CN117159600B - 一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用 - Google Patents

一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117159600B
CN117159600B CN202311129580.XA CN202311129580A CN117159600B CN 117159600 B CN117159600 B CN 117159600B CN 202311129580 A CN202311129580 A CN 202311129580A CN 117159600 B CN117159600 B CN 117159600B
Authority
CN
China
Prior art keywords
parts
weight
ellagic acid
solution
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311129580.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN117159600A (zh
Inventor
黄格昕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhencui Guangdong Innovation Technology Co ltd
Original Assignee
Zhencui Guangdong Innovation Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhencui Guangdong Innovation Technology Co ltd filed Critical Zhencui Guangdong Innovation Technology Co ltd
Priority to CN202311129580.XA priority Critical patent/CN117159600B/zh
Publication of CN117159600A publication Critical patent/CN117159600A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117159600B publication Critical patent/CN117159600B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/06—Peri-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用，属于植物提取技术领域。将石榴外植体进行愈伤组织培养，经过诱导后，获得高诱导石榴愈伤组织，粉碎，酶促发酵，产物经过碱提取、醇提取后，合并酸水解，洗涤，除杂，重结晶，得到鞣花酸，经过包埋制得了鞣花酸包合物。本发明采用愈伤组织诱导产生高诱导石榴愈伤组织，并经过酶促发酵，碱提取和醇提取复合提取的方法，大大提高了鞣花酸的产率，同时经过纯化后得到的高纯度、高品质鞣花酸经过包埋后得到包合物溶解度提高，稳定性好，吸收和利用度明显提高，具有更好的生理活性，具有广阔的应用前景。

Description

一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用。
背景技术
鞣花酸(2,3,7,8-tetrahydroxybenzopyrano[5,4,3cde]benzopyran-5,10-dione)是没食子酸的二聚衍生物，是一种广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的天然多酚物质。在自然界，它不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以易水解的鞣花单宁的形式存在。鞣花酸的分子式是C14H6O8，微溶于水、醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚。纯鞣花酸是一种黄色针状晶体，熔点(吡啶)大于360℃。
鞣花酸的多羟基结构决定了它具有多种生理活性。研究表明，鞣花酸具有良好的抑制肿瘤、抗氧化、凝血、抑制细菌和病毒、镇定、降压等作用。因而，它在食品、医药、化工等领域被广泛应用。但受鞣花酸理化性质的限制，它的提取、纯化一直没有良好的技术突破，限制了植物来源的鞣花酸的生产和应用。
石榴(Punica granatumL)属于石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，要分布在亚热带及温带地区，在我国南北各地区均有石榴种植，我国有五个最有影响的石榴产区：即陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自。石榴皮是石榴的干燥果皮，呈不规则的片状或瓢状，大小不一，厚1.5-3mm。外表面红棕色、棕黄色或暗棕色，略有光泽，粗糙，有多数疣状突起。有的有突起的筒状宿萼及粗短果梗或果梗痕。内表面黄色或红棕色，有隆起呈网状的果蒂残痕。质硬而脆，断面黄色，略显颗粒状。无臭，味苦涩。石榴皮有涩肠止遗，止血止带，杀虫敛疮。主治久泻久痢，滑泄漏精，肠风下血，崩漏带下，虫积腹痛，疥癣，疮疡，烫伤等作用。现代医学研究证明石榴皮具有的：抗生殖器疱疹病毒(HSV-2)；抗菌；抗癌；免疫调节；降血糖；改善心血管系统；抑制胃酸分泌及凝集精液和体内抗免生育作用，主要与石榴皮中所含的多酚类成分有关。
石榴皮中的总多酚类物质主要包括：黄酮类化合物、缩合单宁和可水解单宁，安石榴苷是石榴皮总多酚中的主要成分，占石榴皮总多酚干重的60％，属于可水解单宁的天然衍生物,可以通过水解安石榴甙生成一分子的安石榴林和鞣花酸。
欧洲专利(EP 0 390 107A2 Kiyoshi M.，Yasuhiko I，，Katsumi Y.，et al)公开了一种产量为50-60％的鞣花酸，是以五倍子为原料，用甲醇提取，不溶物过滤后滤液由40％的NaOH溶液调pH至7.9，再加1.89g NaHCO3在爱佗美锥形瓶中，在温度25℃时振摇20小时，摇速为200rpm，然后在每20ml反应液中加4ml0.1mol/L盐酸，离心分离得沉淀即得。但是该方法中应用的原料为五倍子，得到的鞣花酸品质较低，外观与颜色较差，且制备方法步骤繁多，周期长，生产成本高，不易大规模投产。
专利CN102250981B公开了一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法，以石榴皮为原料，选用黑曲霉为发酵菌种，进行固态发酵，其中石榴皮需要水提前润湿，润湿液中提供氮源，发酵5-7天，发酵后产物经纯化、脱水得到鞣花酸(鞣花酸纯度在95％以上，收率为75.7％)。专利CN101701234A公开了一种用生物酶提取石榴皮渣中鞣花酸的方法，以石榴皮为原料，水为溶剂，用生物酶将鞣花单宁降解为鞣花酸(实施例中鞣花酸提取率为1.18g/100g原料)。以上两个专利中鞣花酸的提取率按石榴皮原料计，均低于本发明方法中的提取率(超过10g/100g原料)。专利CN107400686A公开了一种固态发酵石榴皮制备的鞣花酸及其备方法，以石榴皮为原料，以能合成单宁酶的黑曲霉和大肠杆菌为发酵菌种，经过制备发酵菌悬液、制备石榴皮发酵床、固态发酵石榴皮和萃取得到鞣花酸，发酵时间4-5天，发酵时间较长。但是，这些发明专利利用黑曲霉或/和大肠杆菌进行好氧固态发酵方式，需要长时间通入大量空气(或者氧气)才能保证发酵顺利进行，过程耗能较高导致生产成本高，同时，由于石榴皮中的鞣花酸含量并不能达到很高，从而使得整体的收率不高。
发明内容
