。在制革工业、化妆品、制药行业也有重要意义。在饲料工业中，添加单宁酶可减少单宁的不良影响，提高饲料的利用率。

发明内容

本发明的一个目的是公开了一种重组黑曲霉单宁酶及其编码基因。

本发明的另一个目的是公开了重组黑曲霉单宁酶的表达及其纯化方法。

本发明的还一个目的是公开了重组黑曲霉单宁酶在工业生产中的应用。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术方案：

一种重组表达的黑曲霉单宁酶，其特征在于黑曲霉单宁酶编码的基因核苷酸序列如NO1所示；其所对应的氨基酸序列如NO2所示。

本发明所述黑曲霉单宁酶的表达方法，它是通过表达载体pET32a-Tan在大肠杆菌菌株BL21中采用IPTG进行诱导表达，采用裂解法释放单宁酶后进行纯化得到重组黑曲霉单宁酶。其中所述的纯化为：采用5 mL Ni-NTA柱纯化蛋白，50 mL NPI-10平衡柱子，流速为5 mL/min；加入蛋白粗提物，流速为2 mL/min，50 mL NPI-20洗脱杂蛋白，流速为5 mL/min，30 mL NPI-250洗脱单宁酶蛋白，流速为1 mL/min，收集各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

本发明进一步公开了重组表达的黑曲霉单宁酶，消除植物性饲料中的单宁，降低其其对单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶的抑制，提高饲料中营养物质的消化率。

本发明所用黑曲霉菌株自主从霉变葡萄中分离得到，该菌株由自主分离得到，菌株由中国科学院微生物研究所鉴定为黑曲霉，相关文章已经发表（《饲料工业》，2011,32(5):28-29，菌种鉴定结果有中国科学院微生物研究所出具的正式报告）。

本发明首次从该菌株中分离到单宁酶基因，所分离的单宁酶核苷酸序列与前人公开的序列不同，单宁酶氨基酸序列是一个新的序列。通过Blast比对，与相似性最高的核苷酸序列和氨基酸序列不同点如下：

“-”前是本研究克隆到的基因碱基位点，“-”后是GenBank序列号XM_001402449的序列相应碱基。

（6T-219C，15T-228C，33G-246C，54G-267A，78C-291T，81C-294T，90T-303C，102T-315C，126G-339C，168C-381G，171C-384T，177G-390C，180C-393T，210T-323C，219C-432T，222C-435T，225C-438G，258T-471A，268T-481A，269C-482G，282T-494G，288A-501G，295C-508A，318T-531C，321T-534C，330T-543C，346C-559A，351T-564C，405C-618T，435C-648T，460A-673T，483T-697C，498T-712C，516C-730T，537A-750G，586C-799G，600T-813C，606C-819T，621T-834C，639C-852T，648C-861T，651C-864T，654T-867C，669C-882T，681G-894A，702T-915C，717T-930C，720T-933C，731C-944A，736T-949C，748C-961T，771T-984C，774G-987A，781G-994A，783T-996C，786C-999T，810T-1023C，831T-1044C，858T-1071C，868T-1081G，870T-1083C，879C-1092G，888C-1101T，930T-1143C，966C-1179T，969C-1182T，972T-1185C，987T-1200C，990C-1203T，1014T-1227G，1032T-1245C，1038T-1251C，1054A-1267C，1087A-1300C，1101C-1314T，1119C-1332T，1143C-1356G，1170A-1383G，1174T-1387C，1201A-1414T，1219C-1432A，1224T-1437G，1231A-1444G，1245C-1458T，1257C-1470T，1266T-1479C，1278C-1491T，1282T-1495G，1283C-1496A，1293T-1506G，1341A-1554G，1413T-1626C，1419A-1632G，1428T-1641C，1434T-1647C，1442A-1655C，1459A-1672T，1467T-1680C，1470C-1683T，1482C-1695T，1509T-1722C，1530C-1743T）

“-”前是本研究表达的单宁酶氨基酸位点，“-”后是GenBank序列号XP_001402486.1的序列相应氨基酸。

（98Q-169K，116Q-187K，154I-226F，244P-315T，261A-332T，290Y-361D，352I-423L，363K-434Q，391A-462G，401T-472S，407Q-478K，408D-479E，428S-499D，481N-552T，487T-558S）

