KR20210096964A - 제주산 감귤박 건조 파쇄물과 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 이용한 면역 증강 및 성장 촉진 사료 대체제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감귤박 및 락토바실러스 속 균주를 포함하는 사료 첨가제 조성물 및 이를 포함하는 가축 사료 조성물에 대한 것으로, 상기 조성물을 돼지에게 급이하는 경우 성장촉진 및 면역력 향상 효과가 우수하므로 사료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

제주산 감귤박 건조 파쇄물과 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 이용한 면역 증강 및 성장 촉진 사료 대체제 조성물{Jeju Tangerine Dried powder and Nano size killed Lactobacillus plantarum bacterin based pig fed formulation for immunity and growth enhancing of pig}

본 발명은 감귤박을 이용한 사료 첨가용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 감귤박 또는 감귤박 추출액에 락토바실러스 속 균주인 lactobacillus plantarum를 접종하여 배양한 배양액을 함유하는 사료 첨가용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

최근, 농업기술의 발전과 더불어 감귤 등의 과일의 생산량 또한 증가하고 있다. 이러한 생산량 증대로 인해 가격형성과 수요 공급의 불균형으로 인한 감귤의 이용성 증대가 산업적으로 필요하게 되었고, 그로 인해 감귤 쥬스, 감귤 술 등의 가공품의 생산이 증가하게 되었다. 그러나, 생산 증가에 수반하여 부산물 또는 폐기물로 감귤 과피와 찌꺼기 등의 발생도 증가 되었으며, 이러한 감귤 착즙 후의 나머지 감귤박은 잘 부패하지 않아 심각한 환경요인이 되고 있다.

한편, 감귤박에는 펙틴, 플라보노이드, 알칼로이드, 헤스페리딘 및 비타민 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이들은 해독, 혈중 콜레스테롤 함량을 저하, 항균, 항염, 면역력을 높여주는 효능을 나타내므로 그 중요성이 강조되고 있다. 따라서, 최근에는 감귤박을 효과적으로 처리하는 방법들이 다각도로 연구되고 있으며, 감귤박을 분쇄하여 발효시키거나 건조시켜서 사료나 비료 또는 퇴비로 만드는 방법 및 감귤박 발효사료 생산장치 등이 연구되고 있다. 감귤박을 발효시키는 경우 감귤박의 발효로 인하여 pH가 낮아지고 항균성이 생길 수 있어 이를 사료첨가제로 사용하는 예가 있다(예, 제주축협 섬유질 사료).

이런 문제의 방안으로써 균 발효를 통해 고부가가치의 생균제 사료를 생산하는데 많은 연구가 진행되고 있다. 기존의 사료시장은 축산업에서 성장 촉진, 사료 요구율(feed conversion ; 단위 체중 증가에 필요한 사료 섭취량) 효율성 증대, 그리고 장내 감염방지 등을 목적으로 항생제를 광범위하게 사용하여 유익한 장내 미생물 생태계의 불균형과 항생제 내성 균주의 출현을 초래하였다. 최근 유럽연합 집행기관(European commission)은 동물의 성장 촉진제로 사료에 첨가되는 항생제의 사용을 금지하여 특히 양계에서는 병원균 차단을 위해 항균력을 갖는 정장제를 적극 권장하고 있는 실정이다. 이런 문제점에 대한 방안으로 항생제 대체 물질로써 항균성 물질을 생산하는 생균제가 대두 되고 있다.

생균제는 프로바이오틱스(probiotics)라 하고 균체를 포함하는 미생물의 배양물을 의미하는 것으로, 이들 미생물이 생균의 상태 혹은 사균의 상태로 가축에게 공급되어 유용한 효과를 내는 '미생물제제'라고 할 수 있다. 이러한 사료첨가용 생균제는 유해균이 장관 벽에 부착하는 것을 방지하고 유기산, 항균물질, 효소 등을 생산하여 면역능력을 증진시킨다. 현재 사용되는 생균제 균주로는 주로 그람양성균인 락토바실러스, 스트렙토코커스, 바실러스, 클로스트리디움 속과 곰팡이, 효모 등이 사용되고 있다.