本发明的目的在于提出一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用，采用愈伤组织诱导产生高诱导石榴愈伤组织，并经过酶促发酵，碱提取和醇提取复合提取的方法，大大提高了鞣花酸的产率，同时经过纯化后得到的高纯度、高品质鞣花酸经过包埋后得到包合物溶解度提高，稳定性好，吸收和利用度明显提高，具有更好的生理活性，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种石榴愈伤组织中鞣花酸的制备方法，将石榴外植体进行愈伤组织培养，经过诱导后，获得高诱导石榴愈伤组织，粉碎，酶促发酵，产物经过碱提取、醇提取后，合并酸水解，洗涤，除杂，重结晶，得到鞣花酸，经过包埋制得了鞣花酸包合物。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴外植体用清水清洗，依次用次氯酸钙溶液、氯化汞溶液、乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中进行愈伤组织培养；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，继续进行组织培养，获得高诱导石榴愈伤组织；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，粉末加入水中，灭菌，加入复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，酶促发酵培养，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
S4.碱提取：将步骤S3制得的发酵产物加入1-3wt％的碳酸钠溶液中，加热搅拌提取，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.醇提取：将步骤S4中的固体加入乙醇水溶液中，加热搅拌提取，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值，加热水解，趁热过滤，洗涤，除杂，重结晶，得到鞣花酸；
S7.包埋：将步骤S6制得的鞣花酸和羟丙基-β-环糊精溶于N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将壳聚糖溶于酸液中，得到B液；将A液和B液混合，超声分散均匀，搅拌反应，加入丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述石榴外植体为茎段、茎尖、叶柄或子叶；所述氯酸钙溶液的浓度为2-4wt％，所述氯化汞溶液的浓度为0.1-0.15wt％，所述乙醇溶液的浓度为70-75wt％；所述培养基的配方为MS培养基+3-5wt％的蔗糖+1mg/L的NAA+0.2-0.5mg/L的6-BA+3-5mg/L的GA3；所述培养的条件为在25±2℃、湿度65±5％、17-19h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1350-1600Lx，培养时间为13-15天；步骤S2中所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为5-7:3-5，添加量为体系总质量的5-7wt％，所述继续培养的时间为5-7天。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述粉末、水、复合酶的质量比为15-20:120-150:2-3，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为5-7:2-3，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2-3v/v％和1-2v/v％，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL，所述酶促发酵培养的条件为39-42℃，50-70r/min，有氧条件下，酶促发酵培养24-36h。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述发酵产物和1-3wt％的碳酸钠溶液的质量比为10-12：100，所述加热搅拌提取的温度为60-65℃，时间为2-4h；步骤S5中所述固体和乙醇水溶液的质量比为15-20:70-100，所述乙醇水溶液的浓度为50-60wt％，所述加热搅拌提取的温度为45-55℃，时间为1-3h；步骤S6中所述调节pH值为3-4，所述加热水解的温度为70-75℃，时间为1-2h，所述除杂和重结晶的方法为将固体加入水中，加入EDTA二钠和活性炭，搅拌吸附，加入18-22倍体积的甲醇，加热回流反应1-2h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述鞣花酸、羟丙基-β-环糊精、N-甲基吡咯烷酮的质量比为12-15：30-50:200-250，所述壳聚糖和酸液的质量比为10-12:100，所述酸液为2-3wt％的醋酸溶液，所述A液和B液的质量比为20-25:10-12，所述搅拌反应的时间为1-2h，所述丙酮的添加量为10-20倍溶液体积。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴外植体用清水清洗，依次用2-4wt％次氯酸钙溶液、0.1-0.15wt％氯化汞溶液、70-75wt％乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5％、17-19h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1350-1600Lx，培养13-15天；
所述培养基的配方为MS培养基+3-5wt％的蔗糖+1mg/L的NAA+0.2-0.5mg/L的6-BA+3-5mg/L的GA3；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的5-7wt％，继续进行组织培养5-7天，获得高诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为5-7:3-5；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将15-20重量份粉末加入120-150重量份水中，灭菌，加入2-3重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2-3v/v％和1-2v/v％，39-42℃，50-70r/min，有氧条件下，酶促发酵培养24-36h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为5-7:2-3；
S4.碱提取：将10-12重量份步骤S3制得的发酵产物加入100重量份1-3wt％的碳酸钠溶液中，加热至60-65℃，搅拌提取2-4h，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.醇提取：将15-20重量份步骤S4中的固体加入70-100重量份50-60wt％的乙醇水溶液中，加热中45-55℃，搅拌提取1-3h，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值为3-4，加热至70-75℃，搅拌水解1-2h，趁热过滤，洗涤，将10-15重量份固体加入100重量份水中，加入0.5-1重量份EDTA二钠和1-2重量份活性炭，搅拌吸附，加入18-22倍体积的甲醇，加热回流反应1-2h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸；
