KR101750854B1 - 프로폴리스 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 헬리코박터 파이로리 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로폴리스 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분을 포함하는 항 헬리코박터 파이로리 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항 헬리코박터 파이로리 조성물은, 프로폴리스를 80v/v% 에탄올 수용액으로부터 추출물을 제조하고, 상기 추출물을 10 v/v % 메탄올로 현탁한 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(H2O)로 분획하여 제조된 추출물 중 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 분획된 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해 제공된 항 헬리코박터 파이로리 조성물은, 헬리코박터 파이로리 유래 위십이지장 관련 질환을 예방 및 치료할 수 있음에 따라 국민 건강의 증대효과를 얻을 수 있음과 동시에 고가의 프로폴리스를 대체할 수 있는 추출분획물 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 이용함으로써 생산단가의 절감이 가능함과 동시에 천연물을 이용함으로써 항생제 내성의 문제도 발생시키지 않고, 양봉 농가의 소득 증대 및 국가 경쟁력 확보에 기여할 수도 있게 된다.

Description

프로폴리스 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 헬리코박터 파이로리 조성물{A antibiotic composition for Helicobacter pylori containing the propolis extraction fractions thereof or subfractional extrats isolated therefrom}

본 발명은 프로폴리스 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 헬리코박터 파이로리 조성물에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 균에 대한 항균활성을 갖는 프로폴리스 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 헬리코박터 파이로리 조성물에 관한 것이다.

헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)는 1983년 호주의 마샬 박사와 워렌 박사에 의하여 순수 분리, 배양하는데 성공하여 그 이름이 명명되었고, 많은 논문에서 이 세균이 위염, 위궤양, 십이지장궤양 환자의 위생검사에서 높은 비율로 검출되는 것이 알려지면서, 현재는 위궤양, 위염, 위암 및 십이지장 궤양의 발병인자 중 하나로 인정되고 있다.

상기 헬리코박터 파이로리는 위점막 상피세포간 접합부에 서식하는 그람 음성의 간균으로서 최적의 생육 pH는 7.0 ∼ 7.4이며 온도는 30 ∼ 37℃의 미호기적 조건에서 생장한다. 헬리코박터 파이로리의 병독인자들을 보면 위에서 분비되는 위액의 강산조건에 생존하기 위해 분비되는 CagA, VacA를 분비하는 단백질인 SecA, 운동성을 유지하기 위해 있는 편모, 위점막 상피세포에 부착을 용이하게 도와주는 외막단백질 등이 알려져 있다. 이중 유레아제는 위점막 조직 내의 요소를 암모니아와 이산화탄소로 분해하여 균체 주의를 알카리화 시킴으로서 위에서 분비되는 강산의 조건을 중화시켜 생존 할 수 있는 조건을 만드는 특성을 갖는다.

현재 헬리코박터 파이로리의 대표적인 치료방법은 메트로니다졸 (Metronidazole), 아목시실린(amoxicillin)과 같은 항생제에 의존하고 있고, 이러한 약제의 반복사용은 항생제 저항성 증가 및 다양한 부작용을 야기하는 것으로 보고 되고 있으며, 현재는 다양한 천연물 소재를 이용하여 헬리코박터 파이로리를 억제 할 수 있는 추출물 및 활성성분을 찾기 위한 노력이 지속되고 있다.

관련 선행특허기술들로는 헬리코박터 파이로리 억제 효능을 가지는 강화순수 추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품(공개번호 10-2012-0053352), 녹조류 추출물을 함유하는 항헬리코박터 조성물(공개번호 10-2011-0023844), 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강식품(공개번호 10-2011-0117491), 구절초 추출물 또는 추출분획물을 유효성분으로 함유하는 위장관 질환의 예방 및 치료용 조성물(공개번호 10-2010-0044433) 등이 있다.

본 발명의 목적은 프로폴리스 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물, 상기 조성물을 포함하는 위십이지장 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 상기 조성물을 포함하는 위십이지장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물은, 본 발명의 항 헬리코박터 파이로리 조성물은, 프로폴리스를 80v/v% 에탄올 수용액으로부터 추출물을 제조하고, 상기 추출물을 10 v/v % 메탄올로 현탁한 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(H2O)로 분획하여 제조된 추출물 중 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 분획된 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.

