KR20150047047A

KR20150047047A - 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20150047047A
Application number: KR1020130126789A
Authority: KR
Inventors: 김문무; 박혜정; 김상민; 권현주; 이현태; 김태훈; 김병우; 김철민
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2015-05-04

Abstract

본 발명은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린(baicalin)을 함유하는 황금(Scutellaria baicalensis) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 면역조절을 통한 염증성 질환 예방, 치료 또는 개선용도 및 상기 황금 열수추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 황금 열수추출물은 오랫동안 천연약재로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유함으로써 NO의 생성 억제, 대식세포의 식균작용 억제, 염증관련 인자인 COX-2, iNOS, TNF-α 및 IL-1β의 발현을 억제하므로, 상기 황금 열수추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 면역조절을 통한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 이용될 수 있다.

Description

바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising water extract containing baicalin from Scutellaria baicalensis through immune modulation}

본 발명은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린(baicalin)을 함유하는 황금(Scutellaria baicalensis) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 상기 황금 열수추출물의 제조방법에 관한 것이다.

염증은 외부로부터 박테리아나 바이러스와 같은 외부 항원이 체내로 침입하거나 세포나 조직이 어떠한 원인에 의하여 손상 받았을 때 그 손상에 대한 조직 반응을 일컫는다. 염증세포는 종양의 개시, 증진에서 DNA 손상을 야기하는 활성 질소 및 산소종과 같은 다양한 염증전 매개인자를 방출한다. 염증은 크게 급성염증(acute inflammatory)과 만성염증(chronic inflammatory)으로 나뉘며, 만성적으로 염증반응이 일어날 경우 염증전 사이토카인과 케모카인이 과도하게 방출되어 주변 조직 손상과 더불어 종양세포의 내습, 전이, 이전 그리고 혈관신생을 증진시켜 종양의 성장을 돕는다.

림프구에서 분비되는 인터류킨(interleukin)은 다양한 종류와 기능이 알려져 있으며 특히, IL-1β와 IL-6는 급성염증과 만성염증을 매개하는 인자로 잘 알려져 있다. 또한 인터류킨은 대식세포의 식세포작용을 활성화시키고, T 세포와 B 세포를 활성화시켜 급성염증 혹은 만성염증을 유발한다. 과도하게 방출된 염증매개인자는 인슐린 저항성을 높이고 동맥경화와 같은 다양한 질병을 초래한다. 다양한 자극과 염증전매개인자에 의해 활성화된 대식세포는 다른 염증전매개인자, nitric oxide(NO), tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) 그리고 prostaglandin E2(PGE2)를 생성하고 다른 면역세포들을 염증부위로 유도한다. 더욱이 염증과정에서 내피 세포, 호중구 그리고 대식세포에서 발생되는 NO와 슈퍼옥사이드(ㆍO₂) 라디칼은 매우 높은 반응성의 산화제인 퍼옥시니트리트(ONOO^-)를 생성하여 병리적 조직(pathophysiological tissue)을 유발한다.

뿐만 아니라 대식세포는 식균작용을 통해 외부 항원을 세포막으로 둘러싸 분해한다. 대식세포의 막이 항원을 완전히 둘러싸게 되면 항원은 파고좀(pahgosome)이라는 주머니 상태로 대식세포 안으로 들어가게 되고, 이 주머니가 대식세포 내의 라이소좀(lysosome)과 융합되어 파고라이소좀(phagolysosome)을 형성하게 된다. 라이소좀의 여러 가지 산성가수분해효소나 활성화 산소계 물질(oxygen radical)의 작용에 의해 항원이 분해되며 이때 슈퍼옥사이드와 같은 활성산소종이 생성된다. 따라서 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygease-2(COX-2) 유전자는 대표적인 염증 인자로 여겨지며 이들의 발현을 억제하는 물질은 잠재적으로 유용한 항염증제로서의 개발가능성이 크게 평가된다.