그 중 락토바실러스는 혐기성 또는 약간의 호기성 균으로서 호기성 바실러스 균(Bacillus Sp.)보다는 장내 세균의 주요한 유익한 균으로서 락토바실러스가 유익한 균이 많은 장내 세균총을 형성하기에 유리하다.

또한 락토바실러스 균이 젖산(Lactic acid)을 생산하여 장내 환경을 낮은 pH로 유지하게 하여 유해균 또는 병원성 균의 성장을 방해한다.

그러나 감귤박의 조섬유는 반추동물에서 소화가 잘 되는 것으로 알려져 있으며 당성분을 비롯해 다양한 영양성분의 에너지가는 곡류와 비슷할 정도로 높은 것으로 알려져 있으나 아직 정확한 성분 분석이 되어 있지 않은 상태이다. 또한 사료 형태로 가공한 이후에도 이러한 성분의 변화가 없는지도 아직 밝혀지지 않은 상태이다. 이에 본 발명에서는 감귤박 및 상기 락토바실러스 속 균주를 이용한 사료 제조 공정 개발 및 제조 공정 후에 감귤박 사료의 영양성분 분석을 실시하고, 상기 사료를 급여한 돼지 사양 시험을 통해 돼지의 성장 촉진 효과 확인 및 건강 상태를 확인하여 면역기능에 미치는 영향을 조사 시험하여 본 발명의 사료 조성물이 돼지의 성장 촉진 및 면역력 향상 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 감귤박 및 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 포함하는 돼지 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감귤박 및 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 포함하는 돼지 사료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 감귤박 및 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 포함하는 돼지 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감귤박 및 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 포함하는 돼지 사료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 감귤박 및 actobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 포함하는 돼지 사료 조성물을 제공하며, 본 발명의 사료 조성물을 이용하여 돼지를 사육 시, 돼지의 성장 촉진 효과 및 면역력 향상 효과가 우수하므로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 면역 사이토카인 농도를 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도2는 혈중 CD4+, CD8+ T-cell 농도를 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는 달리 정의되지 않는 이상 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

본 발명은 감귤박 및 lactobacillus plantarum 불활화 나노화 균체를 포함하는 돼지 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 감귤박이라 함은 감귤 착즙 후의 나머지 찌꺼기 부분을 말하는 바, 본 발명에서는 감귤박의 액상 추출물 뿐만 아니라 감귤박도 유용하게 재활용할 수 있다.

본 발명의 감귤박은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%의 양으로 포함될 수 있으며 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.1 내지 8 중량%의 양으로 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 락토바실러스 속 박테리아는 모든 종류의 락토바실러스 속 박테리아에 적용될 수 있으나, 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum), 락토바실러스 액시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 락토바실러스 루테리(L. reuteri)로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 락토바실러스 속 박테리아는 프로바이오틱스(probiotics; 유효 생균제제)로 사용이 가능한 균주이다. 더욱 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 및 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 락토바실러스 속 박테리아 균주를 배양하기 위한 pH 조건은 중성영역인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 조건이나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 감귤박을 포함하는 사료 첨가제 조성물은 가축의 성장 촉진 및 면역력을 향상시킬 수 있다. 상기 가축은 돼지, 소, 말, 양, 가금류 등일 수 있다.

또한, 본 발명의 감귤박은 가축의 체중 증체량 및 사료 효율을 개선시켜 가축의 생산성을 증대시킬 수 있다.

상기 사료첨가제(feed additives)는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭한다. 바람직하게는 상기 사료첨가제는 가축용 사료에 첨가되고, 가축의 범위는 포유류, 조류, 어류, 곤충류를 포함하며, 더욱 바람직하게는 한우, 육우, 젖소, 돼지, 가금류, 개 및 고양이용 사료에 첨가된다.