S7.包埋：将12-15重量份步骤S6制得的鞣花酸和30-50重量份羟丙基-β-环糊精溶于200-500重量份N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将10-12重量份壳聚糖溶于100重量份2-3wt％的醋酸溶液中，得到B液；将200-250重量份A液和100-120重量份B液混合，超声分散均匀，搅拌反应1-2h，加入10-20倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的鞣花酸包合物。
本发明进一步保护一种上述石榴愈伤组织中鞣花酸在制备抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血糖的产品中的应用。
本发明进一步保护一种抗肿瘤组合物，由以下原料按重量份制备而成：上述的鞣花酸包合物10-15份、人参皂苷Rg3 1-2份、白藜芦醇2-3份。
本发明具有如下有益效果：
石榴愈伤组织是利用植物组织培养技术，利用外植体培育的离体组织，通过人为调控可以用于生产石榴活性次生代谢产物或种苗,具有可控、周期短、限制少等优势，通常愈伤组织的研究主要在于诱导和分化，而本发明中通过添加诱导组合物，能够促进石榴愈伤组织大量生产有效的活性次生代谢产物，从而大大提高了鞣花酸的产率和品质，获得高品质高纯的鞣花酸产品。
本发明中添加的诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，其中儿茶酸可以通过愈伤组织的酶解、代谢产生安石榴苷等单宁类次生代谢产物，经过水解能够制得鞣花酸，莽草酸可以通过愈伤组织的酶解、代谢产生没食子酸、没食子酸酯，并进一步通过细胞内过氧化酶或脱氢酶的作用下制得鞣花酸，从而通过添加合适量的诱导组合物，大大提高了愈伤组织中活性次生代谢产物，并经过一些列代谢反应后，提高了鞣花酸的含量。
进一步，本发明将高诱导石榴愈伤组织经过酶促发酵，复合酶包括纤维素酶和果胶酶，能够通过酶解促进石榴细胞的细胞壁破裂，胶质内容物降解，从而使得细胞内大量的活性组分得以溶出，在配合枯草芽孢杆菌和白参菌的发酵作用下，发酵过程中产生的大量的酶，其中白参菌在发酵的过程中产生的多种酶，能够催化基质中纤维素产生绿原酸、多酚等，这些多酚类化合物进一步通过发酵，产生的代谢产物能够提高了活性内容物向没食子酸、鞣花酸等的转化，大大提高了鞣花酸的产率。
本发明将发酵产物加入碳酸钠溶液中，鞣花酸易溶于碳酸钠溶液，能够将发酵产物中大部分游离的鞣花酸溶解到就碱提取液中，获得含鞣花酸的碱提取液；然后经过乙醇水溶液提取，将大部分的没食子酸、没食子酸酯、安石榴苷、鞣花酸的缩合形式、鞣花酸苷、单宁酸等复杂的有机结构以及鞣花酸的上级产物溶解至乙醇水溶液中，从而得到了醇提取液；将碱提取液和醇提取液混合后，复杂结构和上级产物在酸性条件下水解，从而获得了大量的鞣花酸，经过复合提取，大大提高了鞣花酸的产率。将获得的鞣花酸的粗品中加入EDTA二钠和活性炭，将其中的杂质和金属离子进行除去，并经过甲醇纯化，重结晶等工艺，获得了高纯度、高品质的鞣花酸。
但是，通常制得的鞣花酸的水溶性差、溶液稳定性差、透皮渗透性差等缺点使其应用受到了限制，使得其生物利用度较低，本发明通过用羟丙基-β-环糊精和壳聚糖形成复合包埋物，由于羟丙基-β-环糊精为环状中空的内疏水外亲水的圆筒状分子，壳聚糖上含有丰富的羟基结构，从而使得鞣花酸进入环糊精分子内并在壳聚糖分子中缠绕形成包合物，大大提高了包合物的的亲水性、耐酸耐碱性，从而提高了产物的溶解度，同时具有很好的稳定性，进入人体后，大大提高了鞣花酸的水溶性和溶出度，透皮吸收效果也明显提高，从而使得人体对鞣花酸的吸收和利用度明显提高，从而更有效的发挥了其生理作用。
鞣花酸具有抗氧化、抗癌变、抗诱变、抗突变、抗菌和抗病毒等作用，经过制成包合物后，大大提高了其生物利用度，将其与人参皂苷Rg3和白藜芦醇混合制得的组合物，具有很好的抗癌效果。
本发明采用愈伤组织诱导产生高诱导石榴愈伤组织，并经过酶促发酵，碱提取和醇提取复合提取的方法，大大提高了鞣花酸的产率，同时经过纯化后得到的高纯度、高品质鞣花酸经过包埋后得到包合物溶解度提高，稳定性好，吸收和利用度明显提高，具有更好的生理活性，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例2中各组累计释放率对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
纤维素酶，1万U/g，果胶酶2万U/g，购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司；枯草芽孢杆菌，1000亿cfu/g，购于广州真微生物科技有限公司；白参菌，购于湖北千宝食用菌有限公司。
活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌和白参菌分别接种至高氏培养基，40℃，50r/min，有氧条件下活化培养24h，制得菌种种子液。
实施例1
本实施例提供一种石榴愈伤组织中鞣花酸的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴幼苗的茎段用清水清洗，依次用2wt％次氯酸钙溶液、0.1wt％氯化汞溶液、70wt％乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5％、17h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1350Lx，培养13天；
所述培养基的配方为MS培养基+3wt％的蔗糖+1mg/L的NAA(萘乙酸)+0.2mg/L的6-BA(细胞分裂素)+3mg/L的GA3(赤霉素)；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的7wt％，继续进行组织培养5天，获得高诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为5:3；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将15重量份粉末加入120重量份水中，灭菌，加入2重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量分别为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2％和1％，39℃，50r/min，有氧条件下，酶促发酵培养24h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为5:2；
S4.碱提取：将10重量份步骤S3制得的发酵产物加入100重量份1wt％的碳酸钠溶液中，加热至60℃，搅拌提取2h，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.醇提取：将15重量份步骤S4中的固体加入70重量份50wt％的乙醇水溶液中，加热中45℃，搅拌提取1h，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值为3，加热至70℃，搅拌水解1h，趁热过滤，洗涤，将10重量份固体加入100重量份水中，加入0.5重量份EDTA二钠和1重量份活性炭，搅拌吸附20min，加入18倍体积的甲醇，加热回流反应1h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸；
S7.包埋：将12重量份步骤S6制得的鞣花酸和30重量份羟丙基-β-环糊精溶于200重量份N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将10重量份壳聚糖溶于100重量份2wt％的醋酸溶液中，得到B液；将200重量份A液和100重量份B液混合，1000W超声分散15min，搅拌反应1h，加入10倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
