CN117547572B - 一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用 - Google Patents
一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用。其制备方法包括将组合物陈皮、橘红、佛手进行泡水打浆，形成浆液，通过混合复配得到组合物原浆液，组合物原浆液经酸水解后加入碳源、氮源，灭菌处理后分别按次序接种已活化的复合乳酸菌进行液体发酵，得到复合乳酸菌发酵品。本发明提供的制备方法，将陈皮、橘红、佛手浆液中复杂且丰富的活性成分经不同的乳酸菌依次进行代谢转化，使橙皮素等成分含量相比于不经发酵的组合物浆液有显著性提高，并提高长期发酵过程下发酵体系的总多糖含量，在产品最终效果上可有效提高肺部粘膜免疫力水平。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用。
背景技术
芸香科植物的栽培品种丰富多样，部分品种的果实可被用作药材。陈皮、橘红和佛手都是传统的芸香科中药材。在中医理论中，陈皮、橘红和佛手都被认为是具有祛痰止咳效果的重要药材。目前研究表明，陈皮、橘红和佛手中含量丰富且复杂的挥发油及黄酮类物质可能是形成其特殊风味和药效的关键成分，其中橙皮苷是这些芸香科药材含量最丰富的黄酮类化合物，但橙皮苷的水溶性差，人体利用率低。
现有技术对橙皮苷的改性方法有很多，如高温酸水解等化学改性、外加α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的酶促反应以及通过曲霉属菌和雪腐镰刀菌的微生物发酵等。曲霉属和雪腐镰刀菌具有丰富的酶系统，能够将橙皮苷转化为具有较高生物活性的橙皮素或橙皮素单葡萄糖苷等成分。专利公开号为CN102925364A公开了使用曲霉属和雪腐镰刀菌规模化转化橙皮苷为橙皮素单葡萄糖苷的方法，还能避免橙皮素单葡萄糖苷进一步转化为橙皮素。然而，目前这两类菌虽然广泛应用于食品工业，但尚未被列入可应用于食品的菌种名单，不能直接添加于食品，橙皮苷发酵产物需要后续的提纯处理。
专利公开号为CN116509966A公开了一种益生菌发酵中药制剂、其制备方法及应用。该方法以桔梗、金银花、陈皮、鱼腥草、芦根等为发酵原料，利用嗜酸乳杆菌发酵对药材进行生物转化，使得上述药材经发酵后与剩余药材结合既能提高药物的活性，又能保持益生菌的功效，从而使所述发酵中药制剂具有镇咳等功效。借助益生菌发酵来提高中药制剂的口味风味，改变黄酮类化合物的组成，此类应用已经非常广泛。可影响中药原料中黄酮类化合物组成的微生物有很多，但以芸香科药材为底物，只借助乳酸菌株的组合发酵以提高橙皮素的含量为目的，提高发酵产物的免疫提升效果还未见报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法，发酵组合物原料包括陈皮、橘红和佛手，采用植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种及嗜酸乳杆菌对组合物进行联合发酵，提高了陈皮、橘红、佛手中的橙皮素和总多糖的含量。
本发明的第二个目的在于提供一种组合物的复合乳酸菌发酵品，其由上述制备方法发酵所得。
本发明的第三个目的在于提供了上述的复合乳酸菌发酵品在营养健康品领域的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种组合物的复合乳酸菌发酵品，其为以陈皮、橘红、佛手为原料，通过嗜酸乳杆菌菌株（Lactobacillus acidophilus）LFLa-208、动物双歧杆菌乳亚种菌株（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）LFBb-106、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）LFLr-219、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LFLp-202和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LFLP-213发酵获得。
如上所述的复合乳酸菌发酵品，优选地，所述组合物按陈皮、橘红、佛手原料按4:1:5
一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法，其包括如下步骤：
S1、将原料陈皮、橘红、佛手进行泡水打浆，经胶体磨研磨后得到组合物原浆液；
S2、往组合物原浆液加入柠檬酸，对组合物原浆液进行酸水解处理，往处理后的组合物原浆液加入碳源、氮源，调pH值后灭菌作为发酵组合物培养基；
S3、将植物乳杆菌LFLP-213接种到发酵组合物培养基中进行发酵；
S4、将步骤S3发酵后的发酵组合物培养基接种罗伊氏乳杆菌LFLr-219和副干酪乳杆菌LFLp-202，进行共同发酵；
S5、将步骤S4发酵后的发酵组合物培养基接种动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106，同时补充碳源，进行发酵；