이하 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

<실시예 1>감귤박 파쇄물 제조 및 성분 분석

<1-1> 감귤박 파쇄물 제조

청귤 시료는 청귤 전체, 청귤을 착즙한 후 생성된 착즙액 및 청귤박을 각각 -70℃에서 24시간 동안 냉각한 후 5일간 동결건조 하였다. 상기 동결건조물을 분쇄한 다음 40 표준체(체눈크기 425 μm)에 내려 분말화 하였으며 감귤 착즙박 시료는 15 ℃에서 60시간 건조한 후 분쇄하고 40 표준체에 내려 분말화 하였다.

준비된 시료는 각각의 성분 분석 방법에 따라 일반 성분 분석, 아미노산 분석, 항산화 물질 분석, 그리고 기타 유용성분에 대한 분석을 실시하였다.

<1-2> 감귤박 및 기타 유사 폐자원에 대한 영양 성분 및 활성 성분 분석 결과

100 g 당 에너지가 325~355 kcal 을 나타냈으며 감귤박의 경우 조단백질 수준은 낮으나 조섬유 수준이 적절하고 및 가용무질소물(탄수화물) 함량이 높아 에너지 사료로서 적당한 것으로 나타났으며 기존 보고된 생감귤 일반성분 함량(회분 0.49%, 단백질 0.96%, 수분 85.93%, 조지방 0.12%)의 결과와 비교했을 때, 냉풍 건조를 통한 수분함량 감소로 인해 감귤 자체보다 회분, 단백질, 탄수화물 함량이 상대적으로 증가하였다.

상기와 같은 결과는 건조 감귤박이 사료 성분으로 사용되어도 영양상 문제가 없을 것을 나타낸다.

감귤박 성분에 대한 영양성분 및 각 종 활성 성분에 대한 분석 결과 수분함량 20 % 내외 그리고 60 % 이상의 탄수화물, 7~8 % 내외의 단백질 및 지방성분을 함유하고 있으며 전체 열량이 340 Kcal로 곡물 사료에 비교하여 사료로서의 충분한 영양성분과 열량을 가지고 있음을 확인하였다.

<1-3> pH 및 산도

pH 및 산도 측정 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, pH는 청귤 착즙박에서 가장 높은 수치를 나타내었고 청귤 착즙액이 3.00으로 유의적으로 낮았으며, 산도는 청귤 착즙액이 0.64%로 가장 높았고 청귤 착즙박이 0.21%로 가장 낮게 나타나 시료 중 pH의 감소와 산도의 증가가 상관관계가 있음을 나타내었다.

또한, 감귤류를 구성하는 유기산은 구연산, 말산, 수산 등으로 주로 구연산의 함량이 높으며 생감귤의 유기산 함량은 1.31~1.68% 인 것으로 측정되었다.

감귤박의 산도는 비교적 낮은 pH 3 정도로 사료와 같이 사용되었을 때 돼지에게 사용되는 유기산을 대체할 수 있을 정도로 소화 촉진 및 위내에 위해균 증식 억제 효과가 우수할 것으로 판단된다.

<1-4> 색도

색도 측정 결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이 명도와 황색도는 청귤 착즙액이 가장 높았고 이어서 청귤 착즙박, 청귤, 감귤 착즙박의 순서로 나타났으며 모든 시료에서 유의적 차이를 나타내었다. 반면 적색도는 감귤 착즙박이 가장 높게 나타났고 청귤, 청귤 착즙박, 청귤 착즙액의 순서로 낮아졌으며 유의적 차이를 보였다. 청귤의 녹색이 적색도 값에 영향을 미쳐 청귤 착즙박에 비해 감귤박의 적색도값이 더 높은 것으로 측정되었다.

<1-5> 유리당 (mg/g)

유리당 측정 결과, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이 유리당은 fructose, glucose, sucrose가 검출되었고 maltose는 검출되지 않았으며 검출된 모든 유리당 함량에서 청귤 착즙액이 가장 높게 나타났다. 청귤 착즙액의 유리당 함량은 미숙 감귤 착즙액, 탱자 과육보다 더 높으므로 식품의 향기 및 감미에 영향을 주어 식품 첨가물로 사용 시 기호도를 높일 수 있을 것으로 판단된다. 또한 다양한 당을 함유하고 있어 영양소로서의 가치가 충분함을 확인하였다.