实施例2
本实施例提供一种石榴愈伤组织中鞣花酸的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴幼苗的茎段用清水清洗，依次用4wt％次氯酸钙溶液、0.15wt％氯化汞溶液、75wt％乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5％、19h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1600Lx，培养15天；
所述培养基的配方为MS培养基+5wt％的蔗糖+1mg/L的NAA(萘乙酸)+0.5mg/L的6-BA(细胞分裂素)+5mg/L的GA3(赤霉素)；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的5wt％，继续进行组织培养7天，获得高诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为7:5；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将20重量份粉末加入150重量份水中，灭菌，加入3重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量分别为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为3％和2％，42℃，70r/min，有氧条件下，酶促发酵培养36h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为7:3；
S4.碱提取：将12重量份步骤S3制得的发酵产物加入100重量份3wt％的碳酸钠溶液中，加热至65℃，搅拌提取4h，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.醇提取：将20重量份步骤S4中的固体加入100重量份60wt％的乙醇水溶液中，加热中55℃，搅拌提取3h，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值为4，加热至75℃，搅拌水解2h，趁热过滤，洗涤，将15重量份固体加入100重量份水中，加入1重量份EDTA二钠和2重量份活性炭，搅拌吸附20min，加入22倍体积的甲醇，加热回流反应2h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸；
S7.包埋：将15重量份步骤S6制得的鞣花酸和50重量份羟丙基-β-环糊精溶于300重量份N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将12重量份壳聚糖溶于100重量份3wt％的醋酸溶液中，得到B液；将250重量份A液和120重量份B液混合，1000W超声分散15min，搅拌反应2h，加入20倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
实施例3
本实施例提供一种石榴愈伤组织中鞣花酸的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴幼苗的茎段用清水清洗，依次用3wt％次氯酸钙溶液、0.12wt％氯化汞溶液、72wt％乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5％、18h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1450Lx，培养14天；
所述培养基的配方为MS培养基+4wt％的蔗糖+1mg/L的NAA(萘乙酸)+0.35mg/L的6-BA(细胞分裂素)+4mg/L的GA3(赤霉素)；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的6wt％，继续进行组织培养6天，获得高诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为6:4；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，加入2.5重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量分别为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2.5v/v％和1.5v/v％，40℃，60r/min，有氧条件下，酶促发酵培养30h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2.5；
S4.碱提取：将11重量份步骤S3制得的发酵产物加入100重量份2wt％的碳酸钠溶液中，加热至62℃，搅拌提取3h，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.醇提取：将17重量份步骤S4中的固体加入85重量份55wt％的乙醇水溶液中，加热中50℃，搅拌提取2h，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值为3.5，加热至72℃，搅拌水解1.5h，趁热过滤，洗涤，将12重量份固体加入100重量份水中，加入0.7重量份EDTA二钠和1.5重量份活性炭，搅拌吸附20min，加入20倍体积的甲醇，加热回流反应1.5h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸；
S7.包埋：将13.5重量份步骤S6制得的鞣花酸和40重量份羟丙基-β-环糊精溶于350重量份N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将11重量份壳聚糖溶于100重量份2.5wt％的醋酸溶液中，得到B液；将220重量份A液和110重量份B液混合，1000W超声分散15min，搅拌反应1.5h，加入15倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的纤维素酶。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的果胶酶。
实施例6
与实施例3相比，不同之处在于，诱导组合物为单一的儿茶酸。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，诱导组合物为单一的莽草酸。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加诱导组合物。
具体如下：
S2.诱导培养：继续进行组织培养6天，获得石榴愈伤组织。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加复合酶。
具体如下：
S3.发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量分别为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2.5v/v％和1.5v/v％，40℃，60r/min，有氧条件下，发酵培养30h，灭菌，冷冻干燥，得到发酵产物。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未接种枯草芽孢杆菌菌种种子液。
具体如下：