S6、将步骤S5发酵后的发酵组合物培养基接种嗜酸乳杆菌LFLa-208，进行发酵；获得产品。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，将陈皮、橘红、佛手在冷水中浸泡1~2h后捞出打浆，按料液比为1:4~1:5加入冷水，获得浆液，原料可分开打浆或混合一起打浆。
如上所述的制备方法，优选地，陈皮、橘红、佛手的用量按质量比为1~5： 1~5：1~5。进一步优选地，所述组合物原浆液中陈皮、橘红、佛手分开进行打浆，按陈皮、橘红、佛手的浆液按质量比4:1:5混合，并经胶体磨研磨处理。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述柠檬酸在原浆液中的浓度为0.25mol/L，所述碳源为葡萄糖，用量为组合物原浆液质量的8~15%；所述氮源为酵母浸膏，用量为组合物原浆液质量的1~3%，pH值为6.8；灭菌的条件为121℃灭菌20 min。
进一步地，先加入柠檬酸粉末调整浆液，使柠檬酸浓度为0.25 mol/L，90℃加热搅拌4 h，对组合物原浆液进行酸水解，降温再加入碳源、氮源。
进一步地，在步骤S6中，所述碳源为150 ~250 g/L葡萄糖溶液，用量为组合物原浆液质量的1~5%。
如上所述的制备方法，优选地，菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述嗜酸乳杆菌菌株LFLa-208的保藏编号为CGMCC No. 25112，动物双歧杆菌乳亚种菌株LFBb-106的保藏编号为CGMCC No. 25111，罗伊氏乳杆菌LFLr-219的保藏编号为CGMCC No. 25110，副干酪乳杆菌LFLp-202的保藏编号为CGMCC No. 25109，植物乳杆菌LFLP-213的保藏编号为CGMCC No. 25107。
如上所述的制备方法，优选地，所述嗜酸乳杆菌菌株LFLa-208、动物双歧杆菌乳亚种菌株LFBb-106、罗伊氏乳杆菌LFLr-219、副干酪乳杆菌LFLp-202和植物乳杆菌LFLP-213先进行活化，采用改良MRS液体培养基培养后获得一级种子液，再采用二级扩大培养基，接种一级种子液分别进行扩大培养获得二级种子液，利用上述菌株的二级种子液进行发酵。
进一步优选地，所述改良MRS液体培养基每升中含有大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g和吐温-80 1.0 mL，其pH值为6.2；
所述二级扩大培养基每升中含有陈皮干粉10.0 g、橘红干粉10.0 g、佛手干粉10.0 g、大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g和吐温-80 1.0 mL，其pH值为6.2。
如上所述的制备方法，优选地，各菌种二级种子液的接种量为组合物培养基体积的0.5~2%，各菌种二级种子液的活菌数范围在1×108~5 ×108CFU/mL。
如上所述的制备方法，优选地，所有发酵均为厌氧发酵，发酵在转速50~100 rpm，37℃条件下进行；
在步骤S3中，发酵的时间为24 h；在步骤S4中，发酵的时间为48 h；在步骤S5中，发酵的时间为24 h；在步骤S6中，发酵的时间为48 h。
如上所述的制备方法，优选地，将步骤S6发酵后的产品加入赋形剂后或直接喷雾干燥，得到所述复合乳酸菌发酵品。
本发明还提供了由上述的制备方法获得的复合乳酸菌发酵品在制备提高免疫力制剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
1. 本发明提供了组合物的复合乳酸菌发酵品，发酵使用了5种乳酸菌菌株，在乳酸菌-组合物的转化体系中，组合物陈皮、橘红、佛手浆液中复杂且丰富的活性成分经不同的乳酸菌依次进行代谢转化，相比于将菌株同时投放进行发酵，合理的设置乳酸菌的添加顺序可以充分发挥菌株的发酵特点，使发酵组合物中的有效成分、活性物质能最大限度地得以转化。同时，合理的添加顺序也可以顺应乳酸菌生长代谢的物质需要，更充分的发挥乳酸菌作用。
2. 经过对比实验发现，本发明所用菌株经特定添加顺序发酵出乎意料的显著提高了发酵液的橙皮素含量，其总多糖水平在长时间发酵下未下降且有显著性提高，表明本发明所用菌株的应用具有突出效果，在产品最终效果上可更显著的提高肺部粘膜免疫力水平。
3. 本发明优选了陈皮、橘红和佛手三种组合物作为原料。这种配伍方法可以充分利用三味同属芸香科原料的传统功效，并且通过橘红的添加弥补了陈皮中橙皮苷含量偏少的不足，通过添加佛手大大丰富了原料的粗多糖类物质，从发酵反应底物含量搭配的角度与乳酸菌形成协同配合。
4. 本发明所用的5株乳酸菌可以直接应用于食品工业使用，通过探索发酵程序，发现5株菌株按特定程序发酵可以出乎意料的、更好的提高乳酸菌对陈皮、橘红和佛手三味芸香科药材中橙皮素的含量，可以起到调节发酵液中黄酮类物质含量占比的作用；同时，5株菌株按特定程序发酵还显著增加了发酵液的总多糖含量。
具体实施方式
