KR101444416B1

KR101444416B1 - 복분자 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101444416B1
Application number: KR1020120088783A
Authority: KR
Inventors: 장종수; 박민아; 김유선; 최현봉; 김순삼; 이슬기; 권인혁; 송재용
Original assignee: 한국방송통신대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2014-09-30
Also published as: KR20140022571A

Abstract

본 발명은 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 식품, 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 개선하고, 메탄생성을 저감하는 것을 특징으로 하는 가축용 사료첨가제 조성물 및 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균 제어용 조성물에 관한 것이다.

Description

복분자 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating infectious diseases by pathogenic microorganism comprising extract of Rubus coreanus branch as effective component}

병원성 미생물은 인간과 가축에게서 여러 가지 감염성 질병을 야기한다. 그 예로서 그람양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 인체에 침입하여 농양이나 창상 감염 등의 피부감염, 골관절염, 균혈증, 폐렴, 독소쇼크증후군 및 식중독을 일으키는 원인균의 하나이다. 황색포도상구균은 동물에게서도 감염성 질환을 일으키는 원인균으로써 특히, 대장균(E. coli)과 소에게서 급성유방염을 일으킨다. 대장균(E. coli )은 그람음성균에 속하는 균이며, 일반적으로 인간이나 가축의 장관에 존재하나, 동물의 경우 요로나 호흡기에서도 검출된다. 대장균은 어린돼지에게서 부종병 및 장형대장균증, 유방염을 일으키고, 어린 송아지에서는 급성으로 심한 설사를 일으켜 죽음에까지 이르게 한다. 또한 대표적 병원성 대장균인 E. coli 0157:H7은 인간의 식중독의 원인균이다. 세계적으로 동물과 인간의 장관에 기생하며 배설물 등을 통하여 전파되어 자연계에 널리 분포하는 살모넬라의 경우 그람 음성균으로서 2000년 현재 우리나라에서 식중독을 일으키는 원인균 중 1위를 차지하고 있으며, 장관에 국한되어 증상이 없는 불현감염증, 미열과 경미한 피로를 동반하는 경증의 감염증, 고열과 패혈증 등을 나타내는 중증감염증 등의 다양한 임상을 나타낸다. 동물에게서도 급성패혈증, 급성장염, 만성장염 및 불현성 감염 등의 증상으로 나타나는 살모넬라감염증을 일으킨다. 또한 소, 돼지, 양 등의 낙태를 일으키는 캄필로박터(Campylobacter) 균은 인간에게서 복통을 수반하는 설사를 일으키는 원인균이다.