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，加入2.5重量份复合酶，接种活化的白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量为109cfu/mL，所述活化的白参菌菌种种子液的接种量为4v/v％，40℃，60r/min，有氧条件下，酶促发酵培养30h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未接种白参菌菌种种子液。
具体如下：
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，加入2.5重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌菌种种子液的接种量为4v/v％，40℃，60r/min，有氧条件下，酶促发酵培养30h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未接种枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液。
具体如下：
S3.酶解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，加入2.5重量份复合酶，40℃，60r/min，有氧条件下，酶解30h，灭酶，冷冻干燥，得到酶解产物。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。
具体如下：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴幼苗的茎段用清水清洗，依次用3wt％次氯酸钙溶液、0.12wt％氯化汞溶液、72wt％乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5％、18h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1450Lx，培养14天；
所述培养基的配方为MS培养基+4wt％的蔗糖+1mg/L的NAA(萘乙酸)+0.35mg/L的6-BA(细胞分裂素)+4mg/L的GA3(赤霉素)；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的6wt％，继续进行组织培养6天，获得高诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为6:4；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，加入2.5重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量分别为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2.5v/v％和1.5v/v％，40℃，60r/min，有氧条件下，酶促发酵培养30h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2.5；
S4.醇提取：将17重量份步骤S3制得的发酵产物加入85重量份55wt％的乙醇水溶液中，加热中50℃，搅拌提取2h，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S5.酸水解：将步骤S4制得的醇提取液调节pH值为3.5，加热至72℃，搅拌水解1.5h，趁热过滤，洗涤，将12重量份固体加入100重量份水中，加入0.7重量份EDTA二钠和1.5重量份活性炭，搅拌吸附20min，加入20倍体积的甲醇，加热回流反应1.5h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸；
S6.包埋：将13.5重量份步骤S5制得的鞣花酸和40重量份羟丙基-β-环糊精溶于350重量份N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将11重量份壳聚糖溶于100重量份2.5wt％的醋酸溶液中，得到B液；将220重量份A液和110重量份B液混合，1000W超声分散15min，搅拌反应1.5h，加入15倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S5。
具体如下：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴幼苗的茎段用清水清洗，依次用3wt％次氯酸钙溶液、0.12wt％氯化汞溶液、72wt％乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5％、18h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1450Lx，培养14天；
所述培养基的配方为MS培养基+4wt％的蔗糖+1mg/L的NAA(萘乙酸)+0.35mg/L的6-BA(细胞分裂素)+4mg/L的GA3(赤霉素)；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的6wt％，继续进行组织培养6天，获得高诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为6:4；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，加入2.5重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量分别为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2.5v/v％和1.5v/v％，40℃，60r/min，有氧条件下，酶促发酵培养30h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2.5；
S4.碱提取：将11重量份步骤S3制得的发酵产物加入100重量份2wt％的碳酸钠溶液中，加热至62℃，搅拌提取3h，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液调节pH值为3.5，加热至72℃，搅拌水解1.5h，趁热过滤，洗涤，将12重量份固体加入100重量份水中，加入0.7重量份EDTA二钠和1.5重量份活性炭，搅拌吸附20min，加入20倍体积的甲醇，加热回流反应1.5h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸；
S6.包埋：将13.5重量份步骤S5制得的鞣花酸和40重量份羟丙基-β-环糊精溶于350重量份N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将11重量份壳聚糖溶于100重量份2.5wt％的醋酸溶液中，得到B液；将220重量份A液和110重量份B液混合，1000W超声分散15min，搅拌反应1.5h，加入15倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未进行酸水解。
具体如下：
S6.纯化：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，干燥，加入100重量份水中，加入0.7重量份EDTA二钠和1.5重量份活性炭，搅拌吸附20min，加入20倍体积的甲醇，加热回流反应1.5h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加EDTA二钠和活性炭。
具体如下：
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值为3.5，加热至72℃，搅拌水解1.5h，趁热过滤，洗涤，将12重量份固体加入100重量份水中，加入20倍体积的甲醇，加热回流反应1.5h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S7。