本发明应用5种乳酸菌按特定顺序对陈皮、橘红和佛手的混合浆液进行发酵，主要以增加药材中橙皮苷的转化率，提高橙皮素的含量为目的，配合经灭活处理的乳酸菌及其代谢产物，达到提高人体呼吸道免疫功能的营养健康功效。5种乳酸菌按特定顺序发酵可以将陈皮、橘红和佛手中丰富的黄酮类化合物进行生物转化，将橙皮苷等双糖苷化合物转化为橙皮素等苷元，虽然橙皮素作为橙皮苷的苷元水溶性相比有所下降，但却更有利于肠道吸收。乳酸菌发酵使橙皮素含量提高可改变原料黄酮类化合物内部成分占比，也可提高黄酮类化合物的生物利用率，同时增加发酵液中的多糖含量。将经过乳酸菌发酵的陈皮、橘红和佛手制成饮料应用于营养健康领域，可有效利用原料本身丰富的功能活性成分，又能叠加整合原料和乳酸菌的功效。其中，乳酸菌经过充分发酵后再进行灭菌处理，以后生元的形式作为产品组分，无需担心乳酸菌的保存和活性问题。
本发明实施例1中所用的菌株均为自主分离、筛选、纯化、鉴定后的菌株，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LFLP-213，该菌株LFLP-213于2022年06月17日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）简称CGMCC，进行专利保藏，保藏编号：CGMCC No.25107；罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）LFLr-219于2022年06月17日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利保藏，保藏编号：CGMCC No. 25110；副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LFLp-202，于2022年06月17日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利保藏，保藏编号：CGMCC No. 25109；动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）LFBb-106于2022年06月17日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利保藏，保藏编号：CGMCC No.25111；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LFLa-208于2022年06月17日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利保藏，保藏编号：CGMCC No. 25112。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格。
实施例1 一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备
本实施例中所用的原料：陈皮产自广东新会、橘红产自广东高州、佛手产自广东高要；陈皮干粉、橘红干粉、佛手干粉均可用西安小草植物科技有限责任公司；发酵中所用菌株为分离纯化的菌株，其中嗜酸乳杆菌菌株，名称：Lactobacillus acidophilus LFLa-208，保藏编号：CGMCC No. 25112；动物双歧杆菌乳亚种菌株，名称：Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis LFBb-106，保藏编号：CGMCC No. 25111；罗伊氏乳杆菌，名称：Lactobacillus reuteri LFLr-219，保藏编号：CGMCC No. 25110；副干酪乳杆菌，名称：Lactobacillus paracasei LFLp-202，保藏编号：CGMCC No. 25109；植物乳杆菌，名称：Lactobacillus plantarum LFLP-213，保藏编号：CGMCC No. 25107。
一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法，具体步骤如下：
1、陈皮、橘红、佛手三味原料干制品的预处理
将陈皮、橘红、佛手干制品进行清洗，除去杂质、霉变及虫蛀。
2、制备组合物原浆液：
准确称量1质量份的陈皮干制品于10倍质量的冷水中浸泡2 h，将陈皮捞出至打浆机中打浆，按料液质量比为1:4添加冷水，得到陈皮浆液；准确称量1质量份的橘红干制品于10倍质量的冷水中浸泡2 h，将橘红捞出至打浆机中打浆，按料液质量比为1:4添加冷水，得到橘红浆液；准确称量1质量份的佛手干制品于10倍质量的冷水中浸泡2 h，将佛手捞出至打浆机中打浆，按料液质量比为1:4添加冷水，得到佛手浆液。陈皮浆液、橘红浆液和佛手浆液按4:1:5的质量比进行混合，经胶体磨研磨后得到组合物原浆液，研磨后的粒径为40 μm。
3、发酵组合物培养基的制备：
往组合物原浆液中加入柠檬酸粉末，调整浆液柠檬酸浓度为0.25 mol/L，90℃加热搅拌4 h。浆液冷却至室温后，加入占组合物原浆液总质量10%的葡萄糖和1%的酵母浸膏，加入氢氧化钠回调pH至6.8，121℃灭菌20 min。
4、乳酸菌的活化：
(1) 培养基的配置：使用替换动物性成分的改良MRS液体培养基作为乳酸菌活化培养基，配方具体为1 L改良MRS液体培养基含大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，吐温-80 1.0 mL，使用氢氧化钠将pH值调整为6.2，121℃灭菌20 min后使用。