상기 유효성분은 에틸아세테이트 추출분획물을 hexane-EtOAc(4:1)의 혼합용매에 용해시켜 컬럼크로마토그래피에서 분배하여 5번째로 소분획된 추출물인 것이 특징이다.

이러한 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물은 위십이지장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 위십이지장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 포함되어 사용되며, 위십이지장의 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양 및 위암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 특징이다.

본 발명의 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물의 제조방법. 프로폴리스를 준비하는 제1단계, 상기 프로폴리스를 에탄올(80v/v%)에 넣고 추출하여 프로폴리스 추출물을 제조하는 제2단계, 상기 프로폴리스 추출물을 메탄올(10 v/v%)로 현탁한 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(H2O)로 분획하여 추출분획물을 얻는 제3단계, 상기 제 3단계의 추출물 중 에틸아세테이트 추출분획물을 유효성분으로 포함하여 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물을 제조하는 제4단계를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명에 의해 제공된 항 헬리코박터 파이로리 조성물은, 헬리코박터 파이로리 유래 위십이지장 관련 질환을 예방 및 치료할 수 있음에 따라 국민 건강의 증대효과를 얻을 수 있음과 동시에 고가의 프로폴리스를 대체할 수 있는 추출분획물 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 이용함으로써 생산단가의 절감이 가능함과 동시에 천연물을 이용함으로써 항생제 내성의 문제도 발생시키지 않고, 양봉 농가의 소득 증대 및 국가 경쟁력 확보에 기여할 수도 있게 된다.

도 1은 프로폴리스 추출물 및 이를 용매분획한 추출분획물의 TLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.
1. 프로폴리스 에탄올 추출물
2. 헥산(Hexane) 추출분획물
3. 에틸아세테이트(ethyl acetate) 추출분획물
4. 부탄올(BuOH) 추출분획물
5. 물(H2O) 추출분획물
도 2는 프로폴리스 추출물 및 이를 용매분획한 추출분획물의 헬리코박터 파이로리에 대한 항균력 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 프로폴리스 에틸아세테이트 추출분획물에서 소분획된 추출물의 헬리코박터 파이로리균 사멸 소요시간을 나타낸 도면이다.
도 4는 정상세포주에서의 본 발명의 프로폴리스 에틸아세테이트 추출분획물에서 소분획된 추출물의 세포독성을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.

본 발명은 프로폴리스 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물을 제공한다.

설명하면, 프로폴리스는 50%의 수지, 30%의 밀랍, 10%의 정유 등의 유성성분 그리고 5%의 화분, 나머지 5%의 유기물이나 미네랄 물질로 구성되어 있는 바, 프로폴리스의 정량 영양소 중에는 세포의 대사에 중요한 역할을 하는 미네랄이나 비타민류의 항균작용이 탁월하여 식물의 정수라고 할 수 있는 플라보노이드가 극히 높게 함유되어 있어 건강기능식품의 원료로 많이 사용되고 있다.

또한, 프로폴리스는 자체에 고유의 독특한 향을 발상하는 특성이 있을 뿐만 아니라 근래에 프로폴리스의 임상에의 응용연구가 활발히 진행되어 항균효과, 항진균효과 및 항바이러스 효과 등이 밝혀짐에 따라, 암종양의 증식 억제, 당뇨병 체질의 개선, 각종 염증성질환 알레르기성 질환(기관지 천식,약물 알레르기), 동맥경화증, 고혈압증, 전립선, 갑상선 기능장애, 부인과 질환, 류마티스, 뇌혈관부전, 정신불안, 치질환(峙疾患), 피부질환 등의 광범위한 질환에의 적용이 보고된 바있다.