具体如下：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴幼苗的茎段用清水清洗，依次用3wt％次氯酸钙溶液、0.12wt％氯化汞溶液、72wt％乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5％、18h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1450Lx，培养14天；
所述培养基的配方为MS培养基+4wt％的蔗糖+1mg/L的NAA(萘乙酸)+0.35mg/L的6-BA(细胞分裂素)+4mg/L的GA3(赤霉素)；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的6wt％，继续进行组织培养6天，获得高诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为6:4；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的高诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将17重量份粉末加入135重量份水中，灭菌，加入2.5重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量分别为109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2.5v/v％和1.5v/v％，40℃，60r/min，有氧条件下，酶促发酵培养30h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为6:2.5；
S4.碱提取：将11重量份步骤S3制得的发酵产物加入100重量份2wt％的碳酸钠溶液中，加热至62℃，搅拌提取3h，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.醇提取：将17重量份步骤S4中的固体加入85重量份55wt％的乙醇水溶液中，加热中50℃，搅拌提取2h，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值为3.5，加热至72℃，搅拌水解1.5h，趁热过滤，洗涤，将12重量份固体加入100重量份水中，加入0.7重量份EDTA二钠和1.5重量份活性炭，搅拌吸附20min，加入20倍体积的甲醇，加热回流反应1.5h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸。
对比例11
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加壳聚糖。
S7.包埋：将13.5重量份步骤S6制得的鞣花酸和40重量份羟丙基-β-环糊精溶于350重量份N-甲基吡咯烷酮中，1000W超声分散15min，搅拌反应1.5h，加入15倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
实施例8
本实施例提供一种抗肿瘤组合物，由以下原料按重量份制备而成：实施例1制得的鞣花酸包合物10份、人参皂苷Rg3 1份、白藜芦醇2份。
实施例9
本实施例提供一种抗肿瘤组合物，由以下原料按重量份制备而成：实施例2制得的鞣花酸包合物15份、人参皂苷Rg3 2份、白藜芦醇3份。
实施例10
本实施例提供一种抗肿瘤组合物，由以下原料按重量份制备而成：实施例3制得的鞣花酸包合物12份、人参皂苷Rg3 1.5份、白藜芦醇2.5份。
对比例12
与实施例10相比，不同之处在于，未添加人参皂苷Rg3。
对比例13
与实施例10相比，不同之处在于，未添加白藜芦醇。
测试例1
将本发明实施例1-3和对比例11制得的鞣花酸包合物测试包封率和载药量。
精密称取鞣花酸包合物10.0mg加入10mL容量瓶中，加入1mL N-甲基吡咯烷酮，使鞣花酸包合物充分溶解，并加入甲醇，500W超声处理30min，取出，待温度降到室温之后再加入甲醇定容，摇匀，得到1mg/mL的鞣花酸包合物溶液。离心，取上清液，液相色谱检测含量，每个样品重复测定3次。
载药量＝被包合的鞣花酸/鞣花酸包合物×100％
包封率＝被包合的鞣花酸/鞣花酸的总投入质量×100％
结果见表1。
表1
组别 载药量(％) 包封率(％)
实施例1 22.5 95.6
实施例2 23.1 96.2
实施例3 23.7 96.6
对比例11 10.1 87.1
由上表可知，本发明实施例1-3制得的鞣花酸包合物载药量高，包封率高。
测试例2
将本发明实施例1-3和对比例11制得鞣花酸包合物和对比例10制得的鞣花酸进行溶解度和体外溶出测试，结果见表2和图1。
人工胃液：用5mL 37wt％HCl酸和1000mL的去离子水制得的混合溶液。人工肠液：将6.8g/L磷酸二氢钾加水500mL溶解，用氢氧化钠溶液调节pH＝6.8，之后加水稀释定容至1000mL。
饱和溶解度测定：
将样品分别加入2mL人工肠液、人工胃液，37℃度水浴搅拌48h，搅拌速度100r/min，用0.45μm的滤膜过滤，得到滤液，滤液用9倍的甲醇稀释处理，超声20min，离心，取上清液进行液相色谱进行含量测定。实验重复3次，取平均值。
体外溶出测定：
称取2mg样品分别加入200mL人工胃液中，称取2mg样品分别加入200mL人工肠液中，37℃度水浴搅拌处理，搅拌速度100r/min，并且在10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、16h和24h时取液样，每次取完液样后重新添加等体积溶出介质，离心，取上清液进行液相色谱进行含量测定，实验重复3次，取平均值。计算出样品的累积溶出率。
表2
由图1和表2可知，本发明实施例1-3制得的鞣花酸包合物的溶解度高，体外溶出速率快，24h累计释放率接近100％。
测试例3
将本发明实施例1-7和对比例1-9中得到鞣花酸进行提取率和纯度检测，结果见表3。
提取率(％)＝(鞣花酸产物质量×纯度)/高诱导石榴愈伤组织或石榴愈伤组织(对比例1)×100％
表3
由上表可知，本发明实施例1-3中的方法制得的鞣花酸提取率高，纯度高。
测试例4抗氧化性测试
将本发明实施例1-10和对比例1-13中得到产品用70wt％的乙醇溶液配制成10μg/L的溶液进行抗氧化性测试，结果见表4。以同浓度的维生素C作为对照。
1、清除DPPH·能力的测定
分别取1mL样品溶液于不同的试管中，分别加入3mL同浓度的DPPH·溶液，迅速混匀，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值，每组进行3次平行试验，结果取平均值。
DPPH·清除率(％)＝[1-(A0-A1)/A0]×100％
其中，A1为DPPH·溶液3mL与70wt％乙醇溶液1mL混合后的吸光度；A0为DPPH·溶液3mL与样品溶液1mL混合后的吸光度。
2、清除羟基自由基(·OH)能力测定
分别向试管中加入2mL样品溶液，依次加入6mmol/L FeSO4溶液2mL、6mmol/L H2O2溶液2mL、6mmo1/L的水杨酸溶液2mL，搅拌混匀，37℃反应30min，然后于510nm处测定吸光度A0；对照组用蒸馏水代替水杨酸，按以上方法测定吸光度A1；空白组用70wt％乙醇代替样品溶液，按以上方法测定吸光度A2，每组进行3次平行试验，结果取平均值。计算对·OH的清除率。
·OH清除率(％)＝[1-(A0-A1)/A2]×100％
表4
由上表可知，本发明实施例1-3中的方法制得的鞣花酸包合物具有良好的抗氧化性能。
测试例5抗肿瘤实验
1、动物分组与给药
将SPF级ICR小鼠随机分为26个处理组，分别为模型、实施例1-10组、对比例1-13组、顺铂(阳性对照)组、空白对照组，每组6只。