(2) 乳酸菌活化：将在-80℃冻存菌种接种到改良MRS液体培养基中，37℃、厌氧培养24 h，作为一级种子液。
5、乳酸菌的扩大培养
(1) 培养基的配置：使用二级扩大培养基，对菌种进行扩大培养，配方具体为1 L二级扩大培养基含陈皮干粉10.0 g、橘红干粉10.0 g、佛手干粉10.0 g、大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，吐温-80 1.0 mL，使用氢氧化钠将pH值调整为6.2，获得的培养基为澄清的、无沉淀的液体，121℃灭菌20 min后使用。
(2) 乳酸菌的扩大培养：以占二级扩大培养基体积2%的比例，将乳酸菌接种到二级扩大培养基中，分别进行扩大培养，37℃、厌氧培养24 h，作为二级种子液。
6、制备发酵组合物
(1) 将经过二级扩大培养基扩大培养的植物乳杆菌LFLP-213二级种子液（活菌数为3×108CFU/mL）以占发酵组合物培养基体积1%的比例接入发酵组合物培养基中，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵24 h。
(2) 将经过二级扩大培养基扩大培养的罗伊氏乳杆菌LFLr-219二级种子液（活菌数为3×108CFU/mL）和副干酪乳杆菌LFLp-202二级种子液（活菌数为3.3×108CFU/mL）共同接入上步骤(1)发酵后的发酵组合物培养基。其中，罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌的接入量均占发酵组合物培养基体积的1%，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵48 h。
(3) 将经过二级扩大培养基扩大培养的动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106二级种子液（活菌数为3.3×108CFU/mL）以占发酵组合物培养基体积1%的比例接入上步骤(2) 发酵后的发酵组合物培养基，同时加入占发酵组合物培养基体积3%的200 g/L葡萄糖溶液，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵24 h。
(4) 将经过二级扩大培养基扩大培养的嗜酸乳杆菌LFLa-208二级种子液（活菌数为3×108 CFU/mL）以占发酵组合物培养基体积1%的比例接入上步骤(3) 发酵后的发酵组合物培养基，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵48 h。
7、发酵组合物剂型的制备
发酵组合物培养基经过发酵后进行喷雾干燥，收集粉末，得到本发明产品。
实施例2
同实施例1，不同的是发酵组合物剂型的制备
7、发酵组合物培养基经过发酵后加入15%麦芽糊精赋形剂，喷雾干燥后收集粉末，得到本发明产品。
对比例1
不经发酵处理的陈皮、橘红、佛手组合物原浆液制备：
1、陈皮、橘红、佛手三种组合物原料干制品的预处理
将陈皮、橘红、佛手干制品进行清洗，除去杂质、霉变及虫蛀。其中陈皮产自广东新会、橘红产自广东高州、佛手产自广东高要。
2、制备组合物原浆液：
准确称量1质量份的陈皮干制品于10倍质量的冷水中浸泡2 h，将陈皮捞出至打浆机中打浆，按料液比1:4添加冷水，得到陈皮浆液；准确称量1质量份的橘红干制品于10倍质量的冷水中浸泡2 h，将陈皮捞出至打浆机中打浆，按料液比1:4添加冷水，得到橘红浆液；准确称量1质量份的佛手干制品于10倍质量的冷水中浸泡2 h，将佛手捞出至打浆机中打浆，按料液比1:4添加冷水，得到佛手浆液。陈皮、橘红和佛手浆液按4:1:5的质量比进行混合，经胶体磨研磨处理后得到组合物原浆液。组合物原浆液加入柠檬酸粉末，调整浆液柠檬酸浓度为0.25 mol/L，90℃加热搅拌4 h。浆液冷却至室温后，加入占组合物原浆液总质量10%的葡萄糖和1%的酵母浸膏，加入氢氧化钠回调pH至6.8，121℃灭菌20 min。组合物原浆液于发酵罐50 rpm转速、37℃放置3 d后加入占发酵组合物培养基体积3%的200 g/L葡萄糖溶液，继续放置3 d。组合物原浆液喷雾干燥后收集粉末。
对比例2
同实施例1，不同的操作在于：6、制备发酵组合物
将经过二级扩大培养基扩大培养的植物乳杆菌LFLP-213、罗伊氏乳杆菌LFLr-219、副干酪乳杆菌LFLp-202、动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106以及嗜酸乳杆菌LFLa-208的二级种子液分别按发酵组合物培养基体积1%的接种量同时接入组合物培养基中，发酵罐50rpm转速、37℃、厌氧发酵6 d。其中，经过二级扩大培养基扩大培养的植物乳杆菌LFLP-213、罗伊氏乳杆菌LFLr-219、副干酪乳杆菌LFLp-202、动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106以及嗜酸乳杆菌LFLa-208的二级种子液菌种数分别为4.1×108 CFU/mL、3.5×108 CFU/mL、3×108 CFU/mL、3.1×108 CFU/mL、2.8×108 CFU/mL。