상술한 염증반응에 관여하는 인자의 세포내 수준을 조절하여 염증성 질환을 치료하려는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 초기에는 화학적 물질을 이용하여 상기 인자들의 세포내 수준을 조절하고자 하였으나, 부작용이 심하다는 단점이 있어, 최근에는 부작용이 없거나 매우 낮은 수준으로 나타나는 천연물 유래의 물질을 이용하여 상기 인자들의 세포내 수준을 조절하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 황금(Scutellaria baicalensis)은 꿀풀과에 속하는 다년생 초본으로 항바이러스, 항균, 항종양, 항고혈압, 배뇨촉진 그리고 지혈에 효과 있어 전통적으로 사용되어오던 동양의 약재이다. 황금추출물의 약리효과로는 치주질환(대한한국공개특허 제1994-0011006호), 발기부전(대한민국공개특허 제2011-0109580호)의 예방 또는 치료효과와 발모촉진효과(대한민국공개특허 2007-0111765호)가 있음은 알려져 있으나, 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물의 항염활성에 대하여는 아직까지 보고된 바가 없다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은. 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물이 세포독성이 나타나지 않는 농도에서 NO 생성, 대식세포의 식균작용 및 COX-2, iNOS, TNF-α또는 IL-1β 등의 염증관련 인자의 발현을 억제시킴으로써 항염활성을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금(Scutellaria baicalensis) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 약학적 조성물을 비인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 건조된 황금을 물과 1 : 8 내지 1 : 12의 중량비로 혼합하고, 70 내지 100℃에서 1 내지 5 시간 동안 열수추출하는 단계; 및 (b) 상기 열수추출 단계를 1 내지 5회 반복추출하는 단계를 포함하는, 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린(baicalin)을 함유하는 황금(Scutellaria baicalensis) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 포함할 수 있다.

본 발명에 용어, “황금(Scutellaria baicalensis)”은 꿀풀과에 속하는 다년생초로서, 전국 각지의 산 기슭에서 자라며 약초로도 재배되고 있다. 키는 약 60㎝이고 여러 개의 네모진 줄기가 뿌리에서 나오며, 피침형의 잎은 마주나고 가장자리는 밋밋하고, 입술 모양의 자주색 꽃은 7~8월경 줄기 끝에서 총상(總狀) 꽃차례를 이루며 핀다. 열매는 꽃받침 안에 있으며 둥글다. 황금은 열을 내리고 해독의 목적으로 자주 사용되는 약재로서, 몸에 열독이 오르거나 오한 등이 잦은 것을 치료하는데, 주로 폐에 열로 인한 증상에 다용(多用)되고, 열로 인한 갈증과 황달, 이질, 설사, 소화불량, 황련과 마찬가지로 몸에 있는 종기나 종양, 더욱 더 심해져서 생기는 등창들을 치료한다고 알려져 있다.

본 발명에서 용어, “황금 열수추출물”은 황금을 물 또는 열수로 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 황금 열수추출물은 황금 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 8 내지 12배에 달하는 부피의 물을 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 70 내지 100℃에서, 추출 기간은 약 1시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 5시간 동안 열수추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다. 바람직하게는 열수추출로 1회 내지 5회 반복추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물(여액)을 동결건조시켜 분말화된 건조물의 형태일 수 있으나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다. 상기 황금 열수추출물은 황금의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어, 뿌리, 지상부, 줄기, 잎, 열매뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터 추출 가능하며 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 황금의 뿌리로부터 추출할 수 있다.

본 발명의 황금 열수추출물은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유할 수 있다.

본 발명에서 용어, “바이칼린”은 황금(Scutellaria baicalensis GEORGI)의 뿌리에서 추출되는 활성성분으로, 그 화학명은 β-D-글루코피라노시두로닉산, 5,6-디히드록시-4-옥소-2-페닐-4H-1-벤조피란-7-일(β-D-Glucopyranosiduronic acid, 5,6-dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-4H-1-benzopyran-7-yl)이며, 도 8의 구조식을 갖는다.

상기 바이칼린의 함량이 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 이하인 경우, NO 생성 억제능, 대식세포의 식균작용 억제능 및 COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β 등의 염증관련 인자 발현의 억제능이 거의 나타나지 않았으며, 반면, 황금 열수추출물 1 g당 바이칼린이 50 mg 이상인 경우에는 오히려 항염활성이 감소함을 확인하였다. 따라서, 항염활성이 가장 우수한 바이칼린의 함량이 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg에 해당함을 최초로 밝혀내었다.