<1-6> Pectin 및 cellulose 함량 (mg/g)

감귤에 함유되어 있는 식이섬유는 간지질 함량을 낮추는 효과와 cadmium 투과 억제 능력을 가지며, 다이어트 성분, 혈중 콜레스테롤 저하 및 중금속 해독 기능 등 우수한 성질을 갖고 있다고 보고되고 있다. 또한 최근 각종 심장혈관계 성인병 및 장 질환 환자가 증가하면서 식이섬유에 대한 인식을 새롭게 하고 식이섬유를 이용한 여러 종류의 식품들이 개발되고 있다. 이 중 펙틴은 잼, 젤리 등의 제조 등의 겔 형성 능력, 점도의 증가, 유화 안정성이 있어 식품 산업에 널리 이용되며, 혈중 콜레스테롤 감소와 장내 유용 세균의 증식, 혈중 항체의 양 증가 등의 효과가 있음이 보고된바 있다.

이에 펙틴과 셀룰로오스 함량을 측정한 결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이 청귤 통과 군에서 펙틴 함량이 177.71mg/g으로 가장 높게 측정되었다.

<1-7> 구성 아미노산 및 유리 아미노산(mg%)

구성 아미노산 함량 측정 결과, 상기 표 6에 나타낸 바와 같이 구성 아미노산 함량은 6.62~7.89%로 나타났으며 전반적으로 Aspartic acid, glutamic acid 함량이 높게 나타났다.

또한 표 7에 나타낸 바와 같이 유리 아미노산 함량은 0.84~3.59% 내외로 나타났으며 Asparagine 함량이 높은 것으로 측정되었다.

<1-8> 무기질 (mg%)

무기질 측정 결과 표 8에 나타낸 바와 같이 각 무기질 총량은 K이 4508.59 mg%로 가장 높았고 다음으로 Mg이 1554.95 mg%로 높았으며, 이들 함량은 시료 중 청귤 착즙액, 청귤 착즙박, 청귤이 감귤 착즙박에 비해 더 높았다. 청귤 착즙액, 청귤 착즙박, 청귤, 감귤 착즙박 중 미숙과 형태인 청귤에서 K, Mg, P 함량이 더 높았으며 감귤 착즙박에서는 Ca, Fe, Zn 함량이 더 높게 나타났다.

또한 나트늄에 비해 칼륨의 수치가 높게 측정되었으며 기타 철, 아연, 마그네슘등이 검출되어 무기질 성분도 충분한 것으로 측정되었다.

<1-9> 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드

식품이나 체내 생체막에 존재하고 있는 지질은 활성산소에 의해 산화되어 식품의 품질변화나 생체노화를 일으키는 것으로 알려져 있는데, 이러한 산화를 방지하기 위하여 천연 항산화제인 페놀성 화합물이 널리 이용되고 있다. 폴리페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포하는 2차 대사산물로서 수산기를 가지는 방향성 화합물을 총칭하는 것으로, hydroxycinnamic acid를 비롯한 대부분의 폴리페놀 화합물은 세포벽, 다당류, 리그닌 등과 에스테르 결합되어 있거나 중합체로 존재하며, 수산기를 통한 수소공여와 페놀 고리구조의 공명 안정화에 의해 항산화 능력을 나타낸다.

이에 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 측정 결과 표 9에 나타낸 바와 같이 청귤 착즙액(12.39 GAE mg/g), 청귤 착즙박(12.36 GAE mg/g), 청귤(12.70 GAE mg/g)은 감귤 착즙박에 비해 유의적으로 높은 폴리페놀 함량을 나타내었으며 이들 사이에서는 유의적 차이가 존재하지 않았다. 플라보노이드는 외부의 스트레스나 질병으로부터 자신을 보호하는 작용을 하는 물질로써, 항염증, 항균 및 항산화 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 청귤 착즙박이 63.75%로 가장 높은 함량을 나타내었고 이어서 청귤(58.49%), 청귤 착즙액(44.70%), 감귤 착즙박(36.94%) 순이었으며 모든 시료에서 유의적 차이를 나타내었다.