그러나 이러한 프로폴리스는 고가의 천연물질이므로, 소비자들이 용이하게 사용하기 어려움이 있는 바, 본 발명의 발명자는 상기 문제점을 해결하고자 고가의 프로폴리스를 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물의 형태로 제조하고 이를 유효성분으로 포함하여 항균력을 유지하는 조성물을 개발하게 된 것이며, 특히, 위궤양 원인균으로 알려진 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 균에 대한 항균효과 를 확인한 바, 헬리코박터 파이로리가 원인인 위장 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 식·의약용 조성물을 개발하게 된 것이다.

이에, 본 발명의 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 제1단계: 프로폴리스 준비

먼저, 본 단계에서는 프로폴리스를 준비한다.

이때, 프로폴리스의 종류로는 어떠한 것으로 사용하여도 무관하나, 프로폴리스의 성분과 생리활성을 지역 및 밀원에 따라 달라지므로 본 발명에서는 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 효과를 나타내는 성분을 많이 포함하는 국내산 프로폴리스를 사용하는 것이 좋다.

2. 제2단계; 프로폴리스 추출물 제조

본 단계에서는 상기 프로폴리스에 에탄올(80v/v%)을 넣고 추출하여 프로폴리스 추출물을 제조한다.

이때, 상기 추출은 상기 프로폴리스와 상기 에탄올(80v/v%)을 0.001~0.5:1 중량비로 혼합한 후 이를 20~25℃에서 10~15시간동안 이루어지는 통상의 방식을 적용하는 것으로서, 이는 기능성식품공전 시험법에 기재된 방식이다. 또한 상기 사용된 에탄올로는 어떠한 에탄올을 사용하여도 무관하나, 프로폴리스 내에 함유된 유효성분을 가장 적절히 추출할 수 있도록 70~80%의 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

3. 제3단계; 추출분획물 또는 이로부터 소분획된 추출물 제조

본 단계에서는 상기 제조된 프로폴리스 추출물로부터 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 효과를 나타내는 성분을 얻기 위해 상기 제조된 프로폴리스 추출물을 메탄올(10 v/v%)로 현탁한 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(H2O)로 분획하여 추출분획물을 얻는다.

설명하면, 상기 용어 “추출분획물”은 상기 프로폴리스 추출물 제조시 이용하였던 용매와 다른 용매를 이용하여 상기 프로폴리스 추출물로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 가지는 분획하여 얻은 활성 추출분획물(fraction)을 의미한다.

이러한 추출분획물을 얻기 위하여 사용되는 용매는 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출용매도 가능하며, 바람직하게는 에틸 아세테이트 또는 부탄올을 사용하며, 더욱 바람직하게는 에틸 아세테이트를 사용하는 것이 좋다.

이는 에틸 아세테이트 추출분획물에 프로폴리스 성분 중에 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 균에 대한 강한 항균활성을 나타내는 추출물인 유효성분이 함유되어 있기 때문이다.

또한, 본 단계에서는 상기 에틸아세테이트 추출분획물을 hexane-EtOAc(4:1)의 혼합용매에 용해시켜 컬럼크로마토그래피에서 분배하여 5번째로 분획된 추출물을 제조하기도 한다.

4. 제4단계; 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물 제조

본 단계에서는 상기 제 3단계의 추출물 중 에틸아세테이트 추출분획물을 유효성분으로 포함하거나 에틸아세테이트 추출분획물을 hexane-EtOAc(4:1)의 혼합용매에 용해시켜 컬럼크로마토그래피에서 분배하여 5번째로 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하여 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물을 제조한다.

설명하면, 상기 추출분획물 또는 이로부터 소분획된 추출물은 헬리코박터 파이로리에 대한 항균활성이 우수하며, 특히 추출분획물에서 소분획된 추출물은 헬리코박터 파이로리균에 대해 우수한 항균 지속효과를 나타낼 뿐만 아니라 위궤양 유발 암세포에 대하여 높은 저해율을 나타남을 확인한 바, 헬리코박터 파이로리의 감염에 의한 만성 위축성 위염, 십이지장궤양, 위궤양을 비롯하여 위암에 이르기까지 다양한 위십이지장의 치료 또는 예방 효과가 뛰어날 것으로 예측되는 바, 본 발명에서는 상기 프로폴리스의 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물에 포함하여 제조하게 된 것이다.