본 발명의 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는, 황금 열수추출물은 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성 억제, 대식세포의 식균작용 억제, 염증관련 인자인 시클로옥시게나아제-2(cyclo-oxygenase-2, COX-2), 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 또는 IL-1β의 발현을 억제함으로써, 면역조절을 통한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, “염증성 질환”은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여로 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 황금 열수추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.002 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소, 조류 등과 같은 비인간동물 및 인간 등 어느 개체에나 적용할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 황금의 열수추출물이 NO의 생성을 억제하고(실시예 3), 대식세포의 식균작용을 억제하며(실시예 4), 염증관련인자인 COX-2, iNOS, TNF-α 및 IL-1β의 발현을 억제함을 확인하였다(실시예 5 및 실시예 6). 또한, 상기 황금 열수추출물의 세포 독성이 낮음을 확인하였다(실시예 2). 따라서, 본 발명의 황금 열수추출물 1 g당 0.8 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물은 면역조절을 통한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 비인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 염증성 질환의 의심 개체는 상기 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 염증성 질환의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 약학적 조성물 및 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 염증성 질환의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 황금 열수추출물, 바이칼린, 염증성 질환 및 예방에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "개선"은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 염증성 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

구제적으로, 본 발명의 황금 열수추출물을 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.

본 발명의 황금 열수추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다. 상기 식품첨가물은 외관, 향미, 조직 또는 저장성을 향상시키기 위한 목적으로 보통 적은 양이 식품에 의도적으로 첨가되는 것을 가리키며, 식품의 품질을 개량하여, 보존성 또는 기호성을 향상시킬 뿐 아니라 영양가 및 식품의 실질적인 가치를 증진시킬 목적으로 사용하는 것을 의미한다. 이는, 식품위생법 제2조 제2호에서 정의하고 있는 바와 같이, 식품을 제조가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가, 혼합, 침윤, 기타의 방법으로 사용되는 물질일 수 있다.

본 발명의 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 황금 열수추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함한다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로도 제조될 수 있다. 본 발명에 의한 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 것 이외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 황금 열수추출물, 바이칼린, 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

구체적으로, 본 발명의 황금 열수추출물을 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.

본 발명의 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제, 젤제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 건조된 황금을 물과 1 : 8 내지 1 : 12의 중량비로 혼합하고, 70 내지 100℃에서 1 내지 5 시간 동안 열수추출하는 단계; 및 (b) 상기 열수추출 단계를 1 내지 5회 반복추출하는 단계를 포함하는, 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물 제조방법 을 제공한다.

상기 황금 열수추출물의 제조방법과 관련하여는, 상기에서 설명한 바와 같으며, 상기 제조방법에 의해 제조된 황금 열수추출물은 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하고 있어, 항염활성이 가장 우수하다.

본 발명의 황금 열수추출물은 오랫동안 천연약재로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, 황금 열수추출물은 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유함으로써 NO의 생성 억제, 대식세포의 식균작용 억제, 염증관련 인자인 COX-2, iNOS, TNF-α 및 IL-1β의 발현을 억제하므로, 상기 황금 열수추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 면역조절을 통한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 황금 열수추출물의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 2는 황금 열수추출물의 NO 생성 억제능을 나타낸 도이다.
도 3은 황금 열수추출물의 NBT법을 이용하여 지모산 A(zymosan A)에 의해 유도된 식균작용의 억제능을 나타낸 도이다.
도 4는 황금 열수추출물의 형광법을 이용하여 fluoro conjugated-지모산 A에 의해 유도된 식균작용의 억제능을 나타낸 도이다.
도 5는 황금 열수추출물의 TNF-α, iNOS, COX-2 및 IL-1β의 단백질 발현 억제활성을 나타낸 도이다.
도 6은 황금 열수추출물의 TNF-α및 IL-1β의 단백질 발현 억제활성을 나타낸 도이다.
도 7은 TNF-α및 iNOS의 유전자 발현 억제활성을 나타낸 도이다.
도 8은 바이칼린의 구조식을 나타낸 도이다.
도 9는 황금 열수추출물의 HPLC에 의한 피크를 나타낸 도이다.
도 10은 황금 열수추출물과 바이칼린의 얇은층 크로마토그래피(TLC) 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 바이칼린 표준품 0.005 내지 0.1 mg/㎖ 의 농도범위의 표준곡선을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 황금 열수추출물의 제조

황금 열수추출물은 황금뿌리를 그늘에서 말린 다음 분쇄한 후, 건조 중량의 10배에 달하는 부피의 물을 용출용매로써 사용하고, 추출 온도는 80 내지 100℃에서, 추출 기간은 5시간 동안 열수추출의 추출방법을 사용하여 추출하였다. 열수추출로 1회 내지 3회 반복추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물(여액)을 동결건조시켜 분말화하였다. 본 실험을 위하여 황금열수추출물 분말을 증류수 내지 세포배지에 용해하여 적정 시험농도로 사용하였다.