상기와 같은 결과에 의할 때, 숙도가 낮은 청귤은 유용한 플라보노이드 소재로서 활용이 가능하고 그 중에서도 청귤 착즙액에 비해 청귤 착즙박 및 청귤의 가치가 더 높을 것으로 나타났다.

<1-10> Naringin 및 hesperidin 함량 (mg/g)

Naringin은 항산화, 항돌연변이 활성을 지니며, streptozotocin으로 유도된 고혈당 쥐의 혈당량과 H₂O₂, TBARS level을 낮추고, 항산화 효소들의 활성을 높이며, Hesperidin은 혈중 cholesterol 농도 상승 억제 작용, 지방간 개선 작용 및 간 종양 세포 증식 억제 작용 등과 그 외 항산화 작용을 나타낸다고 보고되고 있다.

이에 Naringin 함량 측정 결과, 상기 표 10에 나타낸 바와 같이 청귤 착즙액(32.09 mg/g)이 가장 높았고, 이어서 청귤(31.13 mg/g), 청귤 착즙박(22.32 mg/g), 감귤 착즙박(11.71 mg/g)의 순서로 나타났다. Hesperidin 함량 또한 청귤 착즙액(10.69 mg/g)이 가장 높았으며 청귤(10.52 mg/g), 청귤 착즙박(7.39 mg/g), 감귤 착즙박(4.62 mg/g)의 순서로, naringin과 hesperidin 함량은 감귤 착즙박에 비해 청귤 시료에서 더 높게 나타났다.

Naringin 및 hesperidin 측정 결과, 감귤에 비해 숙도가 낮은 청귤에서 이들의 함량이 더 높게 나타난 바, 청귤은 유용한 플라보노이드 소재로서 활용이 가능할 것으로 판단된다.

<1-11> Vitamin C 함량 (mg%)

Vitamin C는 항산화제로서 체내에서 산화스트레스에 대해 강한 항산화 역할을 하는 중요한 물질이며, 암 억제 및 면역체계에 대한 보호 효과도 가지고 있다.

이에 Vitamin C 함량 측정 결과, 상기 표 11에 나타낸 바와 같이 청귤 착즙액(19.58 mg%), 청귤(13.75 mg%), 감귤 착즙박(12.79 mg%), 청귤 착즙박(11.82 mg%)의 순서로 나타났으며 모든 시료에서 유의적 차이를 나타내었다. 이러한 결과는 사과 6.0 mg%, 배 4.0 mg%, 당근 6 mg%, 오이 10 mg% 등의 과일 보다 높아, 청귤 착즙액, 청귤 착즙박, 청귤 및 감귤 착즙박은 높은 vitamin C 함량을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 항산화 및 미백 등의 효과가 있으며, 특히 돼지의 사료 성분으로 사용되었을 때 스트레스 완화 및 여름철 고온에 의한 스트레스 완화에 도움이 될 것으로 판단된다.

<실시예 2> 감귤박 및 락토바실러스 플란타룸 불활화 나노화 균체를 이용한 사료 조성물 제조방법

<2-1> 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양

락토바실러스 플란타룸 불활화 나노화 균체를 제조하기 위하여 락토바실러스 플란타룸 nF1 (수탁번호 : NITE P-1462) 균주를 사용하였다. 상기 균주를 이용하여 유산균 배양을 실시하였으며 구체적으로는 하기와 같다.

먼저 배지는 Difco Lactobacilli MRS Broth(일본 벡턴 디킨슨 주식회사)를 사용하였다. 본 배양의 개시 시의 배양액의 pH를 pH6.0∼6.5로 설정하였으며, pH를 조정하면서 배양하는 경우에, 초발 균체 농도를 1×10⁶∼1× 10⁷ cfu/mL로 했을 때에 최종 균체 농도가 대략 5×10⁹∼5×10¹⁰cfu/mL가 되도록 배양 조건을 설정했다.

