KR102416208B1

KR102416208B1 - 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 조성물

Info

Publication number: KR102416208B1
Application number: KR1020200002405A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 이나경; 배원영; 김형엽
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2022-07-01
Also published as: KR20210089352A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 조성물에 관한 것이다.

Description

발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 조성물{ANTI-INFLUENZA VIRAL COMPOSITION COMPRISING FERMENTATED EXTRACT OF INULA BRITANNICA FLOWER}

본 발명은 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 전세계적으로 유행하며 유전자 재조합과 종의 교차를 통하여 광범위하게 질병을 야기한다. 인플루엔자 바이러스의 유행은 가금 산업에서 많은 경제적 손실을 야기하며, 공중보건으로도 많은 위협이 되고 있음이 보고되고 있다 현재 승인받은 인플루엔자 치료제로는 미식품의약품안전처에서 승인한 오셀타미비어(상품명 타미플루)가 있으나, 인플루엔자 바이러스의 변종 출현에는 효과가 없는 한계가 있다. 또한, M2 단백질을 억제하여 인플루엔자 바이러스 억제를 유도하는 아만타딘은 A형 인플루엔자 바이러스에만 한정적인 효과를 나타낸다.

한편, 국내등록특허 제10-1195120호에서는 선복화 추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 감염 예방 및 치료용 조성물을 개시하고 있으나, 선복화 추출물의 유산균 발효 여부나, 인플루엔자 바이러스 중, H1N1 및 H9N2에 대한 개시는 전무하다.

본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물을 제공한다.

상기 균주는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 KCCM 11613P일 수 있다.

상기 선복화 추출물은 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 탄소수 1-4의 저급 케톤, 탄소수 1-4의 저급 에스테르, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출된 것일 수 있다.

상기 발효된 선복화 추출물은 비발효된 선복화 추출물에 비해, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)의 함량이 증가된 것일 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1 또는 H9N2일 수 있다.

상기 조성물은 체중 감소에 따른 부작용을 방지하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항인플루엔자 바이러스용 조성물은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 상기 발효된 선복화 추출물은 비발효된 선복화 추출물에 비해, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)의 함량이 증가된 것을 특징으로 하는바, 인플루엔자 바이러스(H1N1 또는 H9N2) 방어 효능이 우수하다. 뿐만 아니라, 체중 감소에 따른 부작용을 방지할 수 있는 이점이 있다.

따라서, 본 발명에 따른 항인플루엔자 바이러스용 조성물은 약학 조성물, 건강기능식품 및 사료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1(A)-(C)는 각각 비교예 1에서 제조한 비발효된 선복화 열수 추출물, 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물 및 표준문질의 HPLC 분석 그래프이고, 도 1(D)는 비교예 1에서 제조한 비발효된 선복화 열수 추출물 및 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물 내 EGCG의 함량을 비교한 그래프이다.
도 2는 마우스 모델 내 인플루엔자 바이러스(H1N1) 방어 효능 평가 개요를 나타낸 그림이다.
도 3은 닭 모델 내 인플루엔자 바이러스(H9N2) 방어 효능 평가를 나타낸 그림이다.

본 발명자들은 약용 식물로 이용되는 선복화 추출물을 다양한 유산균 중에서, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 이용하여 발효시키는 경우, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)의 함량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 인플루엔자 바이러스(H1N1 또는 H9N2) 접종 전에 투여하는 경우, 인플루엔자 바이러스(H1N1 또는 H9N2) 방어 효능이 우수함을 최종 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 “인플루엔자 바이러스”는 orthomyxoviridae과 인플루엔자바이러스속에 속하는 바이러스를 말하는 것으로, 구체적으로, 혈청형에 따라, 신종플루 바이러스인 H1N1 또는 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2일 수 있다.

본 명세서 내 “선복화(학술명 Inula britannica)”는 국화과의 금불초의 꽃을 말린 약재로 한국, 중국, 일본 등 동아시아에서 자생하는 야생화이다. 선복화는 예부터 소화 장애, 기관지염 등의 치료에 사용되었으며, 탕제나 환제로 조제하여 복용한다. 특히, 선복화에는 퀘르세틴(quercetin), 캠페롤(kaempferol), 루테올린(luteolin) 등의 플라보노이드가 다량 함유되어 있으며, 정유(essential oil)에는 항산화 작용뿐만 아니라 다양한 종류의 세스키테르펜 락톤(sesquiterpene lactone)이 함유되어 있어 각종 암세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도하고 이를 통해 암세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서 이러한 피토케미컬은 인체 내에 흡수되어 다양한 기능성을 나타내므로 건강 증진을 위한 기능성을 제공한다.