실시예 1: 세포 배양

세포 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), Trypsin-EDTA, 페니실린(penicillin) / 스트렙토마이신(streptomycin) / 암포테리신(amphotericin) (각각 10,000 U/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 및 2,500 ㎍/㎖), fetal bovine serum(FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies(Paisley, Scotland)로부터 구입하였다. Raw264.7 세포는 American Type of Culture Collection(Manassas, VA, USA)으로부터 제공받았다. Raw264.7 세포는 5% CO₂및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% FBS(fetal bovine serum), 2 mM 글루타민 및 100 ㎍/㎖ 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.

실시예 2: 황금 열수추출물의 세포 독성 조사

황금열수추출물의 대식세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.

구체적으로, Hansen의 방법(Hansen, M. B., Nielsen, S. E., and Berg, K. 1989. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods. 119, 203-210.)에 따라 HDF세포에 대한 세포독성을 MTT(3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 황금 열수추출물은 160 ㎍/㎖ 이하의 범위에서는 세포독성이 없는 것을 확인하였다(도 1).

실시예 3: 황금 열수추출물의 Nitric oxide ( NO ) 생성억제 효과

LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 Raw264.7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 황금 열수추출물의 억제효과를 세포배양액으로부터 Griess assay 방법에 의해 측정하였다.

구체적으로, Raw264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^- 형태로서 측정하였다. Raw264.7 세포를 DMEM배지를 이용하여 1×10⁵ cell/well로 조절한 후 24-well plate에 접종하고 37℃, 5% CO₂의 습윤배양기에서 배양하였다. 세포에 SBWE 2.5, 5, 10, 20 그리고 40 ㎍/㎖ 농도를 전처리하고 1시간 뒤 LPS를 1 ㎍/㎖ 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액과 동량의 Griess 시약을 혼합하여 96-well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하고 그 비를 %값으로 환산하였다.

그 결과, 80 ㎍/㎖의 농도로 처리한 세포군에서 NO의 생성 함량은 대조군와 비교했을 때 약 50% 정도의 소거능을 보여 대조군과 비슷한 수준의 NO 생성량을 나타내었다(도 2).

실시예 4: 황금 열수추출물의 대식세포의 식균작용 억제 효과 확인

실시예 4-1: NBT 발색법을 이용한 식균작용 억제 효과 확인

NBT 발색법을 이용하여 황금 열수추출물의 지모산 A(zymosan A)에 의해 활성화된 Raw264.7 세포의 식균작용 억제능을 조사하기 위하여, Raw264.7 세포를 분리하여 DMEM배지를 이용하여 24-well plate에 24시간 배양하였다. 세포에 황금 열수추출물 2.5, 5, 10, 20 그리고 40 ㎍/㎖ 농도를 전처리하고 1시간 후 배양액을 제거하였다. PBS 1g/100㎖에 녹인 뒤 30분간 가열과정을 거쳐 활성화시킨 지모산 A 10 ㎕와 NBT(nitroblue tetrazolium) 20 ㎕ 그리고 PBS 470 ㎕를 처리하였다. 충분히 섞어준 뒤 620 nm에서 흡광도를 측정하고 그 비를 %값으로 환산하였다.

그 결과, 지모산 A(zymosan A) 처리 하에서 황금 열수추출물은 20 ㎍/㎖의 농도 이상에서 약 20% 정도의 식균작용 억제능을 나타내었다.

실시예 4-2: 형광법을 이용한 식균작용 억제 효과 확인

형광법을 이용하여 황금 열수추출물의 지모산 A(zymosan A)에 의해 활성화된 Raw264.7 세포의 식균작용 억제능을 조사하기 위하여, Raw264.7 세포를 분리하여 DMEM배지를 이용하여 24-well plate에 24시간 배양하였다. 세포에 황금 열수추출물 2.5, 5, 10, 20, 그리고 40 ㎍/㎖ 농도를 전처리하고 1시간 후 배양액을 제거하였다. FITC-conjugated 지모산 A 10 ㎕와 DMEM 90 ㎕를 처리하였다. 충분히 섞어준 뒤 형광을 측정하고 그 비를 %값으로 환산하였다.

그 결과, fluoro conjugated-zymosan A 처리 하에서 황금 열수추출물은 2.5 ㎍/㎖의 농도 이상에서 약 30% 정도의 식균작용 억제능을 나타내었다.

