CN102250981A - 一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法，属药品、保健品领域。该方法采用以石榴皮为主要成分的培养基，选用黑曲霉(Aspergillusniger 3.316)作为发酵菌种，进行固态发酵。石榴皮固态发酵条件为：pH 5～7，47％～60％初始水润湿，润湿液中加入0.5％的NH₄NO₃作为N源，30℃发酵5～7天。发酵后产物经过纯化和脱水步骤，可获得高品质的鞣花酸产品。以石榴皮作为原料价格低廉，既保证了鞣花酸产品的高收率和高纯度，又具有突出的成本优势，适合大规模生产。

Description

一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法

技术领域

本发明涉及一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法，属药品、保健品技术领域。

背景技术

鞣花酸(ellagic acid)，分子式C₁₄H₆O₈，是一种广泛存在于各种坚果、软果中的天然多酚类化合物。它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。它不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在。纯鞣花酸是一种黄色针状晶体，微溶于水、醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚。

鞣花酸具有较强的抗脂质过氧化、捕捉自由基的能力，可以抑制多环芳香烃、黄曲霉毒素和芳香胺等引发变的癌变。其主要功能为：

(1)抗癌/抗突变性能：抑制致癌剂的代谢活动，解除致癌物的毒性，致癌物清除剂，占据DNA上可能和致癌物质或其代谢物反应的位置；

(2)对人体免疫缺陷病毒具有抑制作用；

(3)抗氧化作用；

(4)其它作用：具有胃肠动力学和泌尿生殖动力学作用，具有凝血功能，具有降压、镇静作用。

鞣花酸可以通过化学合成法和天然产物降解法得到，其制备方法主要有以下几种：

一种是从植物中提取鞣花酸。在树莓、草莓、石榴以及蕨类等植物中含有少量游离的鞣花酸(1％)，用此工艺可生产高纯度的鞣花酸。但由于原料成本较高、且鞣花酸含量低而实际意义不大。

一种是通过倍酸(或其酯)的氧化聚合。没食子酸(酯)在酶的作用下氧化聚合制取鞣花酸。此工艺过程中，鞣花酸的产率为20％～30％。但没食子酸(酯)的制备过程繁琐复杂，酶也需要精制纯化，而且产物中还有一种未知的醌类物质，其与鞣花酸的比例为1∶2.4，给产品的分离纯化带来了一定的困难，目前较少用此法进行鞣花酸的生产。

目前公开了两种以石榴皮为原料的鞣花酸制备方法。一种是酸水解法制备鞣花酸的工艺(专利号：200510002081.X)，此法具有较高的产率和纯度，但对设备抗腐蚀能力要求很高；另一种是酶催化法(专利号：200810056007.X)，其主要过程分为两步：液态发酵产酶阶段和酶促转化阶段，此法过程繁琐，且酶促转化条件要求严格，不易控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种以石榴皮为底物固态发酵制备鞣花酸的方法。通过直接以石榴皮粉末为发酵底物，黑曲霉固态发酵法生产鞣花酸，经纯化得到高纯度鞣花酸。此方法操作简单，得到的鞣花酸产品具有很高的纯度和产率。

本发明以黑曲霉(购买自工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种编号3.316)为发酵菌种，以石榴皮为发酵底物，进行固态发酵。发酵过程中，黑曲霉合成单宁酶并将其分泌到胞外，酶催化石榴皮中的鞣花单宁降解生成鞣花酸，发酵产物经纯化和脱水后获得高纯度鞣花酸，包括以下步骤：

(1)石榴皮的固态发酵

将石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用占总重量47％～60％的初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％NaCl、0.1％MgSO₄和0.5％NH₄NO₃，其中NH₄NO₃作为N源，pH 5～7，115℃灭菌30min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillusniger 3.316)孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为5g石榴皮添加1mL浓度为1×10¹⁰个/mL的黑曲霉孢子悬液。混匀并静置培养，30℃发酵5～7天，得到含有鞣花酸的发酵产物。

(2)鞣花酸的纯化

发酵产物烘干粉碎后，加入10～30倍质量的纯甲醇，70℃萃取，萃取液悬蒸至干，得到的固体用去离子水洗涤，离心分离，干燥后得到鞣花酸产品。

(3)脱水

将鞣花酸产品加入无水乙醇，于70～80℃下加热回流1～3h，过滤，固体干燥，得淡黄色鞣花酸产品。

为了提高产率，在步骤(2)中，甲醇萃取和水洗过程均分两次完成，每次1～3小时。

本发明的实质是以石榴皮为固态发酵底物，黑曲霉发酵产单宁酶，其特异性高，专一性的降解鞣花单宁中的酯键，使石榴皮中鞣花单宁降解生成鞣花酸，经分离纯化后获得高纯度的鞣花酸，纯度在95％以上。