1940년대 초에 페니실린이 발견된 이후로 여러 가지 항생제가 개발되어 인간과 동물에게서 병원성 미생물에 의한 감염성 질환을 치료하는데 사용되어 왔으며, 감염성 질환을 치료하기 위한 항생제의 사용은 지난 70여 년 동안 감염성 질환을 현저하게 감소시켰으며 감염성 질환으로부터의 사망률을 현저히 감소시켰다. 항생제가 인간과 동물에게 세균감염질환 치료제로서 도입된 후 1940년대에 연구자들은 옥시테트라싸이클린과 같은 일부 항생제들이 동물에게서 성장촉진 효과를 가지고 있음을 발견한 이래 동물에서는 질병의 치료 목적 이외에 감염성 질환의 예방 및 가축의 성장을 촉진시키기 위한 목적으로도 사용되고 있다. 클로르테트라싸이클린과 옥씨테트라싸이클린이 동물에게서 생장을 촉진시키고 사료이용효율을 개선하고 감염질환에서 사망률 및 질병율을 감소시킨다는 것이 확인된 후 1951년과 1953년 사이에 미국 식품의약품안전청에 의하여 동물사료첨가제로서 사용을 허가받았다. 따라서 항생제는 동물에게서 감염성 질환 치료를 위한 치료제로서 혹은 동물의 생장을 촉진시키기 위한 치료 외적인 목적으로서 사용할 수 있는 몇몇 약물 중의 하나로 대표된다. 동물에 대한 항생제 사용량은 항생제의 전 세계 생산량 중 절반 이상을 차지하며, 그 중에서 약 90%가 질병의 치료목적 이외에 질병 예방제 혹은 성장촉진제로 사용되고 있다. 동물의 생장을 촉진하고, 사료효율을 증가시키며 감염성 질환을 예방하기 위하여 사용되는 항생제 성장촉진제는 또한 동물 위장관에서 이로운 박테리아는 자극하고 해로운 미생물을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그 결과 장내세균에 의해 생성되는 유산, 휘발성지방산(VFA), 암모니아, 아민 등의 생성을 억제하고 해독을 위한 에너지의 낭비를 경감시킨다. 특히, 반추위 내의 휘발성 지방산과 미생물 유래 단백질을 이용하여 사료를 반추위에서 발효시키는 소와 같은 반추동물에서는 항생제 성장촉진제는 반추위 발효 과정에서 메탄가스 발생을 감소시키기도 한다. 그 예로 항생제 성장촉진제인 모넨신을 들 수 있다. 모넨신은 반추위내에서 프로피오네이트를 증가시키고 초산의 생성량을 감소시킴으로써 발효를 변화시키고 메탄생성을 감소시킨다고 보고되었다. 이와 같이 성장촉진제로 동물에게 항생물질을 사용할 경우 동물의 감염성 질환을 치료하기 위하여 사용하는 경우보다 적은 양을 사용하게 된다. 그러나 세균을 완전히 죽일 수 있는 농도 이하의 적은 용량의 항생제에 세균이 장기간 동안 노출될 경우 세균은 자연적으로 항생제에 대한 내성을 획득하게 된다. 생장 촉진제로서 치료량보다 적은 용량으로 사료에 첨가하여 가축에게 투여하는 이러한 항생제의 사용이 항생제에 대하여 저항성을 갖는 미생물을 출현시킨다는 우려를 낳고 있으며, 실제로 지난 30년 동안 동물에게서의 항생제의 사용이 미생물에서 저항성을 야기하고 이것이 인간에게까지 영향을 미친다는 과학적 보고가 이루어지고 있다. 많은 나라에서 플루오로퀴놀린이 가축에 사용할 수 있도록 승인된 이후에 씨프로플록사씬의 저항성을 가진 살모넬라균과 캠필로박터균이 발생하였고 이어서 저항성을 가진 이 균주들이 인간에게서 감염성 질환을 일으킨다는 것이 보고되었다. 또한 유럽에서 아보파신이 가축의 성장촉진제로 사용되었을 때 반코마이신에 저항성을 가진 반코마이신 저항성 엔테로코커스(Vancomycin Resistant Enterococcus, VRE)가 발생하였으며, 먹이사슬에 의하여 인간에게 전파되어 인간도 이 저항성 균주를 갖게 된다는 것이 발견되었다. 그러나 EU에서 가축에 대하여 아보파신 사용을 금지시킨 후에 이 저항성 균주를 가진 인구의 수도 현저하게 감소됨을 알 수 있었다. 이와 같이 가축에게 생장조절제로서 첨가되는 항생제가 세균의 저항성을 야기하고 또한 항생제에 대한 저항성을 가진 세균이 먹이사슬을 포함한 여러 가지 전파경로를 통하여 인간에게 전파될 수 있다는 사실에 기초하여 EU에서는 2003년에 항생제를 사료첨가제로 사용하는 것을 금지하는 것을 입법화하였으며, 미국, 호주 및 한국을 비롯한 여러 나라에서도 사료첨가제로서 항생제의 사용을 금지하는 법안을 검토 중이다. 따라서 이에 대한 대체제가 필요한 실정이며 예로부터 질병을 치료하기 위하여 민간에서 사용되어 왔던 식물들로부터 새로운 항균제를 개발하기 위한 연구가 증가하고 있다. 식물은 곤충이나 초식동물로부터 자신을 보호하기 위한 여러 가지 이차대사산물을 생산한다. 특히, 식물이 생산하는 이차대사 산물 중에서 페놀성 물질, 플라보노이드, 알카로이드, 퀴논, 정유 및 사사포닌(sarsaponin) 등은 항균작용이 있는 것으로 알려져 있으므로 식물이 심각한 내성문제를 야기하고 있는 기존의 항생제를 대체할 수 있는 해결책이 될 수가 있다.