본 발명에 따른 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물은 다양한 유산균 중에서, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함한다. 즉, 선복화를 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 탄소수 1-4의 저급 케톤, 탄소수 1-4의 저급 에스테르, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출한 다음, 상기 추출된 선복화에 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후, 발효시킨 선복화 추출물 발효액을 포함한다.

상기 선복화 추출물은 건조시킨 선복화가 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 탄소수 1-4의 저급 케톤, 탄소수 1-4의 저급 에스테르, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출된 것일 수 있고, 건조시킨 선복화가 식품의약품안전처에서 고시한 용매를 참고하여, 건조시킨 선복화 100 g을 기준으로, 500 mL 내지 2000 mL의 물 또는 에탄올로 추출된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

이때, 상기 추출은 고온에서 수행될 수 있고, 50℃ 내지 70℃의 온도에서 12 시간 내지 48 시간 동안 추출된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 발효는 김치에서 분리한 유산균 중에서도 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주에 의한 것으로, 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 KCCM 11613P에 의한 것일 수 있다.

상기 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 대표적인 프로바이오틱스(probiotics)로서 그람 양성균, 간균 형태의 논-스포어 포밍 박테리아(non-spore forming bacteria)이다. 특히, 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 KCCM 11613P는 김치에서 분리한 균주이며 내산성 및 내담즙성이 높아 생존률이 각각 99%와 97.9%에 이르러 과채류에서 발견되는 타 락토바실러스 플랜타룸 보다 높은 수치를 보이고 또한 항 알러지 효과가 있는 균주이기도 하다

구체적으로, 상기 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 상기 선복화 추출물 100 부피부에 대하여, 0.1 부피부 내지 10 부피부로 접종되는 것이 최적의 발효 조건 및 이에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1 또는 H9N2) 방어 효능 증진 측면에서 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 상기 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 대신, 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주를 사용하는 경우에는 인플루엔자 바이러스(특히, H1N1) 방어 효능이 저하될 뿐만 아니라, 체중 감소에 따른 부작용을 발생하게 된다.

이때, 상기 발효는 20℃ 내지 40℃에서 20 시간 내지 100 시간 동안 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 상기 발효된 선복화 추출물은 비발효된 선복화 추출물에 비해, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)의 함량이 증가된 것을 특징으로 하고, 약 4배 이상 증가된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이에 따라, 상기 발효된 선복화 추출물 내 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)의 함량은 8.00 μg/mg 내지 20.00 μg/mg 일 수 있다.

또한, 상기 발효된 선복화 추출물에서 유산균 생균의 수는 5.0 Log cfu/mL 이상일 수 있고, 5.0 Log cfu/mL 내지 10.0 Log cfu/mL 인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 발효된 선복화 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 마우스(mouse), 래트(rat), 닭 등 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 항인플루엔자 바이러스용 건강기능식품은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는데, 상기 발효된 선복화 추출물에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.

상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 발효된 선복화 추출물을 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 발효된 선복화 추출물은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물질을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 상기 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.

상기 외에 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 상기 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항인플루엔자 바이러스용 사료용 조성물은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는데, 상기 발효된 선복화 추출물에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.

상기 사료용 조성물은 사료 보조제, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 사료 보조제는 치료제 또는 소화제를 동물에 제공하는 제제 함유 조성물로, 통상 생체의 열량 섭취 공급원, 즉 에너지 공급원은 아니지만, 통상의 동물 사료에 추가하여 섭취되는 조성물을 의미한다. 또한, 상기 식품 첨가제는 외관, 향미, 조직 또는 저장성을 향상시키기 위한 목적으로 보통 적은 양이 식품에 의도적으로 첨가되는 것을 가리키며, 식품의 품질을 개량하여, 보존성 또는 기호성을 향상시킬 뿐 아니라 영양가 및 식품의 실질적인 가치를 증진시킬 목적으로 사용하는 것을 의미한다. 이는, 식품위생법 제2조 제2호에서 정의하고 있는 바와 같이, 식품을 제조가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가, 혼합, 침윤, 기타의 방법으로 사용되는 물질일 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 말한다. 상기 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨(중조), 벤토나이트 (bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제일 수 있다.

이때, 상기 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일리지 등의 형태로 제조될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항인플루엔자 바이러스용 조성물은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 상기 발효된 선복화 추출물은 비발효된 선복화 추출물에 비해, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)의 함량이 증가된 것을 특징으로 하는바, 인플루엔자 바이러스(H1N1 또는 H9N2) 방어 효능이 우수하다. 뿐만 아니라, 체중 감소에 따른 부작용을 방지할 수 있는 이점이 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1

(1) 락토바실러스 플랜타럼 균주의 준비

김치에서 분리한 유용 유산균인 Lactobacillus plantarum KCCM 11613P는 사용할 때까지 20% 글리세롤을 함유한 MRS 배지에 -80℃에서 보관하였다.

이때, Lactobacillus plantarum KCCM 11613P는 2014년 11월 27일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 11613P를 부여받았다.