对比例3
同实施例1，不同的是：
发酵所用的植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种以及嗜酸乳杆菌采用市售菌株。其中植物乳杆菌来自上海润盈生物，企业菌株号Lp-G18；罗伊氏乳杆菌来自善恩康生物，企业菌株号LR09；副干酪乳杆菌来自善恩康生物，企业菌株号C；动物双歧杆菌乳亚种来自上海润盈生物，企业菌株号BL-G101；嗜酸乳杆菌来自上海润盈生物，企业号LA-G80。
将市售的乳酸菌菌种分别接种到改良MRS液体培养基中，37℃、厌氧培养24 h，作为一级种子液。再以二级扩大培养基体积2%的接种量将乳酸菌分别接种到二级扩大培养基中，37℃、厌氧培养24 h，进行扩大培养，作为二级种子液。
对比例4
同实施例1，不同的是：
不添加植物乳杆菌LFLP-213和嗜酸乳杆菌LFLa-208参与发酵。
6、制备发酵组合物
（1）将经过二级扩大培养基扩大培养的罗伊氏乳杆菌LFLr-219二级种子液和副干酪乳杆菌LFLp-202二级种子液共同接入发酵组合物培养基。其中，罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌的接入量均占发酵组合物培养基体积的1%，二级种子液活菌数分别为4.0×108CFU/mL和3.8×108CFU/mL，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵72 h。
（2）将经过二级扩大培养基扩大培养的动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106二级种子液以占发酵组合物培养基体积1%的比例接入上步发酵后的发酵组合物培养基，二级种子液活菌数为3.3×108CFU/mL，同时加入占发酵组合物培养基体积3%的200 g/L葡萄糖溶液，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵72 h。
对比例5
同实施例1，不同的是：
不添加罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌参与发酵。
6、制备发酵组合物
(1) 将经过二级扩大培养基扩大培养的植物乳杆菌LFLP-213二级种子液以占发酵组合物培养基体积1%的比例接入发酵组合物培养基中，二级种子液活菌数为4.1×108CFU/mL，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵48h。
(2) 将经过二级扩大培养基扩大培养的动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106二级种子液以占发酵组合物培养基体积1%的比例接入上步骤(1) 发酵后的发酵组合物培养基，二级种子液活菌数为3.1×108CFU/mL，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵24 h后加入占发酵组合物培养基体积3%的200 g/L葡萄糖溶液，继续发酵24 h。
(3) 将经过二级扩大培养基扩大培养的嗜酸乳杆菌LFLa-208二级种子液以占发酵组合物培养基体积1%的比例接入上步骤(2) 发酵后的发酵组合物培养基，二级种子液活菌数为3.4×108CFU/mL，发酵罐50 rpm转速、37℃、厌氧发酵48 h。
测试例
一、采用高效液相色谱法对上述实施例与对比例所得粉剂的橙皮素进行检测。
待测品溶液的制备：精密称取上述实施例与对比例所得粉剂10 mg，用10 mL 色谱级甲醇超声提取30 min（320 W，40 kHz），离心过滤，取上清液备用。
对照品溶液的制备：准确称取橙皮素标准品2 mg，用10 mL色谱级甲醇在超声波下提取10 min（320 W，40 kHz）至完全溶解，得到200 μg/mL的橙皮素溶液。分别准确吸取对照品溶液0.05、0.25、0.5、1.25、5 mL于10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇甲醇定容，配成浓度为1-100 μg /mL的系列标准品。
实验条件：样品进样量为20 μL；流动相使用甲醇-甲酸水溶液，梯度洗脱；检测波长为283 nm；柱温30℃；一个梯度程序的跑样时间为30 min。具体梯度洗脱流程见下表1。
表1 梯度洗脱程序
注：A为甲醇，B为0.2%的甲酸水溶液
标准曲线绘制：将所有样品溶液用0.22 μm的滤膜过滤，标准品的每个浓度做3个平行，进样量20 μL。以各物质的浓度作为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，绘制橙皮素的标准曲线。
待测品溶液的检测：待测品检测方法如上所述，每个样品做3个平行，进样量20 μL，通过标准曲线，用外标法计算待测品橙皮素浓度。结果如表2所示。
表2各组橙皮素含量比较(x±s，mg/g，n=3)
| 成分 | 橙皮素含量 |
| 对比例1 | 0.145±0.0011 |
| 实施例1 | 0.359±0.0125* |
| 对比例2 | 0.164±0.01 |
| 对比例3 | 0.149±0.03 |