本发明所用表达载体为pET-32a(+)，本发明蛋白纯化的方法为Ni离子亲和层析法，所用载体和纯化方法均为成熟的技术。

本发明获得的重组黑曲霉单宁酶及其表达和纯化方法所具有的积极效果在于：

（1）pET-32a(+)可以提高酶蛋白的表达水平。

（2）pET-32a(+)带有His标签，利于后期蛋白的纯化。

（3）Ni离子亲和层析法是专门纯化带有His标签的重组蛋白。

附图说明：

图1 为黑曲霉tan基因PCR扩增图；

图2为菌落PCR鉴定pMD19T-Tan克隆载体；其中1：DNA分子量Marker；

2-7：分别是不同克隆的PCR 产物；

图3为单宁酶氨基酸序列；

图4为单宁酶核苷酸序列；

图5为重组表达载体pET32a-Tan双酶切鉴定；其中1：λ DNA/EcoR I+Hind III双酶切分子量Marker；2：空载体pET-32a(+)/EcoR I与Hind III双酶切；3：pET32a-Tan/EcoR I与Hind III双酶切；

图6 为Western blot鉴定单宁酶基因的表达；其中1：pET-32a(+)空载体转化大肠杆菌裂解物；2：pET32a-Tan重组载体转化大肠杆菌裂解物；

图7 SDS-PAGE分析单宁酶重组蛋白的表达纯化和纯化；其中1：蛋白分子量Marker；2：未诱导菌体总蛋白；3：诱导菌体总蛋白；4：纯化的单宁酶；

图8为重组黑曲霉单宁酶反应温度及热稳定性测定曲线图；

图9为重组黑曲霉单宁酶反应ph值及酸碱稳定性测定曲线图。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1

黑曲霉DNA提取

接种黑曲霉菌株入50 mL察氏培养基中（NaNO₃ 3.0 g/L，K₂HPO₄ 1.0 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO₄ 0.5 g/L，FeSO₄ 0.01 g/L，蔗糖30 g/L），于28oC、250 rpm振荡培养48 h。12,000 rpm离心收集菌体，在液氮中快速研磨，取0.2 g粉末，加入500 μl TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA)，再加入500 μl酚/仿，混匀后，12,000 rpm离心10 min。取上清液加入1/10体积NaAc，再加入2倍体积无水乙醇，置冰上沉淀20 min。12,000 rpm离心20 min，沉淀用70%乙醇洗涤两次，旋转蒸发抽干，沉淀溶于20 μl 灭菌水中。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA。

单宁酶基因PCR扩增

单宁酶基因克隆所用引物如下：

Tan-F: 5-TGCAATGTCACTGTTACC-3（NO3）和Tan-R

5-TTAGAAAACGGGCATCTTG-3，（NO4）

以黑曲霉基因组DNA作为模板，反应总体积为50 μL，在0.2 mL PCR管中依次加入下列成分：

基因组DNA	4 μL
		dNTPs（10 mM each）	1 μL
Tan-F（20 μM）	1 μL
		Tan-R（20 μM）	1 μL
10× LA PCR buffer Ⅱ (Mg²⁺ Plus)	5 μL
		去离子水	37.5 μL
LA Taq (5 U/mL)	0.5 μL

混匀，瞬时离心，反应条件：94oC 3 min，94oC 30 Sec，50 oC30 Sec，72 oC 2 min，5个循环，接下来，94oC 30 Sec，52 oC 30 S，72 oC 2 min，35个循环。

实施例2

重组克隆载体pMD19T-Tan的构建

1）单宁酶基因扩增产物与克隆载体的连接

将回收纯化的单宁酶基因PCR产物与pMD19-T Simple vector（购自Takara公司）连接构建重组克隆质粒。连接反应按照pMD19-T Simple vector 连接试剂盒提供的说明书进行。在0.2 mL PCR管中依次加入下列成分：

pMD19-T Simple vector	1 μL
		Tan基因片段	4 μL
Ligation Solution I	5 μL

混匀，瞬时离心，16℃连接3 h。

2）大肠杆菌化学转化感受态细胞的制备

①从LB平板（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂粉15 g，加入蒸馏水900 mL，充分溶解后，定容至1 L，121℃高压灭菌20 min）上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于5 mL LB液体培养基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加入蒸馏水900 mL，充分溶解后，定容至1 L，121℃高压灭菌20 min）中，37℃振荡培养12 h。

