CN107400686A - 一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸及其制备方法属化妆品、药品、保健品技术领域。本发明使用浅塑料槽制作发酵床，装卸料方便，并可多层码放；使用黑曲霉(Aspergillus niger)和大肠杆菌（Escherichia. Coli）2种菌混合发酵能形成互补效应，使鞣花酸转化效率更高；经3次递减用量无水甲醇萃取，回收甲醇后，滤渣去离子水水洗，并经冷冻干燥所得产品品质好，鞣花酸产品收率高和纯度高。工艺步骤简单，发酵条件温和，大大减少化学物质的消耗，环境污染小，更适合大规模的生产。

Description

一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸及其方法，属化妆品、药品、保健品技术领域。
背景技术
鞣花酸 (ellagic acid)，分子式 C14H6O8，它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。是一种广泛存在于各种坚果、水果中的天然多酚类化合物，尤以石榴皮中含量丰富。但游离态的较少，更多的是以缩合形式 ( 如鞣花单宁、苷等 ) 存在。鞣花酸纯品是一种黄色针状晶体，微溶于水、醇，溶于热甲醇、碱和吡啶。
近20年的研究发现鞣花酸具有较强的抗脂质过氧化、捕捉自由基的能力；可以抑制致癌剂的代谢活动，解除致癌物的毒性；对人体免疫缺陷病毒具有抑制作用；还具有胃肠动力学和泌尿生殖动力学作用，以及具有凝血、降压、镇静作用。因此，倍受人们关注。
鞣花酸可以通过提取、化学合成法和天然产物降解法得到，具体制备方法主要有以下几种：
第一种是从植物中提取鞣花酸。在橡椀、树莓、石榴以及蕨类等植物中含有少量游离的鞣花酸 (1％)，用此法可制备高纯度的鞣花酸。但由于原料成本较高、且鞣花酸含量低，在生产上没有实际意义。
第二种是通过没食子酸(或其酯)的氧化聚合。合成前体物质——没食子酸(酯)需要在酶的作用下氧化聚合制取鞣花酸。此法鞣花酸的产率为 20％～30％。但没食子酸(酯)的制备过程繁琐复杂，酶也需要精制纯化，而且合成产物中存在未知的醌类物质，其与鞣花酸的比例为 1∶2.4，给产品的分离纯化带来了一定的困难，目前较少用此法进行鞣花酸的生产。
第三种是酸水解法制备鞣花酸的工艺(专利号：200510002081.X)，此法具有较高的产率和纯度，但需消耗高浓度强酸，并在长时间加热条件下完成，对设备抗腐蚀能力要求很高，对环境污染较重。
第四种是目前公开的以石榴皮为原料非化学制备鞣花酸的方法。其一是酶催化法(专利号：200810056007.X)，其主要过程分为两步：液态发酵产酶阶段和酶促转化阶段，此法过程繁琐，且酶促转化条件要求严格，不易控制。公开的另一方法是黑曲霉固态发酵法（专利号：201010178430.4），其过程是石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用占总重量 47％～60％的初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％ NaCl、0.1％ MgSO4和0.5％NH4NO3，其中NH4NO3 作为N源，pH 5～7，115℃灭菌30 min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3.316) 孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为 5 g石榴皮添加1mL浓度为1×1010个/mL的黑曲霉孢子悬液。混匀并静置培养，30 ℃发酵 5～7天，得到含有鞣花酸的发酵产物。该方法使用发酵罐固态发酵，装料与出料均比较麻烦，上下部分发酵不均匀；再是该法仅使用单一菌种发酵，效率有待提高，这些对大规模工业化生产有一定的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种以石榴皮为底物制备鞣花酸更高效的固态发酵方法。通过直接以石榴皮粉末为发酵底物，经黑曲霉与大肠杆菌固态发酵法生产鞣花酸，经甲醇萃取得到高纯度鞣花酸。该方法操作简单，鞣花酸的纯度和产率较高。
本发明以黑曲霉(Aspergillus niger)和大肠杆菌（Escherichia. Coli）为发酵菌种，以石榴皮粉末为发酵底物，进行固态发酵。发酵过程中，黑曲霉和大肠杆菌均合成单宁酶并将其分泌到胞外，单宁酶催化石榴皮中的鞣花单宁降解生成鞣花酸，发酵产物经萃取和洗涤纯化获得高纯度鞣花酸，包括以下步骤：
一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸，其特征在于，包括以下步骤 ：
（1）发酵菌悬液制备
先用纯净水配置营养液，营养液含有0.5%～1%的(NH4)2HPO3, 0.1%～0.2%的MgCl2，0.1%-0.2%Na2SO4，每1 L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×107个/mL以上，黑曲霉孢子数1×108个/mL以上。
（2）石榴皮发酵床准备
向石榴皮粉末中均匀喷洒步骤（1）所制的发酵菌悬液，菌悬液的用量占石榴皮粉末重量的40%～45%，然后把接种后的石榴皮粉末装入方形塑料槽内，做成石榴皮发酵床，码放在发酵室内的货架上。