| 对比例4 | 0.139±0.01 |
| 对比例5 | 0.153±0.02 |
与对比例1比较，*表示 P<0.05，有显著性差异。
结果说明，通过实施例1方法所得产物的橙皮素含量显著高于其他发酵处理，这表明，相较于未经发酵处理的组合物原料（对比例1），本发明关于发酵组合物（陈皮、橘红和佛手）的制备方法能有效提高原料向橙皮素的转化。由对比例2可知，采用本发明所选菌株同时投放进行发酵并不能提高发酵液的橙皮素含量，但按实施例1所采用的发酵顺序可以显著提高发酵液的橙皮素含量，而在相同条件下，采用市售菌株进行相同顺序发酵并不能提高发酵液的橙皮素含量，表明本发明所选菌株在陈皮、橘红和佛手的黄酮类化合物向橙皮素转化方面具有明显优势，本发明所采用的发酵方法具有出乎意料的提高发酵液橙皮素含量的作用。
二、总多糖的含量测定
参考郑国栋《不同品种来源陈皮总黄酮和多糖含量测定及分析比较研究》中的方法对粉剂的总多糖进行检测，严格按参考论文所供方法配置对照品溶液并稀释。总多糖含量采用百分含量计。
待测品溶液的制备：精密称取0.5 g粉末，加入乙醚100 mL，加热回流提取1 h，静置，放冷，小心弃去乙醚液，残渣置水浴上挥尽乙醚，加入100 mL 80%乙醇，加热回流提取1h，趁热滤过，滤渣再加水150 mL，加热回流提取2 h，趁热滤过，滤液放冷后移至250 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置具塞试管中，加水3 mL，迅速加入1 mL 6%苯酚，5 mL浓硫酸，静置5 min后于 40℃水浴加热15 min，再放入冰水中冷却，静置。
对照品溶液的制备：精密称取无水葡萄糖对照品50.57 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，得1.0114 mg/mL的葡萄糖对照品储备液。
回归方程建立：精密量取对照品储备液 0、1、2、3、4、5 mL分别置于50 mL量瓶中用水定容，分别取2 mL稀释液于试管中，迅速加入1 mL 6%苯酚，5 mL浓硫酸，静置5 min后置于40℃水浴加热15 min，再放入冰水中冷却，静置至常温。按紫外-可见分光光度法（中国药典2015年版通则 0401），在490 nm处测定其吸光度，并建立浓度和吸光度的回归方程。
样品检测：制备各对比例和实施例的待测品溶液，按紫外-可见分光光度法在490nm下测定样品吸光度，通过外标法联立吸光度与浓度，计算待测液总多糖浓度，并换算总多糖含量，每个样品做3个平行。结果如表3所示。
表3各组总多糖含量比较(x±s，mg/g，n=3)
| 组别 | 总多糖含量 |
| 对比例1 | 59.05±10.00c |
| 实施例1 | 121.19±39.63a |
| 对比例2 | 86.79±13.37b |
| 对比例3 | 64.64±57.78c |
| 对比例4 | 26.09±24.99d |
| 对比例5 | 66.13±15.95c |
同一列数据上标相同字母表示差异不显著（P<0.05），不同字母表示差异显著（P >0.05）。
现有研究表明，在部分发酵体系中，为维持乳酸菌的营养消耗，乳酸菌的长时间发酵会大量消耗发酵体系的多糖物质，导致总多糖含量下降。但除消耗发酵液中的多糖外，乳酸菌发酵还可以通过乳酸菌自身的代谢途径合成多糖物质，最终表现为反应体系多糖的平均分子量下降和乳酸菌合成多糖占比的增加。随着发酵中菌体数量增加，合理利用菌种发酵特性和营养供应可以提高发酵体系的总多糖含量。
通过实施例1方法所得产物相比于对比例1未经发酵产物，总多糖含量显著增加，亦显著高于对比例2、3、4、5方法所得产物的总多糖含量。这表明，在长时间发酵下，相较于未按特定顺序发酵的5种所选菌株而言，顺序发酵能更好的增加发酵体系中的多糖含量。在同样发酵流程下，使用本发明所选菌株发酵，发酵体系总多糖显著高于市售同类菌株，而市售菌株发酵不能显著提升发酵体系的总多糖，表明本发明所选菌株具有明显优势。由对比例4和对比例5的结果可知，实施例1所表现的效果需要5种所选菌株的同时使用，5种菌株的不完全组合不能达到实施例1所得的总多糖含量提高效果。
三、动物实验
将上述实施例1、对比例1、对比例2以及对比例3所制备的组合物粉剂用37℃热水溶解，待冷却至常温后对小鼠进行灌胃实验，考察其对小鼠呼吸道免疫力的提升效果。
实验方法：每只鼠每日摄入0.025 g发酵组合物，每只鼠每日灌胃0.3 mL，药液浓度为0.08 g/mL。
实验动物与分组：小鼠按体重随机分为7组，每组10只。空白对照组，小鼠每只每天采用0.3 mL 0.9％氯化钠溶液灌胃，共持续4周；复合乳酸菌发酵品低剂量组，小鼠每只每天采用0.3 mL实施例1所得药液灌胃，药液浓度为0.04 g/mL，共持续4周；复合乳酸菌发酵品中剂量组，小鼠每只每天采用0.3 mL实施例1所得药液灌胃，药液浓度为0.08 g/mL，共持续4周；复合乳酸菌发酵品高剂量组，小鼠每只每天采用0.3 mL实施例1所得药液灌胃，药液浓度为0.16 g/mL，共持续4周；组合物未发酵组，小鼠每只每天采用0.3 mL对比例1所得药液灌胃，药液浓度为0.08 g/mL，共持续4周；乳酸菌同时发酵组，小鼠每只每天采用0.3 mL对比例3所得药液灌胃，药液浓度为0.08 g/mL，共持续4周；市售乳酸菌发酵组，小鼠每只每天采用0.3 mL对比例3所得药液灌胃，药液浓度为0.08 g/mL，共持续4周。