②将上述培养物以1：100的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5左右。

③将菌液转入4℃预冷的离心管中，冰上放置10 min，4000 rpm 4℃离心10 min，弃去上清。

④用15 mL预冷的0.06 M CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置5 min，4000 rpm 4℃离心10 min。

⑤弃去上清，用20 mL预冷的0.06 M CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30 min。4000 rpm 4℃离心10 min。

⑥弃去上清，加入2 mL预冷的含15%甘油的0.06 M CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30 min，即成感受态。

⑦冰上将感受态细胞分装成50 μL/管，-70℃保存。

3）重组克隆质粒的转化

从-70℃冰箱中取感受态细胞E. coli DH5α，迅速冰浴解冻。取10 μL连接产物加入50 μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min。42℃水浴中热击90 sec。迅速冰浴3 min。加入800 μL LB液体培养基，混匀，37℃复壮30 min。取100 μL涂布于含有氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃培养12～16 h。

4）重组克隆载体pMD19T-Tan阳性菌株的鉴定

重组质粒鉴定的方法很多，本试验选用了菌落PCR扩增和测序方法。分别挑取几个单克隆溶于20 μL灭菌的去离子水中，100℃煮10 min以裂解菌体、释放DNA。12000 rpm离心2 min，取上清作为PCR扩增模板。反应总体积为20 μL，在0.2 mL PCR管中依次加入下列成分：

菌体裂解上清	10 μL
		dNTPs（10 mM each）	0.5 μL
Tan-F（20 μM）	0.5 μL
		Tan-R（20 μM）	0.5 μL
10× PCR buffer	2 μL
		去离子水	6.3 μL
Taq (5 U/mL)	0.2 μL

混匀，瞬时离心，反应条件：94oC 3 min，94oC 30 Sec，50 oC30 Sec，72 oC 2 min, 5个循环，接下来，94oC 30 Sec，52 oC 30 S，72 oC 2 min，35个循环。挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌株进行核苷酸测序，由北京诺赛基因公司完成。

5）测序结果分析：从黑曲霉基因组中克隆到的单宁酶基因，其成熟蛋白基因序列为1533 bp，编码510个氨基酸。在NCBI中采用Blast进行序列比对和单宁酶同源性分析。核苷酸序列相似性最高为93%（XM_001402449），氨基酸序列相似性最高为97%（XP_001402486.1），如图3和图4所示。

实施例3

重组原核表达载体pET32a-Tan构建

1）待插入的单宁酶基因片段的制备：

挑选测序正确的阳性克隆进行pMD19T-Tan质粒提取，方法按照小量质粒提取试剂盒（购自天根生化科技(北京)有限公司）提供的操作步骤进行。

单宁酶基因扩增

单宁酶基因表达所用引物如下：

TanE-F：5'-CGGAATTCTGCAATGTCACTGTTACC-3'，5'分别引入为碱基保护和EcoR I酶切位点（下划线）；（NO5）

TanE-R：5'-CCCAAGCTTGAAAACGGGCATCTTG-3'，5'（NO6）

分别引入为碱基保护和Hind III酶切位点（下划线），以pMD19T-Tan重组质粒作为模板，反应总体积为50 μL，在0.2 mL PCR管中依次加入下列成分：

pMD19T-Tan	1 μL
		dNTPs（10 mM each）	1 μL
TanE-F（20 μM）	1 μL
		TanE-R（20 μM）	1 μL
10× LA PCR buffer Ⅱ (Mg²⁺ Plus)	5 μL
		去离子水	40.5 μL
LA Taq (5 U/mL)	0.5 μL

混匀，瞬时离心，反应条件：94oC 3 min，94oC 30 Sec，50 oC 30 Sec，72 oC 2 min，5个循环，接下来，94oC 30 Sec，52 oC 30 S，72 oC 2 min，35个循环。