이때, 상기 유효성분의 함량은 조성물 중량대비 0.01~50중량%로 포함되는 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 1~30중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 이는 상기 함량이 0.01 중량% 미만일 경우 위십이지장 질환에 대한 효과가 미흡하게 나타나며, 50 중량%를 초과하면 더 우수한 효과는 미비하게 나타내며 오히려 사용된 용매로 인한 세포독성을 나타내는 문제가 발생하기 때문이다. 상기 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 상기 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 항 헬리코박터 파이로리 조성물은 상기와 같은 유효성분 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로 상기 당질은 프로폴리스, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein)등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유,팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 않는다.

또한, 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물은 본 발명의 효과를 유지하고, 상기 첨가되는 성분에 의한 부작용을 발행시키지 아니하는 범위에서, 상기 유효성분 외에 헬리코박터 파이로리의 살균 목적을 위한 첨가제, 바람직하게는 헬리코박터 파이로리에 대한 살균 활성이 인정된 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 추가 성분 또는 첨가제는 조성물의 다른 구성으로 방해될 수 없게 제공될 수 있다.

본 발명의 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있고, 구체적으로는 헬리코박터 파이로리의 생육억제를 위한 용도로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 헬리코박터 파이로리에 대한 항생제 또는 상기 헬리코박터 파이로리가 원인균인 위십이지장 질환의 치료, 예방 또는 개선의 목적으로 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 항 헬리코박터 파이로리 조성물은 위십이지장 질환의 원인이 되는 상기 헬리코박터 파이로리에 대한 항균 활성이 있고, 상기 헬리코박터 파이로리에 대한 부착 억제능이 있고, 요소분해효소 활성억제 능력이 인정 되어서, 위십이지장 질환의 치료, 개선 또는 예방에 현저하게 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었으므로, 위십이지장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이나 위십이지장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 응용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 위십이지장 질환이란 위 또는 십이지장 부위에 발생하는 질환을 의미하고 소화성 궤양과 위암을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 위염, 십이지장염, 위궤양, 십이지장궤양 및 위암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 위염은 바람직하게는 만성 위축성 위염일 수 있다. 헬리코박터 파이로리가 발견된 이후로, 상기 위십이지장 질환의 주 원인균은 헬리코박터 파이로리로 보고 되어있다. 상기 헬리코박터파이로리는 위점막 구체적으로는 상피세포 및 점막층에 주로 결합하여, 서식하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 위십이지장 질환을 치료하기 위해서는 원인균인 헬리코박터 파이로리에 대한 항균활성이 뛰어나거나, 상기 헬리코박터 파이로리의 요소분해효소(urease)를 저해하거나 상기 위점막에 대한 부착을 억제할 수 있는 부착억제능이 뛰어난 물질을 처방할 수 있다.

상기 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물을 상기 유효성분을 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분이 조성물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

이때 제형은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함될 수도 있다.

상기 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물이 1㎖ 인 경우 0.01㎍ 이상 5㎍ 이하로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는 1㎍ 이상 5㎍ 이하로 포함될 수있다.

또한, 상기 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있다.

구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 주사제, 주정제, 카타플라스마제(cataplasma), 캅셀제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화 될 수 있다.

본 발명에 따른 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 조성물을 기준으로 할 때, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 위십이지장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물 이외에 공지의 위십이지장 질환의 억제활성을 갖는 화합물 또는 천연물에 대한 추출물을 더욱 포함할 수 있다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물을 유효성분으로 포함하는 위십이지장 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 항 헬리코박터 파이로리 조성물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 항 헬리코박터 파이로리 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.

또한, 위십이지장 질환의 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 항 헬리코박터 파이로리 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.

이하에서는 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예 및 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 프로폴리스 추출물 유래 추출분획물 제조

기능성식품공전 시험법에 따라 국내산 프로폴리스 50 g을 80% EtOH(주정) 5 L와 섞어 12시간 동안 상온(24℃)에서 추출한 후 감압농축하여 80% EtOH 추출물 32g을 얻었다. 이를 양성대조구로 사용하였다.

이렇게 제조된 프로폴리스 추출물 10g을 10% 메탄올(MeOH)로 현탁한 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(H2O) 순으로 추출한 후 감압농축하여 각각의 추출분획물을 얻었으며, 각 추출분획물의 수득량은 하기 표 1과 같이 나타났다.

	프로폴리스 에탄올추출물	헥산 추출분획물	에틸아세테이트 추출분획물	부탄올 추출분획물	물 추출분획물
수율(%)	32.3	3.9	90.5	1.4	4.2

<실험예 1> Thin thin-layer chromatography(TLC) 성분 분석

1) 실험방법

상기 프로폴리스 추출물 및 프로폴리스 추출물 유래 추출분획물들을 10 mg/ml로 만든 후 역상 TLC plate에 90 ㎕를 점적하였고 그 후 실온에서 건조시킨 후 chromatographic chamber에 methanol - water - chloroform(80 : 20 : 0.1) 용액을 50 ml을 넣은 후 TLC 플레이트를 넣고 포화시켰다.

TLC 플레이트에 용액이 끝 부분에서 5 mm 만 남겨져 있을 때 까지 전개시킨 후 UV detector(254 nm)를 사용하여 발색을 확인하고, 10% sulfuric acid (H₂SO₄)를 스프레이하여 발색시켜 spot을 확인하였다.

1% iron chloride (FeCl₃)로 발색 후 spot을 확인한다.

2) 실험결과

국내산 프로폴리스의 구성성분을 확인하기 위하여 80% EtOH 추출물을 비극성용매(hexane)에서 극성용매(butanol)로 분획한 후 역상 TLC를 실시하였다.

각 시료를 TLC 플레이트에 점적한 후 10% H₂SO₄을 이용하여 검출되는 화합물을 확인한 결과, 도 1에 나타나 있듯이 Rf치 0.5 부근의 황색반점이 확인되었다.

80% EtOH 추출물에서 검출되는 모든 밴드는 ethyl acetate 추출분획물에 대부분 존재하는 것으로 나타났다. 또한 10% H₂SO₄에 검출되는 거의 모든 화합물은 자외부 단파장(254nm)에서 흡수가 강하게 일어났다.

1% FeCl₃를 이용하여 페놀성화합물의 정성시험을 한 결과 페놀성 화합물이 존재하는 것으로 확인되었다.

다시 말해, 80% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 용매로 분획한 추출분획물의 성분은 유사한 성분 패턴을 보이는 것으로 확인되었다.

<실험예 2> 항 헬리코박터 파이로리에 대한 항균력 검정

1) 실험방법

헬리코박터 파이로리에 대한 항균 활성 측정에 사용된 헬리코박터 파이로리 균주는 한국미생물보존센터로부터 ATCC 43526 Strain을 구입하여 사용하였고, Trypticase Soy Agar(TSA, BBL, Becton Dickinson, USA)에 5% horse serum(Gibco)를 첨가한 배지에 접종하여 혐기적 조건을 유지시켜주기 위하여 10% CO₂ 배양기(incubator)에서 37℃로 48시간 배양하여 준비하였다.

배양기의 습도는 항상 95% 이상으로 유지하였다. 항균력 시험은 paper disc 법을 사용하였다. 5% horse serum(Gibco)를 첨가한 TSA에서 37℃의 조건으로 48시간 배양시킨 후, colony로부터 백금이를 이용하여 채취한 균주를 TSB에 현탁하여 (1.0×10₆)cfu/mL의 농도로 희석하였다.

상기 프로폴리스 추출물 및 추출분획물들을 다양한 농도로 각각 멸균된 paper disc(ф8.0mm, Advantec Co)에 흡수시킨 후, 크린벤치에서 휘발시켰다. 5% horse serum이 첨가된 TSA 배지에 상기 균주 희석액을 100 ㎕ 넣고 유리봉으로 균일하게 도말하였다.

헬리코박터 파이로리 고체 배양배지 위에 프로폴리스 추출물 및 추출분획물들을 함유한 paper disc를 올려놓고 37℃의 조건에서 CO2 배양기를 이용하여 48시간 동안 배양하였다. 그 후, disc 주위의 저해환(inhibition zone)의 직경(mm)을 측정하였다.