实施例1-10组和对比例1-10组分别灌胃给与相应药物20mg/kg。空白与模型组灌等体积饮用水。一天两次，连续给药14天。阳性药组为顺铂2mg/kg，隔日一次，共给药7次。模型组和空白对照组给与20mg/kg生理盐水。
2、模型构建、测定指标及测定方法
取第4代小鼠S180细胞(小鼠腹水瘤细胞，mouse ascitic tumor cells)，用PBS稀释至1×107个/ml的细胞悬液后接种到除了空白对照组外其他组小鼠右上肢腋下皮下，每只ICR小鼠接种0.2ml，全部操作在30min内完成。
接种前和实验结束(第14天)后称动物体重，计算体重增长率(％)，并用数显游标卡尺测瘤块的长径(a)、短径(b)。
肿瘤体积(tumor volume,TV)计算公式为：TV＝1/2×a×b2，
相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)计算公式为：RTV＝Vt/Vo，Vo为各组实验开始时测量所得肿瘤体积，Vt为实验结束时测量时的肿瘤体积。
抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖抑制率(％)＝(1-RTVt/RTVc)×100％。RTVt为实验组相对肿瘤体积，RTVc为模型组相对肿瘤体积。
体重增长率(％)＝(实验结束式动物体重-实验开始时动物体重)/实验开始时动物体重×100％
结果见表5。
表5
注释：*为与正常组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的鞣花酸包合物以及实施例8-10制得的抗肿瘤组合物有明显的抑制肿瘤生长的作用，且对体重增加无明显影响。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为单一的纤维素酶或果胶酶。对比例2与实施例3相比，步骤S3中未添加复合酶。鞣花酸的提取率下降，抗氧化性能下降，抗肿瘤性能下降。本发明将高诱导石榴愈伤组织经过酶促发酵，复合酶包括纤维素酶和果胶酶，能够通过酶解促进石榴细胞的细胞壁破裂，胶质内容物降解，从而使得细胞内大量的活性组分得以溶出，从而提高了鞣花酸的产率。
实施例6、7与实施例3相比，诱导组合物为单一的儿茶酸或莽草酸。对比例1与实施例3相比，步骤S2中未添加诱导组合物。鞣花酸的提取率下降，抗氧化性能下降，抗肿瘤性能下降。本发明中通过添加诱导组合物，能够促进石榴愈伤组织大量生产有效的活性次生代谢产物，从而大大提高了鞣花酸的产率和品质，获得高品质高纯的鞣花酸产品。本发明中添加的诱导组合物包括儿茶酸和莽草酸，其中儿茶酸可以通过愈伤组织的酶解、代谢产生安石榴苷等单宁类次生代谢产物，经过水解能够制得鞣花酸，莽草酸可以通过愈伤组织的酶解、代谢产生没食子酸、没食子酸酯，并进一步通过细胞内过氧化酶或脱氢酶的作用下制得鞣花酸，从而通过添加合适量的诱导组合物，大大提高了愈伤组织中活性次生代谢产物，并经过一些列代谢反应后，提高了鞣花酸的含量。
对比例3、4与实施例3相比，步骤S3中未接种枯草芽孢杆菌菌种种子液或白参菌菌种种子液。对比例5与实施例3相比，步骤S3中未接种枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液。鞣花酸的提取率下降，抗氧化性能下降，抗肿瘤性能下降。本发明在复合酶的协助下，配合枯草芽孢杆菌和白参菌的发酵作用下，发酵过程中产生的大量的酶，其中白参菌在发酵的过程中产生的多种酶，能够催化基质中纤维素产生绿原酸、多酚等，这些多酚类化合物进一步通过发酵，产生的代谢产物能够提高了活性内容物向没食子酸、鞣花酸等的转化，大大提高了鞣花酸的产率。
对比例6与实施例3相比，未进行步骤S4。对比例7与实施例3相比，未进行步骤S5。对比例8与实施例3相比，步骤S6中未进行酸水解。鞣花酸的提取率下降，抗氧化性能下降，抗肿瘤性能下降。本发明将发酵产物加入碳酸钠溶液中，鞣花酸易溶于碳酸钠溶液，能够将发酵产物中大部分游离的鞣花酸溶解到就碱提取液中，获得含鞣花酸的碱提取液；然后经过乙醇水溶液提取，将大部分的没食子酸、没食子酸酯、安石榴苷、鞣花酸的缩合形式、鞣花酸苷、单宁酸等复杂的有机结构以及鞣花酸的上级产物溶解至乙醇水溶液中，从而得到了醇提取液；将碱提取液和醇提取液混合后，复杂结构和上级产物在酸性条件下水解，从而获得了大量的鞣花酸，经过复合提取，大大提高了鞣花酸的产率。
对比例9与实施例3相比，步骤S6中未添加EDTA二钠和活性炭。鞣花酸的纯度下降，抗氧化性能下降，抗肿瘤性能下降。本发明将获得的鞣花酸的粗品中加入EDTA二钠和活性炭，将其中的杂质和金属离子进行除去，并经过甲醇纯化，重结晶等工艺，获得了高纯度、高品质的鞣花酸。
对比例10与实施例3相比，未进行步骤S7。抗氧化性能明显下降，抗肿瘤性能明显下降。对比例11与实施例3相比，步骤S7中未添加壳聚糖。抗氧化性能下降，抗肿瘤性能下降。通常制得的鞣花酸的水溶性差、溶液稳定性差、透皮渗透性差等缺点使其应用受到了限制，使得其生物利用度较低，本发明通过用羟丙基-β-环糊精和壳聚糖形成复合包埋物，由于羟丙基-β-环糊精为环状中空的内疏水外亲水的圆筒状分子，壳聚糖上含有丰富的羟基结构，从而使得鞣花酸进入环糊精分子内并在壳聚糖分子中缠绕形成包合物，大大提高了包合物的的亲水性、耐酸耐碱性，从而提高了产物的溶解度，同时具有很好的稳定性，进入人体后，大大提高了鞣花酸的水溶性和溶出度，透皮吸收效果也明显提高，从而使得人体对鞣花酸的吸收和利用度明显提高，从而更有效的发挥了其生理作用。
对比例12、13与实施例10相比，未添加人参皂苷Rg3或白藜芦醇。实施例3为单一的鞣花酸包合物。抗氧化性能下降，抗肿瘤性能下降。人参皂苷Rg3或白藜芦醇通过协同增效的作用，明显提高了组合物的抗氧化和抗肿瘤性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种鞣花酸包合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.石榴愈伤组织的培养：将石榴外植体用清水清洗，依次用2-4wt%次氯酸钙溶液、0.1-0.15wt%氯化汞溶液、70-75wt%乙醇溶液冲洗消毒，取出洗净，在培养基中，在25±2℃、湿度65±5%、17-19h光照，其余时间为黑暗处理，光照强度为1350-1600Lx，培养13-15天；
所述培养基的配方为MS培养基+3-5wt%的蔗糖+1mg/L的萘乙酸+0.2-0.5mg/L的细胞分裂素+3-5mg/L的赤霉素；
S2.诱导培养：向培养基中加入诱导组合物，添加量为体系总质量的5-7wt%，继续进行组织培养5-7天，获得诱导石榴愈伤组织；
所述诱导组合物为儿茶酸和莽草酸，质量比为5-7:3-5；
S3.酶促发酵水解：将步骤S2制得的诱导石榴愈伤组织挑出，洗净，干燥，粉碎，将15-20重量份粉末加入120-150重量份水中，灭菌，加入2-3重量份复合酶，接种活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL，所述活化的枯草芽孢杆菌和白参菌菌种种子液的接种量分别为2-3v/v%和1-2v/v%，39-42℃，50-70r/min，有氧条件下，酶促发酵培养24-36h，灭菌灭酶，冷冻干燥，得到发酵产物；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，质量比为5-7:2-3；
S4.碱提取：将10-12重量份步骤S3制得的发酵产物加入100重量份1-3wt%的碳酸钠溶液中，加热至60-65℃，搅拌提取2-4h，过滤，固体留用，滤液为碱提取液；
S5.醇提取：将15-20重量份步骤S4中的固体加入70-100重量份50-60wt%的乙醇水溶液中，加热中45-55℃，搅拌提取1-3h，过滤，滤液回收乙醇，得到醇提取液；