2）PCR产物的回收与纯化

用小量DNA片段快速胶回收试剂盒，操作按产品说明书提供的步骤进行。

3）PCR产物双酶切及其回收

根据设计的上下游引物所带的酶切位点，选用EcoR I和BamH I对所回收纯化的单宁酶基因PCR产物进行双酶切，50 μL酶切体系，如下：

纯化的PCR产物	20 μL
		EcoR I	1 μL
Hind III	1 μL
		10× Buffer 3	5 μL
100× BSA	0.5 μL
		去离子水	22.5 μL

混匀，离心，37℃过夜酶切。酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。在紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，放入1.5 mL离心管中。

4) 双酶切产物的回收与纯化：用小量DNA片段快速胶回收试剂盒，操作按产品说明书提供的步骤进行。

5）大肠杆菌表达载体pET-32a(+)双酶切及其回收

根据构建表达载体时选用的酶切位点EcoR I和Hind III，对pET-32a(+)进行双酶切，50 μL酶切体系，如下：

pET-32a(+)质粒	20 μL
		EcoR I	1 μL
Hind III	1 μL
		10× Buffer 3	5 μL
100× BSA	0.5 μL
		去离子水	22.5 μL

混匀，离心，37℃过夜酶切。酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，观察结果：在紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，放入1.5 mL离心管中，按照小量DNA片段快速胶回收试剂盒产品说明书提供的步骤进行双酶切产物的回收与纯化。

6）酶切片段与质粒载体的连接

将经EcoR I和Hind III双酶切的单宁酶基因，插入到经同样双酶切的表达载体pET-32a(+)中，构建成重组真核表达载体pET32a-Tan。连接体系如下：

线性化的pET-32a(+)	1 μL
		Tan双酶切产物	4 μL
Ligation Solution I	5 μL

混匀，瞬时离心，16℃连接3 h。

7）连接产物的转化：

从-70℃冰箱中取感受态细胞DH5α，迅速冰浴解冻，取10 μL连接产物加入50 μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42℃水浴中热击90 sec，迅速冰浴3 min，加入800 μL LB液体培养基，混匀，37℃复壮1 h。取100 μL涂布于含有氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃培养12～16 h。

8）阳性克隆鉴定：重组质粒鉴定的方法很多，本试验选用了限制性内切酶双酶切和核苷酸测序。

双酶切鉴定：

挑选几个抗性筛选为阳性的克隆分别接种LBA液体培养基（在高压灭菌冷却后的LB液体培养基中加入无菌的氨苄青霉素至终浓度分别为100 μg/mL），于37℃过夜培养。质粒提取按照小量质粒提取试剂盒提供的操作步骤进行。

根据设计的上、下游引物中所带的酶切位点，选用EcoR I和Hind III对所提取的质粒分别进行双酶切，20 μL酶切体系，如下：

质粒DNA	5 μL
		EcoR I	0.2 μL
Hind III	0.2 μL
		10× Buffer 3	2 μL
100× BSA	0.2 μL
		去离子水	12.4 μL

混匀，离心，37℃过夜酶切。酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

序列测定与分析：

将酶切鉴定为阳性的克隆进行测序，由北京诺赛基因公司完成。采用DNAMAN软件分析测序结果。

实施例4

重组质粒pET32a-Tan在大肠杆菌中的诱导表达

1）将鉴定正确的重组质粒pET32a-Tan转化E. coli BL 21，方法同4中的7）。

2）挑取单菌落接种于LBA液体培养基中，37℃过夜振荡培养。

3）按1%接种于100 mL LBA液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀=0.5~0.6。

4）待菌液冷至16℃时加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度为0.3 mM，16℃诱导培养12 h后收集菌体，同时设只含表达载体pET-32a(+)的E. coli BL 21对照。