支气管肺泡灌洗液（BALF）收集及sIgA检测：将颈椎脱臼后的小鼠解剖，气管插管，使用注射器将0.8 mL 预冷的PBS溶液推入气管，对实验干预小鼠进行双侧支气管肺泡灌洗，注入液体后，反复抽吸3次，灌洗共进行2次，回收灌洗液。各组取等体积灌洗液经4℃，2000 r/min，离心5 min，取上清液，采用ELISA法对灌洗液中的sIgA分泌量进行检测。
sIgA分泌量检测：使用小鼠分泌型免疫球蛋白A（sIgA）酶联免疫吸附测定试剂盒检测不同处理小鼠的肺泡灌洗sIgA分泌量，根据使用说明完成空白孔、0-1000 ng/mL的梯度标准品孔和待测样品孔的设置，使用全波长酶标仪在450 nm波长处测检测OD值，绘制标准曲线并换算不同处理小鼠的肺泡灌洗sIgA分泌量，结果见表4。
表4各组BALF中sIgA含量比较(x±s， ng/mL)
| 组别 | 小鼠数量 | sIgA |
| 空白对照组 | 10 | 147.67±91.97e |
| 组合物未发酵组（对比例1） | 10 | 157.51±144.79de |
| 复合乳酸菌发酵品低剂量组（实施例1） | 10 | 185.61±77.64bc |
| 复合乳酸菌发酵品中剂量组（实施例1） | 10 | 195.83±112.61ab |
| 复合乳酸菌发酵品高剂量组（实施例1） | 10 | 198.53±51.95a |
| 乳酸菌同时发酵组（对比例2） | 10 | 181.05±50.80c |
| 市售乳酸菌发酵组（对比例3） | 10 | 167.69±68.33d |
同一列数据上标相同字母表示差异不显著（P<0.05），不同字母表示差异显著（P>0.05）。
上述动物实验结果表明，相比于将本发明所选用的乳酸菌菌株同时投放进行发酵，乳酸菌菌株按特定顺序投放可使发酵产物更显著地提高小鼠 sIgA 分泌量；复合乳酸菌发酵品中剂量组（实施例1）与市售乳酸菌发酵组（对比例3）结果表明，在相同的发酵产物服用浓度下，复合乳酸菌发酵品中剂量组小鼠sIgA 分泌量显著高于市售乳酸菌发酵组，表明本发明所使用的5种菌株对3种芸香科原料的发酵提效效果要好于市售同属菌株，具有突出的优点。sIgA分泌量可以表征局部免疫力的高低，此处可以表征小鼠肺部粘膜免疫力水平，sIgA分泌量增加表示小鼠的局部免疫力有所提高。由此说明，由实施例1所得复合乳酸菌发酵品对小鼠局部免疫力的提升有积极效果，而从说明获得的复合乳酸菌发酵品可用于制备提高免疫力的制品。
Claims (9)
1.一种组合物的复合乳酸菌发酵品，其特征在于，其为以陈皮、橘红、佛手为原料，通过嗜酸乳杆菌菌株LFLa-208、动物双歧杆菌乳亚种菌株LFBb-106、罗伊氏乳杆菌LFLr-219、副干酪乳杆菌LFLp-202和植物乳杆菌LFLP-213发酵获得；
所述复合乳酸菌发酵品由如下方法制备获得：
S1、将原料陈皮、橘红、佛手进行泡水打浆，经胶体磨研磨后得到组合物原浆液；
S2、往组合物原浆液加入柠檬酸，对组合物原浆液进行酸水解处理，酸水解后冷却后往组合物原浆液加入碳源、氮源，调pH值后灭菌作为发酵组合物培养基；
S3、将植物乳杆菌LFLP-213接种到发酵组合物培养基中进行发酵；
S4、将步骤S3发酵后的发酵组合物培养基接种罗伊氏乳杆菌LFLr-219和副干酪乳杆菌LFLp-202，进行共同发酵；
S5、将步骤S4发酵后的发酵组合物培养基接种动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106，同时补充碳源，进行发酵；
S6、将步骤S5发酵后的发酵组合物培养基接种嗜酸乳杆菌LFLa-208，进行发酵；获得产品；
所述嗜酸乳杆菌菌株LFLa-208的保藏编号为CGMCC No. 25112，动物双歧杆菌乳亚种菌株LFBb-106的保藏编号为CGMCC No. 25111，罗伊氏乳杆菌LFLr-219的保藏编号为CGMCCNo. 25110，副干酪乳杆菌LFLp-202的保藏编号为CGMCC No. 25109，植物乳杆菌LFLP-213的保藏编号为CGMCC No. 25107；
所有发酵均为厌氧发酵，各菌株的活菌数范围在1×108~5×108 CFU/mL。
2.一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、将原料陈皮、橘红、佛手进行泡水打浆，经胶体磨研磨后得到组合物原浆液；
S2、往组合物原浆液加入柠檬酸，对组合物原浆液进行酸水解处理，酸水解后冷却后往组合物原浆液加入碳源、氮源，调pH值后灭菌作为发酵组合物培养基；
S3、将植物乳杆菌LFLP-213接种到发酵组合物培养基中进行发酵；
S4、将步骤S3发酵后的发酵组合物培养基接种罗伊氏乳杆菌LFLr-219和副干酪乳杆菌LFLp-202，进行共同发酵；
S5、将步骤S4发酵后的发酵组合物培养基接种动物双歧杆菌乳亚种LFBb-106，同时补充碳源，进行发酵；
S6、将步骤S5发酵后的发酵组合物培养基接种嗜酸乳杆菌LFLa-208，进行发酵；获得产品；