한편, 복분자(Rubus coreanus)는 우리나라 남부지방에서 자생 또는 재배하고 있는 대표적인 자생식물로서 장미과에 속하는 낙엽관목이다. 6월에 검붉은 열매가 열리고 이를 식용 또는 약용으로 사용하고 있으며, 예로부터 한방에서 신장기능, 불임증, 음위증, 유정몽설, 강장제로 쓰였다.

한국공개특허 제2009-0093619호에서는 복분자를 이용한 헬리코박터 치료용 조성물이 공개되어 있으며, 한국등록특허 제0431170호에서는 복분자를 이용한 치주염치료제의 조성물이 개시되어 있으나, 상기와 같은 선행기술들에는 모두 복분자 열매에서 비롯한 약효를 나타내고 있을 뿐, 본원 발명과 같이 복분자 가지 추출물의 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 치료효과 및 반추동물의 메탄생성 저감 효과에 관한 내용은 전혀 개시되어 있지 않다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 우리나라의 자생식물들을 이용하여 항균활성 및 반추위에서의 메탄발생 감소 효과를 연구하던 중, 복분자 가지 추출물을 시험관 내(in vitro) 항균활성 시험을 통하여 복분자 가지 추출물의 그람양성균 및 그람음성균에 대한 항균활성을 확인하였고, 또한, 소의 위액을 이용한 시험관 내 시험에서 복분자 가지 추출물이 메탄 발생을 감소시키는 것을 확인함으로써, 항생제를 대체하여 인간이나 동물의 항균활성과 반추동물의 메탄발생 감소 효과 및 생장 촉진 효과를 나타낼 수 있는 복분자 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 가축용 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균 제어용 조성물을 제공한다.

본 발명의 복분자 가지 추출물은 그람양성균과 그람음성균의 병원성 세균에 대하여 항균 효과를 나타내고, 반추위의 위액에 첨가하여 발효시 메탄생성을 감소시키는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 현재 세균에 대하여 내성을 일으키는 기존의 항생제를 대신하여 인간이나 동물의 감염성 질환에 대한 치료제로 사용할 수 있다. 뿐만 아니라 가축의 생장을 촉진하고 사료효율을 증가시키기 위한 목적으로 가축에게 사용되는 항생제 및 성장촉진제를 대신하여 세균에 대하여 항균작용을 나타내면서 치료량보다 저용량으로 장기간 사용하여도 세균에게서 내성을 야기하지 않는 안전한 성장촉진제로 사용할 수 있으며, 또한, 가축의 메탄생성을 감소시킬 수 있는 사료첨가제로도 사용할 수 있다.

도 1은 복분자 가지 추출물을 농도별로 반추위의 위액에 첨가 시 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 복분자 가지 추출물을 농도별로 반추위의 위액에 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 건물 소화율을 비교한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물에서, 상기 복분자 가지 추출물은 복분자 가지를 실온 또는 50~100℃에서 물 또는 알코올, 아세톤, 메탄올과 같은 유기 용매나 이들의 혼합물을 이용하여 추출한 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 복분자 가지 메탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학조성물에서, 상기 복분자 가지 메탄올 추출물은 복분자 가지에 복분자 가지 중량대비 14~16배의 메탄올을 혼합하고 45~55℃에서 4~6시간 동안 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 제조될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 복분자 가지에 복분자 가지 중량대비 15배의 메탄올을 혼합하고 50℃에서 5시간 동안 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학조성물에서, 상기 감압 농축하여 제조된 추출물은 진공건조 또는 -50~-30℃ 온도 및 0.1~0.5 Torr의 압력에서 동결건조한 후 분쇄하는 공정을 거칠 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 약학조성물에서, 상기 병원성 세균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 약학조성물에서, 상기 감염성 질환은 농양, 피부염, 골관절염, 균혈증, 폐렴, 독소쇼크증후군, 식중독, 고열, 패혈증, 급성유방암, 부종병, 유방염 또는 장형대장균증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 병원성 세균에 의한 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은, 약학조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하여 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 식품은 병원성 세균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 개선시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 추출물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 가축용 사료첨가제 조성물에서, 사료첨가제 조성물을 가축에게 급여함으로써 병원성 세균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 개선하고, 메탄생성을 저감하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 가축용 사료첨가제 조성물에서, 상기 가축은 바람직하게는 반추동물일 수 있는데, 그 종류로는 소, 낙타, 사슴 또는 기린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 병원성 세균 제어용 조성물에서, 상기 병원성 세균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 복분자 가지 추출물의 제조