5）12000 rpm离心2 min收集菌体沉淀，-20℃保存。

实施例5

SDS-PAGE和Western blot检测单宁酶在大肠杆菌中的表达

1）单宁酶重组蛋白的提取：取1 mL诱导的菌体沉淀，加入1×蛋白电泳上样缓冲液，充分混匀，置于沸水中煮10 min，置冰上预冷3 min，-20℃保存备用。

2）SDS-PAGE

制胶：按BIO-RAD产品说明书装好制胶板，参照《分子克隆》的配方灌制12%的分离胶，加入分离胶（使梳子下缘到胶面的距离约1 cm），缓慢在胶面上加一层水，室温放置约15 min，待胶充分聚合后倒掉水，用吸水纸吸掉残留水分，加入5%浓缩胶，装上梳子，室温放置约15 min，使胶充分聚合，拔出梳子即可加样进行电泳。

上样与电泳：取10 μL提取的单宁酶重组蛋白上样，同时设蛋白质标准分子量对照。100 V 电泳2 h。

3）蛋白凝胶染色及脱色：蛋白电泳结束后，轻轻取下蛋白凝胶，置于干净的盒中，考马斯亮兰染液（甲醇90 mL，冰乙酸10 mL，考马斯亮蓝G-250 0.25 g，蒸馏水90 mL，充分溶解后，过滤）染色90 min后，进行脱色直至出现清晰的蛋白条带。

4）Western blot

转印装置的准备：先将裁剪大小与凝胶面积一致的PVDF膜（聚偏氟乙烯膜，购自milipore公司）浸泡于无水甲醇中（约1 min），随后将蛋白凝胶、Whatman滤纸和PVDF膜置于转印缓冲液中平衡约10 min。转印电极装置从负极到正极依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸和海绵垫。注意排出气泡。

电转移：固定好转印电极后，将电极插入电转槽，注满转印缓冲液，4℃恒压100 V转印30 min。

封闭：转印结束后取出PVDF膜置于封闭液（5%脱脂奶粉）中，室温封闭2 h。

洗涤：倾去封闭液，用PBST洗涤液（0.5 mL Tween 20 加入1 L PBS中，充分混匀，室温保存）洗膜5 min。

用小鼠抗6×His标签抗体鉴定单宁酶-his融合蛋白的表达

一抗孵育：用封闭液将小鼠抗6×His单克隆抗体（购自Invitrogen公司）作1：1000稀释，加到PVDF膜上，室温孵育2 h，PBST洗膜5 min×6次；

酶标二抗孵育：用封闭液将HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（购自鼎国生物技术有限责任公司）作1：8000稀释，加到PVDF膜上，室温孵育1 h；PBST洗膜5 min×6次。

5）显影

根据Western blot发光检测试剂盒提供的步骤进行。

根据PVDF膜的大小，配制适量的发光检测液。

用平头镊子将免疫反应后的膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，以去除膜上多余的液体。将膜的蛋白面朝上置于洁净的保鲜膜上；将配制的发光检测液均匀加到蛋白膜上，室温孵育5 min。用镊子夹持膜，轻轻去除膜上多余的液体。膜的蛋白面朝上，包裹于洁净的保鲜膜内，并固定于X光片暗盒中，在暗室中取出一张X光片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光时间依目的蛋白表达水平而定。将达到曝光时间的X光片从暗盒中取出，放入X光片洗片机中，洗片显影。

实施例6

重组蛋白纯化

1）单宁酶重组蛋白可溶性分析

将含有pET32a-Tan的E. coli BL 21接种于50 mL LBA液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀=0.5~0.6，待菌液冷至16℃时加入IPTG至终浓度为0.5 mM，16℃诱导培养12 h；12000 rpm离心2 min，收集菌体；用5 mL PBS重悬菌体沉淀，超声波破碎菌体。超声条件：4℃，40%功率，工作2 sec，停3 sec，总工作时间为10 min；取超声裂解液100 μL于干净的离心管中，标记为“总蛋白”；将超声裂解液4℃离心，12000 rpm，10 min，取100 μL离心上清于干净的离心管中，标记为“可溶蛋白”，弃去上清，沉淀用1 mL含6 M尿素的PBS（氯化钠8g，氯化钾0.2 g，磷酸氢二钠1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，加入蒸馏水900 mL，充分溶解后，用盐酸调pH值至7.4，定容至1 L，121℃高压灭菌20 min）重悬，超声波辅助溶解蛋白。超声条件同上。