本发明的优点是：工艺简单，制备过程绿色化，三废排放少，适合大规模的生产，产品品质好，鞣花酸产品收率高和纯度高。我国是石榴种植大国，其果皮除被部分用于中药材以外，大部分都被人们抛弃，造成了很大的浪费。本发明以石榴皮为原料，原材料成本低，提高农产品的附加值。本发明采用固态发酵法生产鞣花酸，由于发酵条件温和，无需高温，高压等操作，改善了生产环境，大大节约化学物质的消耗量，且三废污染小，容易治理。

具体实施方式

实施例1：

(1)石榴皮的固态发酵

将石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用47％初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％NaCl、0.1％MgSO₄和0.5％NH₄NO₃作为N源，pH 5，115℃灭菌30min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3.316)孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为5g石榴皮添加1mL浓度为1×10¹⁰个/mL的黑曲霉孢子悬液。混匀并静置培养，30℃发酵5天，得到含有鞣花酸的发酵产物。

(2)鞣花酸的纯化

发酵产物烘干粉碎后，加入10倍质量的纯甲醇，70℃萃取两次，每次1小时。萃取液悬蒸至干，回收甲醇，得到的固体用去离子水洗涤两次，每次1小时，离心分离，干燥后得到鞣花酸产品。

(3)脱水

将鞣花酸产品加入纯乙醇，于70℃下加热回流1小时，过滤，固体干燥，得淡黄色鞣花酸产品，纯度96.6％，收率75.7％。

实施例2：

(1)石榴皮的固态发酵

将石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用占总重量60％的初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％NaCl、0.1％MgSO₄和0.5％NH₄NO₃作为N源，pH7，115℃灭菌30min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3.316)孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为5g石榴皮添加1mL浓度为1×10¹⁰个/mL的黑曲霉孢子悬液。混匀并静置培养，30℃发酵7天，得到含有鞣花酸的发酵产物。

(2)鞣花酸的纯化

发酵产物烘干粉碎后，加入30倍质量的纯甲醇，70℃萃取两次，每次3小时，萃取液悬蒸至干，回收甲醇，得到的固体用去离子水洗涤两次，每次3小时，离心分离，干燥后得到鞣花酸产品。

(3)脱水

将鞣花酸产品加入纯乙醇，于80℃下加热回流2小时，过滤，干燥，得淡黄色鞣花酸产品，纯度97.5％，收率78.3％。

实施例3：

(1)石榴皮的固态发酵

将石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用占总重量53％的初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％NaCl、0.1％MgSO₄和0.5％NH₄NO₃作为N源，pH6，115℃灭菌30min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3.316)孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为5g石榴皮添加1mL浓度为1×10¹⁰个/mL的黑曲霉孢子悬液。混匀并静置培养，30℃发酵6天，得到含有鞣花酸的发酵产物。

(2)鞣花酸的纯化

发酵产物烘干粉碎后，加入20倍质量的纯甲醇，70℃萃取两次，每次2小时。萃取液悬蒸至干，回收甲醇，得到的固体用去离子水洗涤两次，每次2小时，离心分离，干燥后得到鞣花酸产品。

(3)脱水

将鞣花酸产品加入纯乙醇，于75℃下加热回流2小时，过滤，干燥，得淡黄色鞣花酸产品，纯度98.3％，收率80.3％。

Claims (2)

1.一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)石榴皮的固态发酵

将石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用占总重量47％～60％的初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％NaCl、0.1％MgSO₄和0.5％NH₄NO₃，其中NH₄NO₃作为N源，pH 5～7，115℃灭菌30min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillusniger 3.316)孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为5g石榴皮添加1mL浓度为1×10¹⁰个/mL的黑曲霉孢子悬液，混匀并静置培养，30℃发酵5～7天，得到含有鞣花酸的发酵产物；

(2)鞣花酸的纯化

发酵产物烘干粉碎后，加入10～30倍质量的纯甲醇，70℃萃取，萃取液悬蒸至干，得到的固体用去离子水洗涤，离心分离，干燥后得到鞣花酸产品；

(3)脱水

将鞣花酸产品加入无水乙醇，于70～80℃下加热回流1～3h，过滤，固体干燥，得淡黄色鞣花酸产品。

2.权利要求1的一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法，其特征在于，甲醇萃取和水洗过程均两次完成，每次1～3小时。