실시예 5: 황금 열수추출물의 염증관련 사이토카인 발현 조절 효과

실시예 5-1: 웨스턴블랏에 의한 염증관련 사이토카인 발현 조절 효과

웨스턴블랏법에 의해 황금 열수추출물의 염증관련 사이토카인의 단백질 수준에서의 발현 억제효과를 조사하기 위하여, Raw264.7 세포에 용출 완충용액(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 ㎍/㎖ leupeptin, 3 mM NaF and 1 mM DTT)을 첨가하여 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 10 ㎍의 세포용출액을 10% Tris-HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 니트로셀룰로스 막에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-iNOS, anti-COX-2, anti-IL-1β, anti-TNFα 그리고 anti-βactin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. 웨스턴블랏의 band는 LAS3000^® image analyzer(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 황금 열수추출물은 농도의존적으로 TNF-α의 발현을 억제시킴을 확인하였다. 또한 황금 열수추출물은 20 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 효과적으로 COX-2 및 iNOS의 발현을 억제하였다.

또한, 급성염증과 만성염증을 유발한다고 알려진 interleukin-1β(IL-1β)와 interleukin-6(IL-6)의 단백질 발현조절 효과를 조사한 결과, 황금 열수추출물 처리군에서 IL-6의 단백질 발현 수준에는 변함이 없었으나 IL-1β의 단백질 발현 수준은 감소하였다.

실시예 5-2: 황금 열수추출물의 시간에 따른 염증관련 사이토카인의 발현 조절 효과

황금 열수추출물의 TNF-α와 IL-1β 단백질 발현 조절효과를 시간에 따라 조사하기 위하여, 황금 열수추출물이 전처리된 Raw264.7 세포에 1, 2, 4, 8 및 16시간 동안 LPS로 자극하였다.

그 결과, Raw264.7 cells는 LPS 처리 1시간부터 TNF-α의 단백질 발현 증가 양상을 나타났으며, 양성 대조군은 Dexamethasone처리 시간에 따라 TNF-α의 단백질 발현을 억제시킴을 확인하였다. 황금 열수추출물 또한 처리 시간에 따라 LPS 처리군과 비교하여 TNF-α의 단백질 발현 수준을 억제시킴을 확인하였다(도 6).

실시예 6: 황금 열수추출물의 TNF -α 및 iNOS 의 mRNA 수준에서의 발현조절 효과 확인

실험에 사용된 RNA는 황금열수추출물을 전처리 한 뒤 LPS로 3시간 동안 자극한 Raw264.7 세포로부터 추출하였다. 추출을 위해 세포는 Trizol^®로 분해시키고 25℃, 12000× g에서 15분 동안 원심분리 한 뒤 클로로폼(chloroform)을 첨가하였다. 이소프로판올(Isopropanol)은 상등액에 1:1 비율로 첨가되었고 RNA pellet은 원심분리에 의해 얻어졌다. 에탄올(Ethanol)로 씻어낸 뒤, 추출된 RNA는 diethyl pyrocarbonate-treated RNase free waster에 녹이고 GENios^® microplate reader(Tecan Austria BmbH)를 이용하여 260nm에서 정량하였다. 같은 양의 RNA(1 ㎍)는 42℃에서 1X reverse transcriptase(RT) buffer, 1 mm dNTPs, 500 ng of oligo (dT) 15 primers, 140 U of murine Moloney leukaemia virus (MMLV) reverse transcriptase 그리고 40 U of RNase inhibitor를 포함하는 mastermix에 45분 동안 방치하여 역전사시켰다. PCR은 TNF-α, iNOS 그리고 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(G3PDH) mRNA를 증폭시키기 위해 automatic Whatman thermocycler(Bionmetra, Kent, UK)를 사용하여 수행되었다. 원하는 cDNA를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

사이토 카인	Forward primer	Reverse primer
TNF-α	5'-TCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3' (서열번호 1)	5'-CCAACTGGTTATCTCTCAGC-3' (서열번호 2)
iNOS	5'-AAGCTGAAATGAATGAGGA-3' (서열번호 3)	5'-GACCTCAGATAATGCAGAGC-3' (서열번호 4)
G3PDH	5'-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3' (서열번호 5)	5'-CATGTAGGCCATGAGGATCCACCAC-3' (서열번호 6)

PCR 생성물을 2% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동시킨 뒤 EtBr(ethidium bromide)로 염색하였으며, AlphaEase^® gel image-analysis software (alpha Inotech, San Leandro, CA, USA)를 사용하여 정량하였다.