배양은 유산균 락토바실러스 플란타룸 nF1 균주의 생육에 알맞은 온도인 37℃에서 실시했다. 배양액의 pH를 조정하는 경우에는 pH자동제어장치(pH stat)를 이용하여 가성 소다로 설정 pH±0.1로 조정하면서 배양을 실시했다.

<2-2> 락토바실러스 플란타룸 균주 분말 제조

상기 실시예 2-1에서 분리 및 동정한 락토바실러스 플란타룸 nF1 균주를 5 질량% 포도당을 첨가한 공지의 영양 배지에서 20 질량% 수산화나트륨 수용액으로 배양하되, pH가 중성이고, 온도가 36.5℃인 조건에서 배양하였으며, 포도당이 소비된 시점을 배양 종점으로 하였다.

배양 종료 후, 배양액을 80℃에서 10분간 가열 멸균 처리한 후, 균체를 PBS로 세정하고, 균체 중량에 대하여 9 배의 덱스트린을 부형제로서 첨가한 후 믹서로 분산하였다. 다음으로 이를 동결 분무 건조하여 분말 시료를 조제 하였으며, 제조한 분말 1 g 당 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 nF1 균주가 1조 마리 이상 포함되어 있음을 확인하였다.

상기 락토바실러스 플란타룸 nF1 균주 분말을 다시 균체 농도로 10 mg/ml가 되도록 조정하면서 PBS에 현탁하였다. 가공공정 시의 pH는 6.5로 유지하였다. 상기와 같이 균주의 나노화 처리 결과를 현미경으로 촬영하여 확인하였으며, 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 나노화 처리한 락토바실러스 플란타룸 nF1 균주는 구균에 가까운 형태를 나타냄으로써 군체끼리 재응집하지 않는 성질을 갖게 되었음을 알 수 있다. 나노화 처리된 락토바실러스 플란타룸 nF1 균주는 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛로 나타났으며, 재응집하지 않는 성질이 있어 물 또는 기타 용매에 대한 분산성이 뛰어난 유산균을 얻는 것이 가능하다.

<2-3> 감귤박 및 락토바실러스 플란타룸 불활화 나노화 균체를 이용한 사료 조성물 제조방법

감귤박 연간 생산량을 고려하여, 상기 실시예 2-1과 같이 배양하여 실시예 2-2와 같이 분말로 제조한 감귤박 및 락토바리러스 플란타룸 불활화 나노화 균체(배합비율 감귤박 95%, 락토바리러스 플란타룸 불활화 나노화 균체 5%)를 돼지 사료에 5 % 중량비를 포함하여 육성돈에 급이하기 위한 사료 조성물을 제조하였다.

<실시예 3> 활성 분석

<3-1> DPPH radical 소거 활성 측정(mg/mL)

DPPH는 짙은 자색을 띄는 radical을 갖는 물질 중에서 비교적 안정한 화합물로 vitamin C, 폴리페놀, 방향족 아민류 등의 항산화 활성을 갖는 물질에 의해 자색이 탈색되는 점을 이용하여 항산화 활성을 쉽게 측정할 수 있는 방법이다.

이에 항산화 활성을 측정하고자 DPPH radical 소거 활성을 측정하였다.

그 결과 표 12에 나타낸 바와 같이 DPPH radical 소거활성은 청귤이 가장 높았으며, 이어서 청귤 착즙액, 감귤 착즙박, 청귤 착즙박의 순서로 나타났다. 이 때 각각의 IC50 값은 2.37 mg/mL, 2.58 mg/mL, 2.70 mg/mL, 3.06 mg/mL였으며 모든 시료에서 유의적인 차이를 나타내었다.

<3-2> ABTS radical 소거 활성 측정(mg/mL)

ABTS 라디칼 소거능 측정법은 potassium persulfate와 의 반응에 의해 생성된 청록색의 ABTS radical cation이 항산화 물질에 의해 제거되어 청록색이 탈색되는 원리를 이용한 방법으로, 항산화 활성을 측정하고자 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다.