将超声裂解液4℃离心，12000 rpm，10 min，取100 μL离心上清于干净的离心管中，标记为“不溶蛋白”。在“总蛋白”、“可溶蛋白”和“不溶蛋白”样品中分别加入6×蛋白电泳上样缓冲液，混匀后，置于沸水中煮10 min，置冰上预冷3 min。分别取10 μL上述蛋白样品，SDS-PAGE分析单宁酶重组蛋白的可溶性。

2）单宁酶重组蛋白的纯化

将含有pET32a-Tan的E. coli BL 21接种于500 mL LBA液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀=0.5~0.6；待菌液冷至16℃时加入IPTG至终浓度为0.5 mM，16℃诱导培养12 h；

12000 rpm离心2 min，收集菌体；分别用30 mL NPI-10重悬单宁酶工程菌沉淀，超声波辅助溶解蛋白；超声条件：4℃，40%功率，工作2 sec，停3 sec，总工作时间为10 min，12000 rpm，4℃离心30 min，收集上清，0.2 μm滤器过滤上清以去除杂质，滤液为蛋白粗提物；用5 mL Ni-NTA柱（Qiagen, Hilden, Germany）纯化蛋白，50 mL NPI-10平衡柱子，流速为5 mL/min。加入蛋白粗提物，流速为2 mL/min。50 mL NPI-20洗脱杂蛋白，流速为5 mL/min，30 mL NPI-250洗脱单宁酶蛋白，流速为1 mL/min；收集各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

实施例7

纯化的单宁酶活性和蛋白浓度测定

1）酶活性测定

取4支洁净的10 ml具塞试管，分别设定为对照平行管与测定平行管。在每支试管中先后各加入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（2.3 g柠檬酸、3.35 g柠檬酸钠溶于1L水中）和1 mL酶液，40℃下平衡5 min，先将4 mL 99%乙醇加入对照管中，使酶失活。5 min后，在4支试管中加入0.5%底物PG（没食子酸丙酯，购自国药集团化学试剂有限公司）溶液，40℃保温，准确反应10 min，同法终止测定管的酶促反应。从上述4 支反管中各取1 mL反应液，分别定容至10 mL，并测定其在270 nm处吸收值A。以重蒸水代替PG液重复上述操作作为空白。将反应温度为40℃条件下，1mL酶液每分钟使PG液在270 nm处减少0.001个吸收值定义为1个酶活力单位。

2）酶蛋白浓度测定

纯化后的单宁酶浓度测定参照BCA蛋白定量分析试剂盒（购自美国Pierce公司）的方法进行。所得到纯化后的单宁酶活性为13.2 U/mL，酶蛋白浓度为0.026 mg/mL，酶的比活性为507.7 U/mg。

实施例8

重组黑曲霉单宁酶最适宜反应温度及热稳定性测定：

方法：分别在20、30、40、50、60、70℃时测定单宁酶活性，结果以相对酶活性进行表示。

结果如图8所示。

实施例9

重组黑曲霉单宁酶最适宜反应ph值及酸碱稳定性测定：

方法：分别采用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的柠檬酸缓冲液测定酶活性，结果以相对酶活性进行表示。

结果如图9所示。

实施例10

重组表达的黑曲霉单宁酶蛋白质的实际应用例子

研究在1~3日龄肉鸡日粮中添加单宁酶对生长性能的影响。

基础日粮配方：玉米57%、高粱5%、豆粕32.9%、大豆油1%、磷酸氢钙1.5%、石粉1.2%、食盐0.3%、蛋氨酸0.1%、预混料1%。

试验组添加0.1%单宁酶，试验期3周,结果如下表所示:

项目	对照组	试验组
			采食量	46.61 ± 1.02	47.23 ± 1.52
日增重	32.95 ± 0.81	34.56 ± 1.09
			料重比	1.41 ± 0.03	1.37 ± 0.03

结果表明，添加单宁酶可以改善肉仔鸡的生产性能。这是由于单宁酶消除了高粱中单宁的抗营养特性，通过降低对体内消化酶活性的抑制，增加营养成分消化率，提高生产性能。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市畜牧兽医研究所