2) 실험결과

상기 실험결과, 하기 표 2 및 도 2와 같이 나타났다.

농도(㎍)	프로폴리스 에탄올추출물	헥산 추출분획물	에틸아세테이트 추출분획물	부탄올 추출분획물	물 추출분획물
저지대(mm)	2.1	0	2.8	1.9	0.1

상기 표 2 및 도 2에 나타나 있듯이, 프로폴리스 추출물과 추출분획물들에 대한 항균력을 측정한 결과 10 ㎍의 농도에서는 항균력이 확인되지 않았으며, 50 ㎍의 농도에서 프로폴리스 추출물과 에틸아세테이트 층에서 항균력이 확인되었으며 에틸아세테이트 층에서 좀 더 강한 항균력을 보였다.

<실험예 3> Ethyl acetate 추출분획물로부터 항헬리코박터 파이로리 유효성분 분리

1) 실험방법

프로폴리스 1 kg로부터 얻은 에틸아세테이트 추출분획물(실시예 1)의 수득율은 90.5% 이었다. 항헬리코박터 파이로리 주성분을 분리하기 위하여 에틸아세테이트 추출물 90.5 g을 flash column chromatography 사용하여 hexane-EtOAc (4:1)로 극성에 따라 12개의 추출물(약 10 ml)을 얻어 각각 H. pylori에 항균력을 측정하였다. 이때 항균력 측정은 paper disc방법으로 12개의 소 분획물 10 ㎍의 농도에서 H. pylori에 대한 저지환을 구하였다.

2) 실험결과

상기 12개의 추출물에 대한 항균력 측정 결과, 하기 표 3과 같이 나타났다.

추출물	항균력(저지대, mm)
1번째	0
2번째	0.8
3번째	0.9
4번째	1.3
5번째	3.9
6번째	0.9
7번째	0.3
8번째	0.1
9번째	0.1
10번째	0.1
11번째	0
12번째	0

상기 표 3에 나타나 있듯이, 극성에 따라 분획된 5번째 소분획물이 H. pylori에 항균력이 가장 높은 것으로 확인되었다. 이는 분획전 에틸아세테이트 분획물 보다 월등히 높은 항균력을 나타내는 것으로 확인되었다.

<실험예 4> 항헬리코박터 파이로리 유효성분에 대한 최소저해농도측정법(Minimum inhibitory concentration, MIC)과 최소살균농도측정법(Minimum bactericidal concentration, MBC)을 통한 항균력 확인

1) 실험방법

96 well plate에 TSA를 분주하고 Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)에 대하여 다양한 농도로 희석하면서 첨가하였다.

미리 배양하여 1.0 × 10⁶ CFU/ml 농도로 희석한 헬리코박터 파이로리 균을 접종하여 37℃의 CO2 배양기에서 48시간 동안 배양한 후, 600 nm의 흡광도로 측정하였다. 흡광도 값이 음성대조군과 같은 최소 농도를 MIC 값으로 결정하였다.

MIC 값 측정 후 각 well에 배지를 TSA 배지에 각각 10 ㎕씩 옮긴 후 2일간 배양 하였으며, 배양 후 균의 생장을 확인 한 다음 균이 자라지 않은 최저 농도를 MBC 값으로 결정하였다.

2) 실험 결과

Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)에 대한 MIC 및 MBC의 결과는 하기 표 4와 같이 나타났다.

	MIC(㎍/ml)	MBC(㎍/ml)
항헬릴코박터 파이로리 유효성분	50	75

상기 표 4에 나타나 있듯이, 5번째 소분획물의 H. pylori에 대한 항균력은 MIC는 50 ㎍/ml로 나타났으며 MBC는 75 ㎍/ml로 나타나는 바, 항균력이 우수한 것으로 확인되었다.