그 결과 표 13에 나타낸 바와 같이 ABTS radical 소거 활성은 청귤이 가장 높았으며, 이어서 감귤 착즙박, 청귤 착즙액, 청귤 착즙박의 순서로 나타났다. 이 때 각각의 IC50 값은 5.91 mg/mL, 6.14 mg/mL, 6.58 mg/mL, 9.74 mg/mL로 청귤 및 감귤 착즙박에서는 유의적인 차이가 존재하지 않아, 감귤 착즙박을 제외한 나머지 시료의 결과는 DPPH radical 소거능의 경향과 유사하게 나타났다.

<3-3> FRAP(Ferric reducing antioxidant power) assay (mM/g)

FRAP assay는 산성 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)복합체가 ferrous tripyridyltriazine(Fe2+ -TPTZ)으로 전환되는 원리를 이용한 것으로, 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점을 착안하여 시료 내의 총 항산화능을 측정하는 방법이다.

이에 FRAP assay를 실시한 결과 표 14에 나타낸 바와 같이 상기 양성대조군인 ascorbic acid는 0.1 mg/mL 농도에서 활성이 1.22 mM/g였으며 1 mg/mL 농도의 시료에서 청귤 착즙액의 FRAP value(0.66 mM/g)가 가장 높은 활성을 나타냈다.

라디칼 제거 효과(항산화 활성 측정)에서도 감귤박은 양성대조군에서보다 10배에서 20배 높은 활성을 보여주어 사료로 급이 되었을 경우 돼지의 건강에 매우 유용할 것으로 판단된다.

<3-4> 항균 활성

청귤착즙액, 청귤착즙박, 청귤 통과 및 감귤박의 항균 활성 측정을 실시하였다.

그 결과 표 15에 나타낸 바와 같이 청귤착즙액의 항균 활성이 우수한 것으로 나타났다.

상기와 같은 결과는 감귤류에 함유된 naringin은 항균작용으로 인한 것으로, 항균 활성 결과와 naringin 함량의 경향이 일치하는 경향을 나타내었다.

<3-5> Tyrosinase 저해 활성 (%)

Tyrosinase는 tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine)로의 전환에 관여할 뿐만 아니라 DOPA를 DOPA-quinone으로 전환시킴으로서 적색의 melanin 색소를 생성하는 중간 반응에 관여한다. 이 때 생성되는 멜라닌은 정상적인 상태에서는 자외선과 같은 피부자극에 대해 저항력을 높여주지만, 과도하게 생합성 되면 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착과 피부 손상을 일으킨다. 이러한 피부 미백효과를 측정하는 하나의 지표로 tyrosinase 활성을 측정한다.

이에 tyrosinase 활성 측정 결과, 상기 표 16에 나타낸 바와 같이 양성대조군인 kojic acid는 0.5 mg/mL의 농도에서 56.16%의 저해율을 나타내었으며 청귤 착즙액, 청귤 착즙박, 청귤, 감귤 착즙박은 이보다 높은 활성을 보여 우수한 미백효과 가지는 것으로 생각되며 이 중에서도 청귤(65.58%) 및 감귤 착즙박(66.88%)이 유의적으로 높은 활성을 나타내었다.

<3-6> Elastase 저해 활성 (%)

Elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 elastin의 분해에 관여하며, 또한 체내의 elastin을 분해하는 백혈구 과립 효소 중 하나로 이상조직에서는 활성이 높아져 조직파괴의 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다. 따라서 elastase 저해제는 피부의 주름을 개선하는 효과가 있다.

이에 Elastase 활성 측정 결과, 상기 표 17에 나타낸 바와 같이 양성대조군인 ascorbic acid는 0.1 mg/mL의 농도에서 88.51%의 매우 높은 저해율을 보였고 모든 시료의 측정 결과는 이보다 낮았으나, 청귤 착즙액의 경우 72.79%로 우수한 활성을 나타내었다.

<실시예 4> 감귤박 건조물에 대한 장기간 급이에 따른 돼지 사료로서의 가치 평가

<4-1> 감귤박 급이에 따른 사료 효율 증체율 및 건강 상태 측정

감귤박 연간 생산량을 고려하여 돼지 사료에 5 % 중량비를 건강한 육성돈에 60일 이상 급이하여 출하기 체중, 사료 효율, 일간 증체량 등을 측정하였으며 감귤박 급이에 따른 이상 반응을 확인하였다.