(2) 발효된 선복화 열수 추출물의 제조

인큐베이터(Jeio-Tech Co., Seoul, Korea)을 이용하여 60℃에서 상대 습도 4-5%를 유지하며 10 시간 동안 선복화 시료를 건조시켰다. 건조된 선복화는 고속 믹서기를 이용하여 10 mm 이하의 크기가 되도록 분쇄하였다. 분쇄된 선복화 50 g을 물 500 mL로 혼합하여 60℃에서 24 시간 동안 추출하였다. 이후, 선복화 열수 추출물을 Whatman N0.2 여과지로 여과한 후, 2% xylose, 2.5% soytone 및 2.5% beef extract를 첨가한 다음, 멸균하여 발효물을 제작하기 위한 배지로 사용하였다.

이후, 12시간 간격으로 3회 계대 배양한 Lactobacillus plantarum KCCM 11613P를 최종 접종 농도 6 Log CFU/mL가 되도록 접종하였으며, 72시간 발효 후 냉장보관하였다.

비교예 1

선복화 열수 추출물의 발효를 생략한 것을 제외하고는, 실시예 1와 동일한 방법으로 비발효된 선복화 열수 추출물을 제조하였다.

비교예 2

Lactobacillus plantarum KCCM 11613P 대신 김치에서 분리한 유용 유산균인 Weissella cibaria D30 KCCM 1211P를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 발효된 선복화 열수 추출물을 제조하였다.

실험예 1: EGCG 함량 측정

실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 추출물을 물에 용해시키고 HPLC를 위한 0.20 μm 멤브레인 필터를 통과시켰다. 액체 크로마토그래피(Waters 600 HPLC system, Waters Co.)를 사용하여 EGCG를 분석하였다. 주입 부피는 10 μL이고, 컬럼은 Eclipse XDB-C18 (4.6 mm × 150 mm, 5 μm, Agilent Technologies)이었다. 분석은 (A) 0.1 % 포름산 (물 내) 및 (B) 0.1% 포름산(아세토나이트릴 내)으로 구성된 이원 용매 시스템에서 수행하였다. 선형 구배는 다음과 같았다: 0-5 분: 90-80 % A; 5-10 분: 80 % A; 10-15 분: 80-75 % A; 15-25 분: 75-20 % A; 25-28 분: 20-90 % A; 28-30 분: 90 % A 및 다음 주입 전 10 분 지연. 유속은 0.8 mL/분이었다. EGCG는 Waters 2487 듀얼 파장 검출기(Waters Corporation)에 의해 280 nm에서 검출되었다. 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ)는 다음 식을 통해 결정되었다:

검출 한계(LOD) = 3 (S_s/b) × [(n-2)/(n-1)] ^1/2

여기서 S_s는 잔류 표준 편차이고, b는 교정 곡선의 기울기이며, n은 교정 설정에 대한 총 측정 수이다. 정량 한계는 상기 식에서 3을 10으로 대체하여 결정되었다.

그 결과, EGCG의 회귀 곡선은 y = 15000x + 11300 (R² = 0.9974)이고, 머무름 시간은 11.521 분이었다. LOD는 0.192 μg/mL 이고, LOQ는 0.641 μg/mL 인 것으로 나타났다.

한편, 도 1(A)-(C)는 각각 비교예 1에서 제조한 비발효된 선복화 열수 추출물, 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물 및 표준문질의 HPLC 분석 그래프이고, 도 1(D)는 비교예 1에서 제조한 비발효된 선복화 열수 추출물 및 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물 내 EGCG의 함량을 비교한 그래프이다. 도 1(D)에 나타난 바와 같이, 발효에 따라, 선복화 추출물 내 EGCG의 함량은 2.06 μg/mg에서 10.28 μg/mg으로 유의하게 증가한 것으로 확인된다(p<0.001).

실험예 2: 마우스 모델 내 인플루엔자 바이러스(H1N1) 방어 효능 평가

마우스 모델 내 인플루엔자 바이러스(H1N1) 방어 효능 평가는 도 2와 같이 진행하였다. 구체적으로, 6주령 SPF BALB/c 마우스에 실시예 1 및 비교예 2에서 제조한 추출물을 90 μL/마리/일의 조건으로, H1N1(Influenza virus A/NWS/33) 접종전 3주 동안 6회 비강투여를 실시하였다. 이후, 마우스 모델의 폐사율, 체중 변화 및 폐 내 H1N1 정량을 측정하였고, 그 결과는 표 1 내지 3에 각각 나타내었다.

처리	공격(Challenge)	폐사율	PI₂₁ ^a
음성대조군	10	0/10	-
양성대조군	10	10/10	2.0
비교예 2	10	8/10	1.8
실시예 1	9	3/9	1.2

^a 병원성 지수: 21 일 동안 매일 관찰한 결과, 마우스 모델 당 평균 점수(정상인 경우 0, 아픈 경우 1, 죽은 경우 2)

표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물을 투여한 경우, 비교예 2에서 제조한 발표된 선복화 열수 추출물에 비해, 마우스 모델의 폐사율이 약 80% 에서 약 33%로 크게 감소하는 것으로 확인되었다. 또한, 병원성 지수 역시 크게 개선된 것으로 확인된다.

처리	투여전 (g)	H1N1 접종전 (g)	H1N1 접종 3주후 (g)
음성대조군	18.4 ± 0.9	18.8 ± 0.4	20.5 ± 0.7
양성대조군	18.5 ± 0.9	19.2 ± 0.7	0.0 ± 0.0
비교예 2	18.7 ± 0.8	19.2 ± 0.9	18.1 ± 1.4
실시예 1	19.0 ± 1.1	19.3 ± 1.0	19.3 ± 1.5

표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물을 투여하기전 마우스 모델의 체중은 약 19.0 g이었으나, H1N1 접종 3주 후에도 마우스 모델의 체중은 약 19.3 g인 것으로 확인되는바, 체중 감소가 나타나지 않은 것으로 확인된다. 한편, 녹차 유래 EGCG의 경우, 체중 감소에 따른 문제점이 있는 것으로 보고되고 있다.

처리	H1N1 접종 3일후			H1N1 접종 6일후
처리	폐 중량(g)	H1N1 역가 (TCID₅₀/mL)	감염률	폐 중량(g)	H1N1 역가 (TCID₅₀/mL)	감염률
음성대조군	0.17 ± 0.01	0.0 ± 0.0	0/7	0.17 ± 0.01	0.0 ± 0.0	0/7
양성대조군	0.20 ± 0.02	5.8 ± 0.2	7/7	0.38 ± 0.02	5.8 ± 0.1	7/7
실시예 1	0.28 ± 0.03	3.9 ± 0.2	7/7	0.41 ± 0.01	4.8 ± 0.2	7/7

표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물을 투여한 경우, H1N1 접종 3일후 폐 내 바이러스 정량은 약 3.9 TCID₅₀/mL로 양성대조군에 비하여 약 1.9 TCID₅₀/mL 감소한 수치를 나타내었고, H1N1 접종 6일후 폐 내 바이러스 정량은 약 4.8 TCID₅₀/mL로 양성대조군에 비하여 약 1.0 TCID₅₀/mL 감소한 수치를 나타내었다.

실험예 3: 닭 모델 내 인플루엔자 바이러스(H9N2) 방어 효능 평가

닭 모델 내 인플루엔자 바이러스(H9N2) 방어 효능 평가는 도 3과 같이 진행하였다. 구체적으로, 4주령 SPF 닭에 H9N2 접종 전부터 H9N2(Influenza virus K040110/2010) 접종 후 2주가 지난 시점까지 실시예 1 및 비교예 2에서 제조한 추출물을 매일 0.5 mL씩 비강투여를 실시하였다. H9N2 방어 효능은 총배설강에서 배출된 H9N2를 real-time PCR을 이용하여 확인하였으며, 실험에 사용된 프라이머는 표 4와 같으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다.

유전자		서열	뉴클레오타이드 위치
M gene	정방향	5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3'	9-32
	역방향	5'-TGCAAAAACATCTTCAAGTCTCTG-3'	86-109
	프로브	5'-FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-TAMRA-3'	59-76

처리	H9N2 복제
처리	H9N2 접종 1일째	H9N2 접종 11일째
음성대조군	0.00 ± 00.00	00.00 ± 0.00
양성대조군	24.31 ± 14.40	29.56 ± 2.88
실시예 1	33.61 ± 1.13	32.26 ± 0.95

표 5에 나타난 바와 같이, 양성대조군을 투여한 경우, H9N2 접종 시간이 경과함에 따라 H9N2 복제가 증가하는 것으로 확인되나, 실시예 1에서 제조한 발효된 선복화 열수 추출물을 투여한 경우, H9N2 접종 시간이 경과하더라도 H9N2 복제는 증가하지 않는 것으로 확인된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11613P

20141127

Claims

락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 열수 추출물을 포함하고, 인플루엔자 바이러스 H1N1 또는 H9N2에 항바이러스 활성을 갖는, 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 균주는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 KCCM 11613P인, 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 발효된 선복화 추출물은 비발효된 선복화 추출물에 비해, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)의 함량이 증가된 것인, 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 체중 감소에 따른 부작용을 방지하기 위한 것인, 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 열수 추출물을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 H1N1 또는 H9N2 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 의해 발효된 선복화 추출물을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 H1N1 또는 H9N2 감염 질환의 예방 또는 개선용도의 사료용 조성물.