그 결과, 황금 열수추출물은 iNOS의 발현 억제효과는 나타나지 않았으나, 양성대조군으로 사용된 Dexamethasone은 iNOS의 발현정도를 매우 감소시켰다. 또한 TNF-α의 mRNA 발현정도는 황금 열수추출물의 농도가 증가함에 따라 감소되었다(도 7).

실시예 7: 황금 열수추출물의 바이칼린 함량 측정

실시예 7-1: 황금 열수추출물에서의 바이칼린 존재 확인

황금 열수추출물의 유효성분으로서, 바이칼린의 존재 및 함량은 HPLC(high performance liquid chromatography)를 사용하여 측정하였다.

HPLC 분석조건은 하기 표 2와 같다.

Gradient mode	0min-A:100 B:0, 10min-A:50 B:50, 20min-A:0 B:100, 20min-stop
용매	A: 1% HCOOH , B:MeCN Flow rate - 1.0 /min
시료	1) 황금 열수추추물 (2.0 g) in MeOH (10 ㎖). 2) Baicalin standard (1 mg) in MeOH (1 ㎖).
이동상	Ethyl acetate:MeOH:H₂O=1000 ㎕:170 ㎕: 130 ㎕ (100 : 17 : 13)
정지상	TLC Slilca gel 60 F254

R _t	Area (%)	R _t	Area (%)
10.461	3.8349	13.231	23.7958
10.754	3.4935	14.743	5.2270
12.135 ( Baicalin )	49.9151	16.431	2.8003
12.629	4.3989	Total	31.8231
12.890	6.5345	22.074	3.2020

그 결과, 상기 표 3에서와 같이 황금 열수추출물에 바이칼린이 높은 함량으로 존재하고 있음을 확인하였다.

실시예 7-2: 황금 열수추출물에서의 바이칼린 함량 측정

바이칼린 지표물질을 이용한 검량선 작성 및 절대 함량분석을 위하여, 분쇄된 황금 열수추출물 10 mg을 10 ㎖의 메탄올에 용해시켜 syringe filter를 통하여 여과한 후, 그 여액 10 ㎖를 HPLC에 인젝션(injection) 하였다. 이동상의 용매로는 1% formic acid(solvent A)와 MeCN(solvent B)를 사용하였다. 컬럼은 YMC gel ODS A 302(4.6 x 250 mm, 5 ㎖, USA)를 이용하였고, 바이칼린에 대해서 각각 280 nm 에서 10, 25, 50, 100 mg/㎖의 농도로 분석하여 크로마토그램을 얻고 평균면적을 얻어 표준곡선을 그렸다.

그 결과, 바이칼린이 황금열수추출물에 42.2mg/g 함유되어 있는 것을 확인하였다(도 11 및 표 4).

Sample No.	Retention Time (min)	Contents	Equation
Baicalin^a	3.8	42.2mg/g	y = 2853.2x + 418.35	R²= 0.991

y축(area, ㎶), x축(concentration, ㎍/㎖)

^agradient mode: 0min; 20%, 5min; 20%, 15min; 50%, 30min; 100%(solvent A: 1% HCOOH, Solvent B: MeCN)

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Dong-eui University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising water extract containing baicalin from Scutellaria baicalensis through immune modulation <130> PA130998/KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 1 tctctctaat cagccctctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 2 ccaactggtt atctctcagc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 3 aagctgaaat gaatgagga 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 4 gacctcagat aatgcagagc 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G3PDH forward primer <400> 5 tgaaggtcgg tgtgaacgga tttggc 26 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G3PDH reverse primer <400> 6 catgtaggcc atgaggatcc accac 25

Claims

황금(Scutellaria baicalensis) 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린(baicalin)을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성을 억제하거나, 대식세포의 식균작용을 억제하는 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 시클로옥시게나아제-2(cyclo-oxygenase-2, COX-2), 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) 또는 인터류킨-1β(IL-1β)의 발현을 억제하는 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제1항에 있어서,
약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 조성물.
황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 비인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역조절을 통한 염증성 질환의 예방 또는 치료방법.
(a) 건조된 황금을 물과 1 : 8 내지 1 : 12의 중량비로 혼합하고, 70 내지 100℃에서 1 내지 5 시간 동안 열수추출하는 단계; 및
(b) 상기 열수추출 단계를 1 내지 5회 반복추출하는 단계를 포함하는, 황금 열수추출물 1 g당 0.8 ㎍ 내지 50 mg의 바이칼린을 함유하는 황금 열수추출물 제조방법.