（3）石榴皮的固态发酵
调控发酵室的温度在31～35 ℃范围之内，湿度保持在85%～90%，静置发酵4～5天，终止发酵，晒干或烘干得到含有鞣花酸的发酵产物。
（4）萃取
干燥的发酵产物经再次粉碎，第1次加入8～9倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取3 h，过滤；第2次向滤渣中加入6～7倍体积的无水甲醇回流萃取2 h，过滤；所得滤渣再次加入4～5倍无水甲醇回流提取1 h，再次过滤，合并3次滤液，旋蒸回收甲醇，所得固体经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。
所述的每个塑料槽的高度10～15 cm，宽30 cm，长40 cm，长和宽也可根据需要调整，装料至塑料槽的上沿平齐。
通过固态发酵石榴皮制备鞣花酸的方法，其特征在于，包括以下步骤 ：
（1）发酵菌悬液制备
先用纯净水配置营养液，营养液含有0.5%～1%的(NH4)2HPO3, 0.1%～0.2%的MgCl2，0.1%-0.2%Na2SO4，每1 L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×107个/mL以上，黑曲霉孢子数1×108个/mL以上。
（2）石榴皮发酵床准备
向石榴皮粉末中均匀喷洒步骤（1）所制的发酵菌悬液，菌悬液的用量占石榴皮粉末重量的40%～45%，然后把接种后的石榴皮粉末装入方形塑料槽内，做成石榴皮发酵床，码放在发酵室内的货架上。
（3）石榴皮的固态发酵
调控发酵室的温度在31～35 ℃范围之内，湿度保持在85%～90%，静置发酵4～5天，终止发酵，晒干或烘干得到含有鞣花酸的发酵产物。
（4）萃取
干燥的发酵产物经再次粉碎，第1次加入8～9倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取3 h，过滤；第2次向滤渣中加入6～7倍体积的无水甲醇回流萃取2 h，过滤；所得滤渣再次加入4～5倍无水甲醇回流提取1 h，再次过滤，合并3次滤液，旋蒸回收甲醇，所得固体经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。
所述的每个塑料槽的高度10～15 cm，宽30 cm，长40 cm，长和宽也可根据需要调整，装料至塑料槽的上沿平齐。
本发明的优点是：本发明使用浅塑料槽制作发酵床，装卸料方便，并可多层码放；使用2种菌混合发酵能形成互补效应，使鞣花酸转化效率更高，产品品质好，鞣花酸产品收率高和纯度高。工艺步骤简单，发酵条件温和，大大减少化学物质的消耗，环境污染小，更适合大规模的生产。我国石榴种植面积大，石榴皮资源丰富，除少部分被用于中药材以外，大部分都被废弃，造成了很大的浪费。本发明以石榴皮为原料，生产成本低，提高了产品附加值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明：
实施例1：
（1）发酵菌悬液制备
先用纯净水配置营养液，营养液含有0.5%的(NH4)2HPO3, 0.1%的MgCl2，0.1%Na2SO4，每1L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×107个/mL以上，黑曲霉孢子数1×108个/mL以上。
（2）石榴皮发酵床准备
向石榴皮粉末中均匀喷洒（1）所制的发酵菌悬液，菌悬液的用量占石榴皮粉末重量的40%，然后把接种后的石榴皮粉末装入方形塑料槽内，每个塑料槽的高度10 cm，宽30 cm，长40 cm，长和宽也可根据需要调整，装料至塑料槽的上沿平齐，做成石榴皮发酵床，码放在发酵室内的货架上。
（3）石榴皮的固态发酵
调控发酵室的温度在31℃范围之内，湿度保持在85%，静置发酵5天，终止发酵，晒干或烘干得到含有鞣花酸的发酵产物。
（4）萃取
干燥的发酵产物经再次粉碎，第1次加入8倍体积的无水甲醇70℃回流萃取3 h，过滤；第2次向滤渣中加入7倍体积的无水甲醇回流萃取2 h，过滤；所得滤渣再次加入5倍无水甲醇回流提取1 h，再次过滤，合并3次滤液，旋蒸回收甲醇，所得固体经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。
实施例2：
（1）发酵菌悬液制备
先用纯净水配置营养液，营养液含有1%的(NH4)2HPO3, 0.1%的MgCl2，0.2%Na2SO4，每1 L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×107个/mL以上，黑曲霉孢子数1×108个/mL以上。
（2）石榴皮发酵床准备
向石榴皮粉末中均匀喷洒（1）所制的发酵菌悬液，菌悬液的用量占石榴皮粉末重量的45%，然后把接种后的石榴皮粉末装入方形塑料槽内，每个塑料槽的高度15 cm，宽30 cm，长40 cm，长和宽也可根据需要调整，装料至塑料槽的上沿平齐，做成石榴皮发酵床，码放在发酵室内的货架上。
（3）石榴皮的固态发酵
调控发酵室的温度在35 ℃范围之内，湿度保持在90%，静置发酵4天，终止发酵，晒干或烘干得到含有鞣花酸的发酵产物。
（4）萃取
干燥的发酵产物经再次粉碎，第1次加入9倍体积的无水甲醇70℃回流萃取3 h，过滤；第2次向滤渣中加入6倍体积的无水甲醇回流萃取2 h，过滤；所得滤渣再次加入4倍无水甲醇回流提取1 h，再次过滤，合并3次滤液，旋蒸回收甲醇，所得固体经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。
实施例3：
（1）发酵菌悬液制备
先用纯净水配置营养液，营养液含有0.5%的(NH4)2HPO3, 0.2%的MgCl2，0.2%Na2SO4，每1L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×107个/mL以上，黑曲霉孢子数1×108个/mL以上。
（2）石榴皮发酵床准备
向石榴皮粉末中均匀喷洒（1）所制的发酵菌悬液，菌悬液的用量占石榴皮粉末重量的43%，然后把接种后的石榴皮粉末装入方形塑料槽内，每个塑料槽的高度13 cm，宽30 cm，长40 cm，长和宽也可根据需要调整，装料至塑料槽的上沿平齐，做成石榴皮发酵床，码放在发酵室内的货架上。
（3）石榴皮的固态发酵
调控发酵室的温度在33 ℃范围之内，湿度保持在88%，静置发酵5天，终止发酵，晒干或烘干得到含有鞣花酸的发酵产物。
（4）萃取
干燥的发酵产物经再次粉碎，第1次加入8.5倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取3 h，过滤；第2次向滤渣中加入6.5倍体积的无水甲醇回流萃取2 h，过滤；所得滤渣再次加入4～5.5倍无水甲醇回流提取1 h，再次过滤，合并3次滤液，旋蒸回收甲醇，所得固体经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。

Claims (4)

1.一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸，其特征在于，包括以下步骤 ：
（1）发酵菌悬液制备
先用纯净水配置营养液，营养液含有0.5%～1%的(NH4)2HPO3, 0.1%～0.2%的MgCl2，0.1%-0.2%Na2SO4，每1 L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×107个/mL以上，黑曲霉孢子数1×108个/mL以上；
（2）石榴皮发酵床准备
向石榴皮粉末中均匀喷洒步骤（1）所制的发酵菌悬液，菌悬液的用量占石榴皮粉末重量的40%～45%，然后把接种后的石榴皮粉末装入方形塑料槽内，做成石榴皮发酵床，码放在发酵室内的货架上；
（3）石榴皮的固态发酵
调控发酵室的温度在31～35 ℃范围之内，湿度保持在85%～90%，静置发酵4～5天，终止发酵，晒干或烘干得到含有鞣花酸的发酵产物；
（4）萃取
干燥的发酵产物经再次粉碎，第1次加入8～9倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取3 h，过滤；第2次向滤渣中加入6～7倍体积的无水甲醇回流萃取2 h，过滤；所得滤渣再次加入4～5倍无水甲醇回流提取1 h，再次过滤，合并3次滤液，旋蒸回收甲醇，所得固体经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。
2.根据权利要求1所述的一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸，其特征是：所述的每个塑料槽的高度10～15 cm，宽30 cm，长40 cm，长和宽也可根据需要调整，装料至塑料槽的上沿平齐。
3.一种如权1和权2通过固态发酵石榴皮制备鞣花酸的方法，其特征在于，包括以下步骤 ：
（1）发酵菌悬液制备
先用纯净水配置营养液，营养液含有0.5%～1%的(NH4)2HPO3, 0.1%～0.2%的MgCl2，0.1%-0.2%Na2SO4，每1 L营养液再加入大肠杆菌悬液10 mL，加入黑曲霉孢子悬液10 mL，使其中的大肠杆菌达到1×107个/mL以上，黑曲霉孢子数1×108个/mL以上；
（2）石榴皮发酵床准备
向石榴皮粉末中均匀喷洒步骤（1）所制的发酵菌悬液，菌悬液的用量占石榴皮粉末重量的40%～45%，然后把接种后的石榴皮粉末装入方形塑料槽内，做成石榴皮发酵床，码放在发酵室内的货架上；
（3）石榴皮的固态发酵
调控发酵室的温度在31～35 ℃范围之内，湿度保持在85%～90%，静置发酵4～5天，终止发酵，晒干或烘干得到含有鞣花酸的发酵产物；
（4）萃取
干燥的发酵产物经再次粉碎，第1次加入8～9倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取3 h，过滤；第2次向滤渣中加入6～7倍体积的无水甲醇回流萃取2 h，过滤；所得滤渣再次加入4～5倍无水甲醇回流提取1 h，再次过滤，合并3次滤液，旋蒸回收甲醇，所得固体经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。
4.根据权利要求3所述的一种固态发酵石榴皮制备鞣花酸的方法，其特征是：所述的每个塑料槽的高度10～15 cm，宽30 cm，长40 cm，长和宽也可根据需要调整，装料至塑料槽的上沿平齐。
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