S6.酸水解：将步骤S4制得的碱提取液和步骤S5制得的醇提取液合并，调节pH值为3-4，加热至70-75℃，搅拌水解1-2h，趁热过滤，洗涤，收集固体，将10-15重量份固体加入100重量份水中，加入0.5-1重量份EDTA二钠和1-2重量份活性炭，搅拌吸附，加入18-22倍体积的甲醇，加热回流反应1-2h，趁热过滤，上清液冷却至室温，过滤，干燥，得到鞣花酸；
S7.包埋：将12-15重量份步骤S6制得的鞣花酸和30-50重量份羟丙基-β-环糊精溶于200-500重量份N-甲基吡咯烷酮中，得到A液；将10-12重量份壳聚糖溶于100重量份2-3wt%的醋酸溶液中，得到B液；将200-250重量份A液和100-120重量份B液混合，超声分散均匀，搅拌反应1-2h，加入10-20倍溶液体积的丙酮，离心，洗涤，干燥，制得鞣花酸包合物。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制得的鞣花酸包合物。
3.一种如权利要求2所述石榴愈伤组织中鞣花酸包合物在制备抗氧化、抗肿瘤的产品中的应用。
4.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，由以下原料按重量份制备而成：权利要求2所述的鞣花酸包合物10-15份、人参皂苷Rg3 1-2份、白藜芦醇2-3份。
CN202311129580.XA 2023-09-01 2023-09-01 一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用 Active CN117159600B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311129580.XA CN117159600B (zh) 2023-09-01 2023-09-01 一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311129580.XA CN117159600B (zh) 2023-09-01 2023-09-01 一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117159600A CN117159600A (zh) 2023-12-05
CN117159600B true CN117159600B (zh) 2024-02-13

Family

ID=88938978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311129580.XA Active CN117159600B (zh) 2023-09-01 2023-09-01 一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117159600B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101481714A (zh) * 2008-01-11 2009-07-15 北京化工大学 一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法
CN102250981A (zh) * 2010-05-21 2011-11-23 北京化工大学 一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101481714A (zh) * 2008-01-11 2009-07-15 北京化工大学 一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法
CN102250981A (zh) * 2010-05-21 2011-11-23 北京化工大学 一种以石榴皮为原料固态发酵制备鞣花酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
石榴鞣花酸-羟丙基-β-环糊精包合物的制备;范高福;刘修树;汤洁;龚菊梅;蔡玉华;康品方;;中成药(第06期);第1388-1392页 *
软籽石榴离体叶片愈伤组织诱导条件的优化;彭丽萍等;《安徽农业科学》;第39卷(第7期);第3835-3836，3838页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117159600A (zh) 2023-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100881634B1 (ko) 압출성형, 초음파 및 발효에 의한 우수한 사포닌 함량이증가된 홍삼액과 산삼배양근액 및 장뇌산삼액의 제조방법
KR101753077B1 (ko) 발효 인삼추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물
CN109287912B (zh) 一种提高抗氧化性的芒果乳酸饮料制备方法
CN110959853A (zh) 人参稀有皂苷组合物及其制备方法和应用
CN107006606B (zh) 一种富含功能因子的风味酸奶及其制备方法
KR20170061959A (ko) 체내 흡수율이 증진된 활성형 진세노사이드가 함유된 발효인삼 또는 발효흑홍삼 추출물 제조방법
CN111363774B (zh) 发酵乳杆菌发酵人参的方法及人参发酵产物和用途
KR101331171B1 (ko) 진세노사이드 Ｒｄ가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼 및 이의 제조방법
CN111808769B (zh) 一种短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中的应用
CN113564212A (zh) 一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法
CN113621673B (zh) 复合菌株发酵人参的方法及发酵产物和用途
CN114246208A (zh) 一种槐米发酵提取制备果蔬保鲜剂的方法
CN117159600B (zh) 一种石榴愈伤组织中鞣花酸及其制备方法和应用
WO2021093299A1 (zh) 黄芪-蝉拟青霉发酵菌质、制备方法及用途
CN105535035B (zh) 一种桦褐孔菌发酵培养组合物及其制备方法
CN101638639B (zh) 一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法
JP2008212137A (ja) 生物転換法を利用したペリヌスリンテウス菌糸体の液体培養による人参からの新規のジンセノサイド製造方法
CN113142351B (zh) 保健藤茶及生产工艺
CN111518860B (zh) 一种越橘提取物的制备方法
CN109288902B (zh) 一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法及其应用
CN117547572B (zh) 一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用
CN115299593B (zh) 一种具有解酒功能的葛根枳椇子洛神花酵素及其制备方法
KR101407607B1 (ko) 케피어를 이용한 고기능성 진세노사이드 Ｒｇ3 고함량 발효삼의 제조방법 및 그에 의한 발효삼 및 발효삼농축액
CN116491567A (zh) 一种复合植物提取物的制备方法及其在清热玫瑰花茶中的应用
CN107913296B (zh) 一种高稳定高生理活性藜麦附属物原料及制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant