KR102582606B1 - 락토바실러스 알리 WiKim39를 이용한 항산화 활성물질 생성이 강화된 과채발효음료 제조방법 및 이에 따른 조성물 - Google Patents

락토바실러스 알리 WiKim39를 이용한 항산화 활성물질 생성이 강화된 과채발효음료 제조방법 및 이에 따른 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 알리 WiKim39는 항산화 용도 등을 위해 다양하게 활용될 수 있다.

Description

락토바실러스 알리 WiKim39를 이용한 항산화 활성물질 생성이 강화된 과채발효음료 제조방법 및 이에 따른 조성물 {METHOD FOR MANUFACTURING FERMENTED FRUIT VEGETABLE BEVERAGE WITH ENHANCED ANTIOXIDANT ACTIVE SUBSTANCE PRODUCTION USING LACTOBACILLUS ALLII WIKIM39 AND COMPOSITION THEREOF}
본 발명은 김치로부터 분리한 신규한 락토바실러스 알리 균주를 이용한 항산화 물질을 생성하는 방법 및 이에 따른 식품 조성물에 관한 것이다.
활성산소는 자연계에 널리 존재하는 안정한 분자상태인 기저 삼중항 산소로부터 효소계, 환원대사과정, 화학적 약품, 공해물질 및 광화학적 반응 등에 의하여 생성되며, 그 생성물로는 슈퍼옥사이드(superoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), 수산화 라디칼(hydroxyl radical), 일중항 산소(singlet oxygen) 등이 있다. 활성 산소는 생체 내에서 대식세포의 살균작용, 오래된 단백질의 제거 등에 이용되는 필수적인 물질이지만 반응성이 커서 생체 내에서 유해한 반응을 나타낼 수 있기 때문에 활성산소가 지나치게 증가되었을 경우에는 생체 내의 각 부위에 치명적인 손상을 일으키기도 한다. 이로 인해 암을 비롯한 각종 질병 및 노화를 일으키는 것으로 알려져 있다.
금속 이온(Fe3+)과 자유 라디칼은 많은 만성 질환의 발병 과정에 관여하는 중요한 산화제이다. 지질 산화는 식품 시스템에서 문제가 되는데, 이러한 지질 산화는 자유 라디칼 사슬 메커니즘을 통해 진행되며 많은 최종 생성물이 독성 화합물을 생성하고 죽상동맥경화증과 같은 질병의 주요 원인이기 때문에 생리학적 시스템의 산화적 손상의 지표이다. 따라서, 우수한 산화 방지제는 산화제를 감소시킬 뿐만 아니라 자유 라디칼을 제거할 수 있어야 한다.
생체 내 항산화 방어시스템을 증가시키거나 활성산소종을 조절할 수 있는 항산화제로는 토코페롤류, BHT(butylatedhydroxytoluene), BHA(butylated hydroxyanisole), 프로필갈레이트(propyl gallate), TBHQ(tertiarybutyl hydroquinone), 아스코르브산 등이 있다. 상대적으로 항산화 효과가 뛰어난 합성 항산화제인 BHT와 BHA는 우수한 효능과 저렴한 가격 때문에 토코페롤이나 비타민 C 보다 널리 사용되고 있으나, 합성 항산화제는 체내의 에너지 생산, 세포대사 및 호흡작용을 방해하며 발암성의 강한 독성을 가진 것으로 알려진 바 있다.
이에, 인체에 부작용이 없는 소재로부터 항산화 효과를 증진시키기 위한 새로운 균주의 발굴 및 이의 다양한 기능을 규명할 필요가 있다.
Oxidant-antioxidant system: role and significance in human body, P.S Chaudhuri, Indian J Exp Biol. 2002 Nov; 40(11):1233-9.
본 발명의 목적은 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P) 또는 이의 배양물을 포함하는 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 페닐 젖산(phenyllactic acid) 생성용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P) 또는 이의 배양물을 과채 추출물에 첨가 후 발효시켜, 과채 추출물에서 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 페닐 젖산(phenyllactic acid)을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P), 이의 발효물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 과채 추출물에서 항산화 물질을 생성하고, 항산화 효과를 증진시키는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 락토바실러스 속 유산균 균주인 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39)을 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39)을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39)는 김치 유래의 락토바실러스 알리 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 알리 WiKim39를 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 락토바실러스 알리 WiKim39를 이용하여 양배추, 비트, 브로콜리 및 당근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 과채를 추출, 여과 및 살균하여 과채추출물(Vegetable juice, VJ)로 제조하고, 상기 과채추출물에 락토바실러스 알리 WiKim39를 접종하여 발효시켜, 발효 과채 추출물을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 과채추출물의 발효를 위해 과채추출물에 접종하는 WiKim39의 농도는 과채추출물의 전체 중량을 기준으로 0.05 내지 4 중량%(w/w) 혹은 0.075 내지 3 중량%(w/w)일 수 있고, 바람직하게는 0.09 내지 2 중량%(w/w)일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 본 발명에서의 항산화에 있어서 유효한 효과를 나타내기 위한 본 발명에 따른 발효 과채추출물의 농도는 조성물 전체 중량%(w/w)를 기준으로 1 내지 25 중량%(w/w) 혹은 3 내지 17 중량%(w/w)일 수 있으며, 바람직하게는 4.5 내지 12 중량%(w/w)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 발효 과채추출물 (VJ+WiKim39) 및/또는 비발효 과채추출물 (VJ)의 페놀(phenol) 및 플라보노이드(flavonoid) 함량을 확인한 결과, 발효 과채추출물 (VJ+WiKim39)이 비발효 과채추출물보다 페놀 및 플라보노이드 함량이 증가됨을 확인하였다.
다른 실시예에 있어서, 발효 과채추출물 (VJ+WiKim39) 및/또는 비발효 과채추출물 (VJ)의 항산화 활성 측정을 위해 DPPH 라디칼 소거능, 수산화 라디컬(hydroxyl radical) 소거능, FRAP 분석, 지질과산화 억제능을 확인한 결과, 발효 과채추출물 (VJ+WiKim39)이 항산화 활성이 유의적으로 높음을 확인하였다.
또 다른 실시예에 있어서, UPLC-QTOF-MS/MS 및 GC-MS로 항산화 활성물질을 분석한 결과, WiKim39로 발효한 발효 과채추출물 (VJ+WiKim39)에서만 유기산인 D-류신산(D-leucic acid) 및 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid); 및 페놀인 3-페닐 젖산(3-phenyllactic acid)이 추가 검출되었다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P) 또는 이의 배양물을 포함하는 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 3-페닐 젖산(3-phenyllactic acid) 생성용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P) 또는 이의 배양물을 과채 추출물에 첨가 후 발효시켜, 과채 추출물에서 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 3-페닐 젖산(3-phenyllactic acid)을 생성하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P), 이의 발효물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 음료, 캡슐, 과립, 타정, 캔디 등의 형태를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P)의 발효물은 본 발명의 과채 추출물을 발효시킨 것일 수 있고, 상기 발효물은 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 3-페닐 젖산(3-phenyllactic acid)을 함유하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계의 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각 종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용될 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 락토바실러스 알리 WiKim39 균주 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 알리 WiKim39는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 락토바실러스 알리 WiKim39은 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 발효물이거나, 상기 균주와 추가의 성분을 함께 배양하여 수득한 발효물이거나, 상기 균주를 유기용매로 추출한 추출물, 상기 균주의 세포막을 용해시키거나, 파쇄 또는 균질화 처리한 용해물(또는 파쇄물) 등의 형태로 제제화할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 생균 또는 사균으로 존재하는 락토바실러스 알리 WiKim39 균주를 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 본 발명에 따른 조성물은 사료첨가제 또는 사료로서 이용될 수 있다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서 동물을 포유류를 포함하고 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 알리 WiKim39 균주의 양은 1회를 기준으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다. 균주를 투여할 경우에는 생균 상태로 투여하는 것이 바람직하며, 섭취 전에 사멸시키거나 감쇄(attenuation) 상태로 투여할 수 있다. 또한, 배양 상등액 등을 사용하여 제조할 경우에는 열처리 과정을 통한 멸균화 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 균주량 및 일일 섭취 정도는 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다.
또한, 본 발명의 한 구체예에서는 락토바실러스 알리 WiKim39, 이의 발효물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 정장제 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 정장제 조성물은 사람을 포함한 동물의 위장 질환의 예방, 개선, 치료에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 사익 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다. 상기 '위장 질환'으로는 위장 위해 세균감염 및 염증성 장 질환을 모두 포함하며, 예를 들어 병원성 미생물(대장균, 살모넬라, 클로스트리디움 등)에 의한 감염성 설사, 위장염증, 염증성 장 질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 정장제 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 위장 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만마리에서 1,000억마리를 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 “발효 과채추출물”이란, 락토바실러스 알리 WiKim39 균주에 의해 발효된 과채추출물을 의미하며, 상기 과채는 양배추, 비트, 브로콜리 및 당근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 과채일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 알리 WiKim39는 김치로부터 분리된 유산균으로서, 항산화 물질을 생성하는 방법 및 이에 따른 식품 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 알리 WiKim39 및 락토바실러스 람노서스 GG의 항산화 활성 비교 그래프이다.
도 2는 본 발명의 4가지 혼합 야채 추출물 제조 및 발효 공정도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1의 항산화 활성 비교 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1의 UPLC-QTOF-MS/MS 분석 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1의 항산화활성 유효 물질의 함량을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 항산화 활성 유산균 선정
프로바이오틱스로 널리 사용되는 락토바실러스 람노서스 GG를 대조구로 하여 GG보다 항산화활성이 높은 유산균, 특히 과채추출물 발효를 위해 유산균 세포자체뿐만 아니라 세포외로 항산화물질을 분비되는 유산균을 선정하였다. 즉 김치로부터 분리한 유산균의 유산균 배양액(cell free supernatant), 유산균 부유액(intact cell), 유산균 파쇄액(cell free extract) 의 항산화 활성(DPPH 라디칼 소거능, Hydroxyl 라디칼 소거능, FRAP assay 및 지질과산화 억제능) 측정하여, GG보다 항산화활성이 우수한 WiKim39를 선정하였다. 항산화 활성 실험은 하기와 같이 진행되었다.
실험예 1-1: 유산균 시료 준비
락토바실러스 람노서스 GG와 락토바실러스 알리 WiKim39는 MRS 액체배지에 1% 접종하여 30℃에서 24시간 정치 배양한 것을 사용하였다. WiKim39 균주자체의 in vitro 항산화 효과를 검증하기 위해 다음의 3가지 유형의 샘플을 준비하였다:
샘플 ① - 유산균 배양액 (cell free supernatant)
샘플 ② - 유산균 부유액 (intact cell)
샘플 ③ - 유산균 파쇄액 (cell free extract)
WiKim39 배양액(109 CFU/mL)을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 분리하여 유산균 배양액(①) 샘플로 하였다. 남은 균체는 PBS로 3회 세척하여 PBS로 유산균 부유액(②)을 만들었다. 유산균 부유액을 얼음 속에 묻어두고 1분씩 초음파 파쇄기를 이용하여 30회 균체를 파쇄한 후 이를 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 유산균 파쇄액(③)샘플로 사용하였다.
실험예 1-2: DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거능 확인
양성 라디컬 소거에 의해 보라색이 탈색되는 정도에 따라 항산화 정도를 측정하였다. 준비된 샘플 10 μL을 DPPH solution (0.2 mM) 180 μL와 섞은 후, 25℃에서 30분 동안 반응시켜 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 50 ug/mL L-ascorbic acid를 사용하였다. DPPH 라디컬 소거능은 아래 식 1을 사용하여 계산하였다.
식 1: DPPH 라디컬 소거능, % = (ABlank-ASample) / ABlank × 100
상기 식 1 에서,
ABlank= 샘플을 첨가하지 않았을 때의 DPPH 라디칼 소거량, 및
ASample= 샘플을 첨가하였을 때의 DPPH 라디칼 소거량이다.
실험예 1-3: Hydroxyl radical 소거능 확인
철 이온과 과산화수소 사이의 Fenton 반응에서 수산기 라디칼 생성을 기반으로 측정하였다. 샘플 1 mL (100 mg/mL)와 H2O2 (0.025%, w/v) 1 mL, sodium salicylate (9mM) 1mL 및 FeSO4 (9mM) 1 mL를 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후 냉각하여 536 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군은 시료 대신에 증류수를 사용하였고, 양성 대조군은 50 ug/mL L-ascorbic acid를 사용하였다. Hydroxyl radical 소거능은 다음 식 2를 사용하여 계산되었다.
식 2: Hydroxyl radical 소거능, % = (ASample - AControl) / (ABlank - AControl) × 100
상기 식 2에서,
ASample = 샘플을 첨가하였을 때의 Hydroxyl radical 소거량,
AControl = 양성 대조군을 첨가하였을 때의 Hydroxyl radical 소거량, 및
ABlank = 샘플을 첨가하지 않았을 때의 Hydroxyl radical 소거량이다.
실험예 1-4: Ferric ion reducing antioxidant power(FRAP) 분석
화합물의 환원력 (ferric reducing abillity)을 측정하는 것으로, 상업용 kit(Abcan, Caliph, MI)를 사용하여 수행하였다. 반응혼합물의 ferric tripyridyltriazine (FeIII-TPTZ) 복합체를 산성 환경(pH 3.6)에서 환원제(antioxidant)에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine (FeII-TPTZ) 복합체로 될 때 594nm에서 흡광도를 측정하여 시료에 대한 환원력을 확인한다. 황산제일철(ferrous sulfate)의 검량선을 사용하여 정량하였으며, 그 결과를 Fe2+ 당량(μM)으로 표시하였다.
실험예 1-5: 지질과산화 억제능 (Thiobarbituric acid reactive substances, TBARS) 분석
시료내 지질과산화 억제능은 thiobarbituric acid (TBA) 방법을 사용하여 TBARS 생성을 억제하는 능력으로 평가하였다. Butylated hydroxytoluene (BHT) (3 mM)을 양성 대조군으로 사용하였으며, 지질과산화 억제능은 다음 식 3을 사용하여 계산되었다.
식 3: TBARS 억제능, % = (ABlank - ASample / ABlank) × 100
상기 식 3에서,
ABlank= 샘플을 첨가하지 않았을 때의 TBARS 억제량, 및
ASample= 샘플을 첨가하였을 때의 TBARS 억제량이다.
상기 실험예 1-2 내지 1-5의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1과 같이, WiKim39는 락토바실러스 람노서스 GG보다 샘플 ①, 샘플 ②, 및 샘플 ③ 모두에서 유의적으로 항산화 활성(DPPH 라디칼 소거능, Hydroxyl 라디칼 소거능, FRAP assay 및 지질과산화 억제능)이 높은 것으로 나타났다.
실험예 2: 야채 혼합추출액 추출 방법
제주지역에서 수확한 유기농 양배추, 당근, 브로콜리 및 비트를 이물질을 제거하고 세척한 후 양배추 12%, 당근 12%, 브로콜리 12%, 비트 10%의 비율에 맞게 망입하고 정제수를(54%) 혼합하여 추출기에서 107℃±2℃에서 2시간동안 추출하였다. 그 후 over-night 하여 여과포를 사용하여 압착한 뒤 50㎛ filter로 여과하였다. 여과한 추출액은 98℃±2℃에서 10분간 살균처리 후 100 mesh filter로 2차 여과하였다. 이 때 추출한 야채추출액의 당도는 3.5±0.3 brix %, pH는 5.3±0.2, 고형분은 3.7±0.3%였다.
실험예 3: 야채 혼합추출액의 유산균 발효 최적조건 확립
야채혼합추출액을 발효하기 위한 유산균으로 상기 실험예 1에서 선정한 락토바실러스 알리 WiKim39(KFCC11850P)를 사용하였다. 유산균은 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 24시간 전배양한 것을 야채추출액에 1% 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 야채혼합 추출액 제조공정 및 유산균 발효공정은 도 2와 같다.
야채혼합추출액은 비교예 1, WiKim39로 발효한 야채혼합추출액은 실시예 1로 표시하였다.
실험예 4: 야채혼합추출액의 조성 및 페놀, 플라보노이드 함량 확인
야채혼합추출액의 수분, 회분, 조단백질, 조지방 및 조섬유 함량은 AOAC에서 권장하는 방법을 사용하였으며, 야채혼합물은 동결건조한 것을 사용하였다. 탄수화물 함량은 다음 식 4를 사용하여 계산하였다.
식 4: 탄수화물(%) = 100% - (수분% + 조지방% + 조단백질% + 회분% + 조섬유%)
총 페놀 함량은 Folin-Cicocalteu 방법을 응용하여 분광광도계로 측정하였으며 갈산 당량(TP, μg GAE/mg)으로 표시하였다. 총 플라보노이드는 염화알루미늄 비색법을 응용하여 측정하였으며 카테킨 당량(TF, μg CE/mg)으로 표시하였다.
동결건조된 야채혼합추출액의 수분, 회분, 조단백질, 조지방, 조섬유, 탄수화물, TP 및 TF 함량은 하기 표 1과 같다. 야채혼합추출물 2종(비교예 1, 실시예 1) 모두 탄수화물 함량이 86.23%-88.17%로 가장 높았으며, 수분은 7.01%-7.05%, 조단백질은 2.24%-3.60%, 회분은 1.60%-1.68%, 조지방은 0.49%-0.69%, 그리고 조섬유는 0.45%-0.79% 함량을 함유하였다. 유산균 발효로 인해 조단백질 함량은 실시예 1이 비교예 1보다 유의적으로 높게 나타났으며, 이러한 단백질 함량의 증가는 미생물 발효 중에 생성되는 단백질 분해 효소 때문이거나 아미노산 생산을 유발할 수 있는 기질을 발효시켜 단백질을 합성한 결과일 수 있다. 또한 조섬유 및 조지방 함량도 실시예 1이 비교예 1보다 유의적으로 증가하였다. 반면 탄수화물 함량은 실시예 1이 비교예 1보다 더 낮았는데, 이는 탄수화물이 조섬유 또는 조지방으로 생물전환되었기 때문으로 사료된다.
시료의 총 페놀 함량(TP) 및 총 플라보노이드 함량(TF)은 항산화 활성, 항염증 특성 및 암 위험 감소 활성을 포함한 생리학적 과정에 대한 긍정적인 영향 때문에 중요하다. TP는 실시예 1이 255.69μg GAE/g으로 비교예 1(206.29μg GAE/g)보다 더 높은 값을 나타내었으며, TF도 실시예 1은 16.75μg CE/g, 비교예 2는 12.67μg CE/g 로 유산균 WiKim39 발효로 더 증가하였다.
실시예 1에서 TP의 증가는 복잡한 파이토케미칼을 더 단순한 형태로 가수분해하는 유산균의 가수분해 효소 때문일 수 있다. 또한 실시예 1에서 TF의 증가는 복잡한 폴리페놀이 더 단순한 플라보놀 화합물로 분해되기 때문일 수 있다.