<120> 重组黑曲霉单宁酶及其表达和纯化方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcaatgtca ctgttaccta cacccacacc gggaagggtg acaaggttgt cgtgaagtac 60

gccctgcccg ctccttccga cttcaagaat cgtttctacg ttgccggtgg tggtggtttc 120

tccctgtcca gcgatgctac tggcggtctc gagtacggtg ctgcctccgg cgccacggac 180

gccggctacg acgccttctc ctacagctat gatgaagtcg tcctctacgg caacggctcg 240

atcaactggg atgctactta catgttctcc taccaggctc ttggtgaaat gacccagatc 300

gccaagcccc tgacccgtgg tttctacggt ctctccagcg acaagcagat ttacacctac 360

tacgagggct gttccgatgg tggtcgtgag ggtatgagtc aggtccagcg ctggggagat 420

gaatatgacg gtgtcattgc cggtgcccct gccttccgca ttgctcagca gcaggtccac 480

catgtcttcc ctgccactat tgaacacacc atggactact accctccccc ttgcgaactt 540

gacaagatcg tcaacgctac cattgaagcc tgtgaccctc tcgaccgccg taccgatggt 600

gttgtctccc gtactgacct ttgcatgctg aacttcaacc tcacctccat cattggcgag 660

tcctactact gcgctgaaca gaactacacc tccctgggct ttggcttcag caagcgtgct 720

gaaggcagcc ctactagcta ccagcccgcc cagaacggca gcgtcaccgc tgagggtgtt 780

gctctcgccc aggccatcta cgacggtctt cacgactcta acggcaagcg tgcctacctc 840

tcgtggcaga tcgccgctga gctgtcctat ggtgacaccg agtacgactc caccactgac 900

tcctggactc tgagcatccc ctccaccggt ggcgagtacg tgaccaagtt cgtgcagctc 960

ctcaacatcg ataacctgga gaaccttgac aacgtcacct acgacaccct ggttgactgg 1020

atgaacatcg gtatgattcg ctacattgac agtatccaga ccaccgtcgt cgacctcacc 1080

accttcaagg agtccggtgg caagatgatc cactaccacg gtgaatccga ccccagtatc 1140

cccaccgcct cgtccgtcca ctactggcag gctgtccgtc aggccatgta ccccaacacc 1200

acctacaccc agtccctgca ggatatgtcc aactggtacc agctctacct cgtccccggc 1260

gctgctcact gcggtaccaa ctccctccag cctggtcctt accccgagga caacatggag 1320

atcatgatcg actgggttga aaacggcaac aagccttccc gcctcaacgc caccgtctcc 1380

tccggtacct atgctggtga gacccagatg ctttgccaat ggccttctcg tcctctctgg 1440

aacagcaact ccagcttcac ttgtgttcac gactccaagt cccttgctac ttgggactac 1500

acttttgatg ctttcaagat gcccgttttc taa 1533

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> 重组黑曲霉单宁酶

<400> 2

Cys Asn Val Thr Val Thr Tyr Thr His Thr Gly Lys Gly Asp Lys Val

1 5 10 15

Val Val Lys Tyr Ala Leu Pro Ala Pro Ser Asp Phe Lys Asn Arg Phe

20 25 30

Tyr Val Ala Gly Gly Gly Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asp Ala Thr Gly

35 40 45

Gly Leu Glu Tyr Gly Ala Ala Ser Gly Ala Thr Asp Ala Gly Tyr Asp

50 55 60

Ala Phe Ser Tyr Ser Tyr Asp Glu Val Val Leu Tyr Gly Asn Gly Ser

65 70 75 80

Ile Asn Trp Asp Ala Thr Tyr Met Phe Ser Tyr Gln Ala Leu Gly Glu

85 90 95

Met Thr Gln Ile Ala Lys Pro Leu Thr Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Ser