	급이사료	일령	두수	사육기간	생체중(20두)	평균체중(kg)	증체(두)	증체 (20두)	급이량(총량)	사료효율	일당증체(kg)
시험군 (감귤박+유산균)	육성돈	142	20	60	1,766	88.3	8.9	178.0	500	2.81	0.19
시험군 (감귤박)	육성돈	142	20	60	1,711	85.6	8.4	168.1	500	2.67	0.17
대조군	육성돈	142	20	60	1,655	82.8	7.5	149.0	450	3.02	0.12

그 결과 상기 표 18에 나타낸 바와 같이, 60일 이상 육성돈에 감귤박을 급이한 돈군과 감귤박을 급이하지 않은 돈군의 평균 증체량을 비교하였을 경우 평균 증체량이 5 Kg 정도 더 높게 측정되었으며 일당 증체량도 일 평균 10 g 정도 더 높게 측정되었다.

또한, 표19에 나타낸 바와 같이 60일 이상 육성돈에 감귤박과 나노유산균을 함께 급이한 돈군에서는 감귤박만 급이한 돈군에 비해서 평균 체중이 2.7 Kg으로 더 높게 나타났으며 평균 증체량 또한 약 2.5 kg 더 높게 측정되었고 일당 증체량도 일 평균 20 g 정도 더 높게 측정되었다.

<4-2> 감귤박 급이에 따른 면역 향상 효과 관찰

감귤박을 60일 동안 급이한 돼지 중 10마리의 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고 혈청 성분에 있는 면역 호르몬 그리고 면역세포에 대한 분석을 통해 감귤박이 돼지의 면역력 향상에 영향을 평가하였다.

면역 호르몬에 대한 분석은 일반적인 상용화된 ELISA 방식의 검사 kit 를 사용하였으며 면역세포에 대한 분석은 면역 세포 마커에 따라 분석할 수 있는 장비(FACS) 이용하여 세포 수 증가를 측정하였다.

면역효과에 대한 관찰 결과, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이 감귤박을 급이한 돼지와 급이하지 않은 돼지 사이에 특이한 차이점이 관찰되지 않았으며 이는 사양 시험 기간에 실험군과 비교군의 돈군에서 특이한 질병이 발생하지 않고 비교적 건강한 상태에서 실험이 진행되어 면역학적으로 차이를 보이지 않은 것으로 판단된다.

그러나 감귤박 성분의 분석결과 다양한 면역활성 성분이 함유되어 있어 추가적으로 특정 질병원을 감염시켜 감귤박의 면역력 향상 효과를 관찰 할 경우 유의적인 차이점을 보여줄 것으로 예상된다.

Claims (11)

1. 감귤박 및 락토바실러스 속 균주를 포함하는 사료 첨가제 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 감귤박 및 락토바실러스 속 균주는 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량 %의 양으로 포함되는 것인 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 감귤박 및 락토바실러스 속 균주의 배합 비율은 감귤박 95 중량 % 및 락토바실러스 속 균주 5 중량 % 인 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 가축의 장내 세균총 중 유해세균을 감소시키는 것인 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 루테리(L. reuteri)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 락토바실러스 속 균주는 나노화 처리한 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 나노화 처리는 균주 분말 1 g 당 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주가 1조 마리 이상 포함되는 것인 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 가축의 성장촉진 및 면역력을 향상시키는 것인 조성물.
9. 제1항의 사료 첨가제 조성물을 포함하는, 가축 사료 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 가축은 한우, 육우, 젖소, 돼지, 가금류, 개 및 고양이로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인 가축 사료 조성물.
11. 1) 락토바실러스 균주를 배양하는 단계;
    2) 상기 1)단계의 균주를 나노화 처리하는 단계;
    3) 감귤박 시료를 분말화 하는 단계;
    4) 상기 단계 2)의 균주 및 상기 단계 3)의 감귤박 시료를 포함하는 사료첨가제 조성물의 제조방법.
    

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