실시예 1의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량
성분　(g/100g) 비교예 1 실시예 1
수분 7.05±0.25 7.01±0.15
회분 1.60±0.12 1.68±0.11
조단백질 2.24±0.01 3.60±0.05*
조지방 0.49±0.15 0.69±0.12*
탄수화물 88.173±0.16 86.23±0.14
조섬유 0.45±0.15 0.79±0.01*
TP
(ug 갈산 당량)		 206.29±1.44 255.69±2.44*
TF
(ug 카테킨 당량)		 12.67±0.09 16.75±0.13*
값은 건조 물질 기준으로 평균 ± 표준 편차(n=3)으로 표시됨. 같은 행의 다른 위 첨자는 크게 다름 (p < 0.05, t-테스트).
실험예 5. 유산균 발효 야채 혼합추출액의 항산화 활성 측정
유산균으로 발효한 야채혼합추출액(실시예 1) 및 비발효 야채혼합추출액(비교예 1)의 항산화 활성을 측정하기 위해, DPPH 라디칼 소거능, Hydroxyl 라디칼 소거능, FRAP assay 및 지질과산화 억제능을 측정하였고 그 결과를 도 3에 그래프로 표현하였다. 측정방법은 상기 실험예 1-2 내지 1-5와 같다.
도 3에서 볼 수 있듯이 비교예 1은 실시예 1보다 지질 과산화에 더 민감하고 DPPH 라디칼 및 Hydroxyl 라디칼 소거능이 더 낮았으며, FRAP를 이용한 항산화 능력의 정량화는 실시예 1에서 비교예 1보다 항산화 능력이 증가되는 것이 확인되었다.
실험예 6: 유산균 발효 야채 혼합추출액의 항산화 활성물질 분석
비발효 야채혼합추출물 대비 유산균 발효 야채혼합추출물에서 항산화활성이 증가되었으며, 이에 파이토케미컬을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 진행하였다.
야채혼합추출물 시료는 Sep-Pak C18 카트리지를 사용하여 정제하였다. 그런 다음 용액을 0.22-μm syringe filter로 여과한 후 서울대학교 나이셈(NICEM)에 UPLC-QTOF-MS/MS를 의뢰하여 분석을 수행하였다.
질량, MS/MS 스펙트럼, 그리고 분자식에 의해 비교예 1에서 12개의 화합물이 식별되었고, 실시예 1에서는 14개의 화합물이 식별되었다. 야채혼합추출물의 발효 대사산물은 유기산, 페놀, 당류 및 기타 화합물로 구성되어 있었다. 이 중 실시예 1에서만 3개 성분(D-leucic acid : D-LA, indole-3-lactic acid: ILA, 3-phenyllactic acid: 3-PLA)이 추가 검출되었다. 이러한 3종의 화합물을 표준 용액과 비교하여 정량화 한 결과(도 4), 실시예 1에서 비교예 1보다 훨씬 더 높은 농도를 나타내었다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11850P 20200211

Claims (6)

  1. 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 3-페닐 젖산(3-phenyllactic acid) 생성용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식품은 음료인 식품 조성물.
  3. 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P) 또는 이의 배양물을 과채 추출물에 첨가 후 발효시켜, 과채 추출물에서 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 3-페닐 젖산(3-phenyllactic acid)을 생성하는 발효 방법.
  4. 락토바실러스 알리 WiKim39(Lactobacillus allii WiKim39; 수탁번호 KFCC11850P), 이의 발효물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 발효물은 D-류신산(D-leucic acid), 인돌-3-젖산(indole-3-lactic acid) 또는 3-페닐 젖산(3-phenyllactic acid)을 유효성분으로 함유하는 것인, 항산화용 식품 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 식품은 음료인 식품 조성물.
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