100 105 110

Ser Asp Lys Gln Ile Tyr Thr Tyr Tyr Glu Gly Cys Ser Asp Gly Gly

115 120 125

Arg Glu Gly Met Ser Gln Val Gln Arg Trp Gly Asp Glu Tyr Asp Gly

130 135 140

Val Ile Ala Gly Ala Pro Ala Phe Arg Ile Ala Gln Gln Gln Val His

145 150 155 160

His Val Phe Pro Ala Thr Ile Glu His Thr Met Asp Tyr Tyr Pro Pro

165 170 175

Pro Cys Glu Leu Asp Lys Ile Val Asn Ala Thr Ile Glu Ala Cys Asp

180 185 190

Pro Leu Asp Arg Arg Thr Asp Gly Val Val Ser Arg Thr Asp Leu Cys

195 200 205

Met Leu Asn Phe Asn Leu Thr Ser Ile Ile Gly Glu Ser Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Glu Gln Asn Tyr Thr Ser Leu Gly Phe Gly Phe Ser Lys Arg Ala

225 230 235 240

Glu Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gln Pro Ala Gln Asn Gly Ser Val Thr

245 250 255

Ala Glu Gly Val Ala Leu Ala Gln Ala Ile Tyr Asp Gly Leu His Asp

260 265 270

Ser Asn Gly Lys Arg Ala Tyr Leu Ser Trp Gln Ile Ala Ala Glu Leu

275 280 285

Ser Tyr Gly Asp Thr Glu Tyr Asp Ser Thr Thr Asp Ser Trp Thr Leu

290 295 300

Ser Ile Pro Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Val Thr Lys Phe Val Gln Leu

305 310 315 320

Leu Asn Ile Asp Asn Leu Glu Asn Leu Asp Asn Val Thr Tyr Asp Thr

325 330 335

Leu Val Asp Trp Met Asn Ile Gly Met Ile Arg Tyr Ile Asp Ser Ile

340 345 350

Gln Thr Thr Val Val Asp Leu Thr Thr Phe Lys Glu Ser Gly Gly Lys

355 360 365

Met Ile His Tyr His Gly Glu Ser Asp Pro Ser Ile Pro Thr Ala Ser

370 375 380

Ser Val His Tyr Trp Gln Ala Val Arg Gln Ala Met Tyr Pro Asn Thr

385 390 395 400

Thr Tyr Thr Gln Ser Leu Gln Asp Met Ser Asn Trp Tyr Gln Leu Tyr

405 410 415

Leu Val Pro Gly Ala Ala His Cys Gly Thr Asn Ser Leu Gln Pro Gly

420 425 430

Pro Tyr Pro Glu Asp Asn Met Glu Ile Met Ile Asp Trp Val Glu Asn

435 440 445

Gly Asn Lys Pro Ser Arg Leu Asn Ala Thr Val Ser Ser Gly Thr Tyr

450 455 460

Ala Gly Glu Thr Gln Met Leu Cys Gln Trp Pro Ser Arg Pro Leu Trp

465 470 475 480

Asn Ser Asn Ser Ser Phe Thr Cys Val His Asp Ser Lys Ser Leu Ala

485 490 495

Thr Trp Asp Tyr Thr Phe Asp Ala Phe Lys Met Pro Val Phe

500 505 510

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工学列

<400> 3

tgcaatgtca ctgttacc 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工学列

<400> 4

ttagaaaacg ggcatcttg 19

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggaattctg caatgtcact gttacc 26

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工学列

<400> 6

cccaagcttg aaaacgggca tcttg 25

Claims

1. 一种重组表达的黑曲霉单宁酶，其特征在于黑曲霉单宁酶编码的基因核苷酸序列如图1所示；其所对应的氨基酸序列如图2所示。

2.权利要求1所述黑曲霉单宁酶的表达方法，其特征在于通过表达载体pET32a-Tan在大肠杆菌菌株BL21中采用IPTG进行诱导表达，采用裂解法释放单宁酶后进行纯化得到重组黑曲霉单宁酶。

3.权利要求2所述黑曲霉单宁酶的表达方法，其中所述的纯化为：采用5 mL Ni-NTA柱纯化蛋白，50 mL NPI-10平衡柱子，流速为5 mL/min；加入蛋白粗提物，流速为2 mL/min，50 mL NPI-20洗脱杂蛋白，流速为5 mL/min，30 mL NPI-250洗脱单宁酶蛋白，流速为1 mL/min，收集各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

4.权利要求1所述重组表达的黑曲霉单宁酶在作为降解植物性饲料中的单宁，降低对单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶消化酶的抑制，提高饲料中营养物质消化率饲料方面的应用。