所述嗜酸乳杆菌菌株LFLa-208的保藏编号为CGMCC No. 25112，动物双歧杆菌乳亚种菌株LFBb-106的保藏编号为CGMCC No. 25111，罗伊氏乳杆菌LFLr-219的保藏编号为CGMCCNo. 25110，副干酪乳杆菌LFLp-202的保藏编号为CGMCC No. 25109，植物乳杆菌LFLP-213的保藏编号为CGMCC No. 25107；
所有发酵均为厌氧发酵，各菌株的活菌数范围在1×108~5×108 CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，将陈皮、橘红、佛手在冷水中浸泡1~2 h后捞出打浆，按料液比为1:4~1:5加入冷水，获得浆液，原料可分开打浆或混合一起打浆；陈皮、橘红、佛手的用量按质量比为1~5：1~5：1~5。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述组合物原浆液中陈皮、橘红、佛手分开进行打浆，按陈皮、橘红、佛手的浆液按质量比4:1:5混合。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述柠檬酸在原浆液中的浓度为0.25 mol/L，所述碳源为葡萄糖，用量为组合物原浆液质量的8~15%；所述氮源为酵母浸膏，用量为组合物原浆液质量的1~3%，pH值为6.8；灭菌的条件为121℃灭菌20 min；
在步骤S6中，所述碳源为150 ~250 g/L葡萄糖溶液，用量为组合物原浆液质量的1~5%。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌菌株LFLa-208、动物双歧杆菌乳亚种菌株LFBb-106、罗伊氏乳杆菌LFLr-219、副干酪乳杆菌LFLp-202和植物乳杆菌LFLP-213先进行活化，采用改良MRS液体培养基培养后获得一级种子液，再采用二级扩大培养基，接种一级种子液分别进行扩大培养获得二级种子液，利用上述菌株的二级种子液进行发酵；
其中，所述改良MRS液体培养基每升中含有大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g和吐温-80 1.0 mL，其pH值为6.2；
所述二级扩大培养基每升中含有陈皮干粉10.0 g、橘红干粉10.0 g、佛手干粉10.0 g、大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g和吐温-80 1.0 mL，其pH值为6.2。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，各菌种二级种子液的接种量为组合物培养基体积的0.5~2%，各菌种二级种子液的活菌数范围在1×108~5×108 CFU/mL。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，发酵在转速50~100 rpm，37℃条件下进行；
在步骤S3中，发酵的时间为24 h；在步骤S4中，发酵的时间为48 h；在步骤S5中，发酵的时间为24 h；在步骤S6中，发酵的时间为48 h。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的制备方法获得的复合乳酸菌发酵品在制备提高免疫力制剂中的应用。
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| CN202410046056.4A Active CN117547572B (zh) | 2024-01-12 | 2024-01-12 | 一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN103393121A (zh) * | 2013-06-17 | 2013-11-20 | 湖北富程祥云生物科技有限公司 | 一种改善胃肠功能，含酶复合益生菌植物酵素的制备方法 |
| CN107136279A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-09-08 | 广州泽成生物科技有限公司 | 一种乳酸菌压片糖果及其制备方法 |
| KR20210096964A (ko) * | 2020-01-29 | 2021-08-06 | 재단법인 제주테크노파크 | 제주산 감귤박 건조 파쇄물과 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 이용한 면역 증강 및 성장 촉진 사료 대체제 조성물 |
| CN114848685A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-08-05 | 广东益可维生物技术有限公司 | 抗过敏益生菌组合物及其应用、以及益生菌中药发酵物 |
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2024
- 2024-01-12 CN CN202410046056.4A patent/CN117547572B/zh active Active
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