복분자의 가지를 잘게 절단하여 제분기로 분쇄하여 얻어진 분말 100 g에 15배 중량의 메탄올을 가하여 혼합한 다음 환류 냉각기를 부착한 장치에서 5시간 동안 50℃에서 추출하였다. 이후 여과지(Whatman No 2 여과지)를 이용하여 여과한 후 여액을 감압 농축하여 건조추출물을 얻었다.

1. 복분자 가지 추출물의 항균 활성 측정 준비

복분자 가지 추출물의 항균활성을 측정하기 위하여, 페이퍼디스크법(paper disc method)과 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 및 MBC(Minimum Bactericidal Concentration) 시험을 실시하였다.

상기 제조예 1의 복분자 가지 추출물 항균 활성을 측정하기 위하여 사용된 균주는 그람양성균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCTC1012), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens KCTC3269) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC1916)와 그람음성균인 대장균(E. coli 0157: H7, 수의과학검역원), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis ACTC13076) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni subsp. jejuni KCTC5327)이다.

상기 균주의 배양배지는 바실러스 세레우스, 대장균, 스타필로코커스 아우레우스 및 캄필로박터 제주니의 경우 nutrient agar와 nutrient broth를 사용하였고, 스타필로코커스 아우레우스의 경우 tryptase soy agar와 tryptase soy broth를 사용하였으며, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 경우 reinforced clostridial agar와 reinforced clostridial broth를 사용하였다.

각각의 균주를 해당 배지 한천 평판에서 배양중인 콜로니를 취하여 각각의 broth 배지에 접종하여 37℃의 조건으로 밤새도록 배양한 다음 1 ml를 취하여 200 ml의 각각의 broth 배지에서 OD₆₀₀이 0.4~0.5에 도달할 때까지 배양하였다. OD₆₀₀이 0.4~0.5에 도달한 균액을 1.0×10⁶CFU/ml가 되도록 각각의 broth 배지로 희석하여 항균활성을 측정하기 위한 시험 균주 희석액으로 사용하였다.

2. 페이퍼 디스크(paper disc)법에 의한 항균활성

제조예 1의 복분자 가지 추출물을 40 mg/ml의 농도가 되게 메탄올에 용해한 후 40 ㎕를 취하여 멸균된 페이퍼 디스크(직경 8 mm, 두께 1.5 mm, 진성유니텍)에 흡수시킨 후 메탄올이 완전히 휘발될 때까지 방치하였다. 이 페이퍼 디스크를 각각의 균주 희석액을 균일하게 펼쳐서 제조된 각각의 한천 평판(agar plate)에 상기 추출물을 분주한 디스크(disc)를 놓고 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 디스크(disc) 주위의 저해환(inhibition zone)의 직경(mm)을 측정하였으며, 대조군으로 암피실린과 카나마이신을 사용하였다.

3. 복분자 가지 추출물의 MIC 및 MBC 측정

제조예 1의 복분자 가지 추출물을 40 mg/ml의 농도가 되게 메탄올 및 에탄올에 각각 용해하여 MIC에 의한 항균 활성을 측정하기 위한 시험용액으로 사용하였다. 96 웰 플레이트에 상기의 복분자 가지 추출물을 최종 농도 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 16 mg/ml가 되도록 웰에 넣은 후 용매로 사용한 메탄올이 완전히 휘발될 때까지 방치하였다. 용매가 완전히 휘발한 다음 물 20 ㎕, 준비한 각각의 균주의 희석 균액 100 ㎕ 및 0.025 w/v% TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 80 ㎕를 가하여 한 웰당 총 부피를 200 ㎕로 조정하였다. 37℃의 조건에서 20시간 동안 배양한 후 균의 생장이 억제되어 적색을 나타내지 않는 최소의 농도를 MIC로 정하였다. 동시에 MIC 이상의 농도를 나타내는 웰에서 각각 100 ㎕씩 취하여 각각의 균주 배양에 사용하는 해당 agar 배지에 섞어 37℃의 조건에서 24시간 배양하였을 때 콜로니(colony)의 생장이 나타나지 않는 최소의 농도를 MBC로 정하였다. 또한 용매 메탄올이 균의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 복분자 가지 추출물 대신 메탄올 20 ㎕를 넣고 동일한 방법으로 시험하여 메탄올이 균의 생장을 억제하지 않는 것을 확인하였다.

4. 복분자 가지 추출물의 반추위내 발효 성상

복분자 가지 추출물이 반추위내 발효 성상에 미치는 영향을 알아보기 위하여 소의 반추위내 위액을 이용하여 시험관 내 시험을 행하였다. 구체적으로는 제조예 1에서 제조한 복분자 가지 추출물을 이용하였으며, 배양 조건은 serum bottle에 기질(TDN 70%, CP9.6%) 0.2 g을 넣고 복분자 가지 추출물을 최종 농도가 배양액 1 L당 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 mg이 되도록 각각 첨가한 후 메탄올이 완전히 휘발할 때까지 건조하였다(표 1). 기질과 추출물이 들어있는 serum bottle에 McDougall buffer mixture(pH 6.8)로 희석한 반추위액 20 ml를 넣고 37℃에서 배양하면서 0, 12, 24시간마다 pH, 건물 소화율, 총가스 생성량, 메탄 생성량, 휘발성 지방산 생성량, 암모니아 생성량을 측정하여 반추위내 발효 성상에 미치는 영향을 분석하였다. 대조군과 처리군 모두 5 반복씩 분석하였으며, 결과 분석은 SAS 통계 분석 프로그램(Release 7.2, SAS Institute)을 이용하여 ANOVA 검정을 시행하였으며, P<0.05일때 유의성 있는 결과로 하였다.

serum bottle 내 복분자 가지 추출물의 농도(mg/L)

대조군	복분자 가지 추출물 처리군
대조군	T1	T2	T3	T4	T5
0	3.125	6.25	12.5	25	50

실시예 1: 페이퍼 디스크(paper disc)법에 의한 항균활성

표 1에 기재된 바와 같이, 복분자 가지 추출물은 시험에 사용된 모든 균주에 대하여 13~14 mm의 억제환을 나타냈으며, 이는 현재 광범위 항생제로 쓰이고 있는 카나마이신 10 ㎍에 의한 억제환과 비슷한 결과로써, 복분자 가지 메탄올 추출물이 우수한 항균 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

페이퍼 디스크법에 의한 복분자 가지 추출물의 항균 활성

균주	억제환 크기(mm)
균주	추출물	암피실린(10 ug)	카나마이신(10 ug)
Bacillus cereus	13	0	13
Clostridium perfringens	13	28	11
Staphylococcus aureus	12	23	11
E. coli 0157: H7	13	17	14
Salmonella enteritidis	14	18	13
Campylobacter jejuni subsp. jejuni	13	21	10

실시예 2: 복분자 가지 추출물의 MIC 및 MBC

복분자 가지 추출물의 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)는 0.125~0.5 mg/ml의 범위를 나타내었고, 최소살균농도(Minimum Bactericidal Concentration, MBC)는 0.25~16 mg/ml의 범위를 나타내어, 항생제로 쓰이고 있는 암피실린이 1/1000로 희석된 정제항생제의 역가와 비슷하거나 오히려 더 낮은 농도를 나타내었다. 특히 활성성분이 정제되기 이전에 crude extract인 상태의 활력을 측정한 것으로 정제되었을 경우 항생역가는 배가될 수 있다.

복분자 가지 추출물의 MIC 및 MBC

균주	복분자가지 추출물(mg/ml)		암피실린(㎍/ml)
균주	MIC	MBC	MIC	MBC
Bacillus cereus	0.125	0.25	4	1.6
Clostridium perfringens	0.5	4	1	8
Staphylococcus aureus	0.25	2	0.5	8
E. coli 0157: H7	0.25	8	0.5	0.5
Salmonella enteritidis	0.25	16	0.25	0.25
Campylobacter jejuni subsp. jejuni	0.125	1	0.5	6.4

실시예 3: 배양액의 pH 및 건물 소화율 변화

도 1에서 보는 바와 같이 복분자 가지 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 복분자 가지 추출물을 첨가한 처리군 모두에서 배양시간이 증가함에 따라 pH가 감소하였으며, 대조군과 처리군 사이에 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

또한, 24시간 배양 후 건물 소화율은 추출물의 농도가 증가할수록 감소하는 경향을 보이나 추출물을 50 mg/L로 첨가한 경우를 제외하고는 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 2). 상기의 결과에서 알 수 있듯이 복분자 가지 추출물을 반추위액에 50 mg/L의 농도 미만으로 첨가할 경우 반추위 내에서 pH와 건물 소화율에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 배양 시간에 따른 총가스 생성량과 메탄 생성량의 변화

24시간 배양 후 총가스 생성량을 측정한 결과 첨가된 추출물의 농도가 증가할수록 발생한 가스생성량이 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 메탄의 양을 분석한 결과 대조군에 비하여 모든 처리군에서 메탄 생성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, T3군에서는 대조군에 비하여 22%, T4군에서는 대조군에 비하여 23% 감소한 결과를 나타내었다(표 4).

24시간 배양 후의 총가스생성량과 메탄 생성량의 비교

	Control	T1	T2	T3	T4	T5
Gas(ml)	34.9^a	33.1^b	31.4^bc	31.2^c	30.3^c	26.8^d
Gas(mM)	1.37^a	1.30^b	1.24^bc	1.23^c	1.19^c	1.05^d
Gas(mM/g DM incubated	6.86	6.51	6.18	6.14	5.96	5.27
Gas(mM/gDM digested)	9.58	9.33	8.92	9.15	8.85	8.13
Fermentation efficiency (mg DM digested/ml gas)	4.11	4.22	4.41	4.30	4.45	4.84
CH4(mM)	0.06932	0.06167	0.05151	0.0484	0.04651	0.04194
CH4(mM/gDM incubated)	0.3466	0.30833	0.25755	0.24202	0.23257	0.20972
CH4(mM/g DM digested)	0.48346	0.44196	0.37197	0.36074	0.34527	0.32325
CH4(mmol/mol gas)	0.0505^a	0.0473^ab	0.0416^b	0.0394^bc	0.039^cd	0.0397^d
CH4 decrease %	-	6%	18%	22%	23%	21%

상기의 결과로부터 복분자 가지 추출물이 반추위내 메탄 생성을 저해하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 휘발성 지방산과 암모니아 발생량의 비교

배양 중 생성되는 휘발성 지방산을 가스크로마토그래피로 분석한 결과, 표 5와 6에서 보는 바와 같이 대조군과 처리군 사이에서 휘발성 지방산 생성량은 유의적 차이를 나타내지 않았다. 반면 24시간 배양 후 암모니아 질소원의 양은 모든 처리군에서 대조군에 비하여 현저하게 감소하였다. 따라서 복분자 가지 추출물이 기질내 함유된 단백질의 분해와 미생물체의 단백질 합성에 영향을 주는 것으로 사료된다.

12시간 배양 후의 휘발성 지방산과 암모니아 발생량의 비교

	control	T1	T2	T3	T4	T5
Total VFA, mM	40.733	37.424	39.259	34.356	38.941	37.680
Acetate	23.670	21.949	22.446	19.851	22.510	22.091
Propionate	12.436	11.233	12.100	10.482	11.856	11.229
Isobutyrate	0.386	0.358	0.417	0.351	0.390	0.355
Butyrate	3.056	2.935	3.172	2.743	3.110	3.003
Isovalerate	0.627	0.563	0.658	0.539	0.617	0.571
Valerate	0.558^a	0.386^b	0.467^ab	0.389^b	0.459^ab	0.430^b
A/P	1.903^abc	1.954^ab	1.855^c	1.894^bc	1.899^abc	1.967^a
NH3-N(mg/100ml)	0.3482	0.4955	0.4607	0.4418	0.3461	0.4590

24시간 배양 후의 휘발성 지방산과 암모니아 발생량의 비교

	control	T1	T2	T3	T4	T5
Total VFA, mM	68.304	61.661	53.690	56.348	62.284	56.971
Acetate	38.583^a	34.655^ab	30.113^b	31.771^ab	34.987^ab	31.941^ab
Propionate	22.136	20.036	17.433	18.338	20.358	18.677
Isobutyrate	0.673	0.631	0.559	0.556	0.622	0.562
Butyrate	5.201	4.868	4.332	4.320	4.858	4.477
Isovalerate	0.950	0.912	0.808	0.809	0.893	0.816
Valerate	0.761^a	0.559^ab	0.444^b	0.554^ab	0.567^ab	0.499^b
A/P	1.743	1.730	1.727	1.732	1.719	1.710
NH3-N(mg/100ml)	1.1799^a	0.3746^b	0.3055^b	0.3316^b	0.2797^b	0.2595^b

결론적으로, 본 발명에 의한 복분자 가지 추출물은 그람음성균과 그람양성균에 대하여 항균효과를 가지고 있음을 확인하였고, 반추위 내에서 메탄 발생을 감소시키는 효과가 있음을 입증하였다.

이에 의해, 본 발명에 의한 복분자 가지 추출물은 그람양성균 및 그람음성균의 감염에 의한 질환의 치료 및 예방을 위하여 유용하게 적용될 수 있음을 확인하였고, 또한 동물에게서 항균효과 및 동시에 지구의 온난화의 주원인인 메탄 생성량을 감소시키는 친환경적인 사료첨가제로 사용할 수 있음을 확인하였다.

제제예 1: 주사제의 제조

하기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 제조한 후 2 ml 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

제조예 1의 복분자 가지 추출물	100 mg
pH 조절제	적량
용해보조제	적량

제제예 2: 정제의 제조

하기의 성분들을 혼합하고 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 1의 복분자 가지 추출물	50 mg
유당	125 mg
미결정 셀룰로오즈	75mg
스테아린산 마그네슘	적량

제제예 3: 캡슐제의 제조

하기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 1의 복분자 가지 추출물	100 mg
유당	125 mg
전분	125 mg
탈크	적량
스테아린산마그네슘	적량

제제예 4: 사료첨가제의 제조

하기의 성분을 혼합하고 통상의 사료첨가제의 제조 방법에 따라서 제조하였다.

제조예 1의 복분자 가지 추출물	100 g
부형제	적량

제제예 5: 복분자 가지 추출물 함유 사료 제조

하기의 성분을 혼합하고 통상의 사료 제조 방법에 따라서 제조하였다.

제조예 1의 복분자 가지 추출물	50 g
버섯배지	200 g
소맥피	30 g
비트펄프	50 g
쌀주정박	220 g
옥수수후레이크	200 g
전지대두	40 g
전분박	100 g
콘싸일리지	200 g
옥수수속대	180 g
비지	400 g
라이그라스	323 g
지오라이트	14 g
타피오카	40 g

Claims

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복분자(Rubus coreanus) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는 반추동물의 메탄 생성 저감용 사료첨가제 조성물.
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