<실험예 5> Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)의 헬리코박터 파이로리균 사멸 소요시간 측정

1) 실험방법

Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)에 대한 살균력 지속시간(PAE,postantibiotic effect)을 측정하여, 항균력에 대한 안정성을 확인하였다.헬리코박터 파이로리균을 2.5X105 CFU/well로 조절하여 각 MIC값, MIC값 2배 및 10배 농도의 Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분) 시료와 함께 1시간 동안 배양한 후, 원심분리와 배지 희석법을 사용하여 Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)을 제거하였다. 이후 새로운 배지로 교환하여 37℃의 CO2 배양기에서 배양하며 2시간 간격으로 균수를 측정하였다. 이때, PAE 수치가 클수록 항균 지속 효과가 우수하다고 할 수 있으며, PAE를 구하는 식은 아래와 같다.

PAE = T-C

T : 봉독을 처리한 시험구에서 1 log10 까지의 생육에 걸리는 시간

C : 무처리구에서 1 log10까지의 걸리는 시간

2) 실험결과

도 3에 나타난 바와 같이 Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)은 헬리코박터 파이로리균에 대하여 적어도 MIC값 2배의 농도에서 4시간이 경과되면 사멸 효과를 나타내었으며, 시간이 지남에 따라 점차적으로 높은 사멸효과를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 6> 정상세포 및 위궤양 유발세포에 대한 독성 측정

1) 실험방법

인간 신장세포인 HEK293 (kidney normal, human)과 인체 위장 상피세포인 AGS(human gastric adenocarcinoma cell)은 한국세포주은행으로부터 분양받아 RPMI1640배지를 이용하여 37℃로 5% CO2 배양기(incubator)에서 배양하였다. Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)을 농도별로 처리하고 세포독성은 MTT assay로 측정하였다.

2) 실험결과

정상세포와 위궤양 유발 암세포에서의 독성을 측정한 후 각 농도에서의 세포독성에 대한 생육 억제 활성의 비율인 selectivity를 하기 표 5에 나타내었다. 도 4에서는 인간 정상 세포 HEK293에 대한 독성을 나타낸 것이다.

concentration(mg/ml)	inhibition ratio(mg/ml)	selectivity(mg/ml)
0.2	46.0	3.9
0.4	49.0	3.5
0.6	50.4	3.2
0.8	65.6	3.9
1.0	74.5	3.4

상기 표 5 및 도 4에 나타나 있듯이, 정상세포에 대한 세포독성은 Ethyl acetate 추출분획물로부터 소분획된 추출물(항헬리코박터 파이로리 유효성분)의 농도가 높아질수록 증가하였고, 1.0mg/ml에서 24.1%로 측정되었다. 25% 미만의 낮은 독성으로 세포수준에서 유의할 만한 독성은 아닌 것으로 확인되었다. AGS인 인간 위암세포에 대해서 저해율이 최고농도 1.0 mg/ml에서 74.5%로 암세포 억제율이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다.

이상 상기결과들을 토대로, 본 발명의 프로폴리스의 추출분획물, 또는 이로부터 소분획된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물이 위십이지장 질환의 치료에 유용할 수 있음을 의미하며, 특히 위십이지장의 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양 및 위암의 예방 또는 치료에 유용할 수 있음을 의미한다.

이하, 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 약제학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1: 약제의 제조>

1-1. 산제

실시예 1의 에틸아세테이트 추출분획물 2 g에 유당 1 g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제

실시예 1의 에틸아세테이트 추출분획물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제

실시예 1의 에틸아세테이트 추출분획물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4. 주사제

실시예 1의 에틸아세테이트 추출분획물 100 ㎎에 주사용 증류수 적량을 가하여 용해시키고, pH를 약7.5로 조절한 다음 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진 및 멸균시하여 주사제를 제조하였다.

<제제예 2: 기능성 식품 제조>

2-1. 선식

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 검정콩, 검정깨 및 들깨 각각을 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 후 배전 및 분쇄하여 입도 60 메쉬의 분말로 준비하였다. 이후, 현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%, 찹쌀 9 중량%, 들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%, 실시예 1의 에틸아세테이트 추출분획물 3 중량%, 영지 0.5 중량% 및 지황 0.5중량%을 혼합하여 선식을 제조하였다.

2-2. 음료

꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량%, 물 98.7362 중량% 및 실시예 1의 에틸아세테이트 추출분획물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

1. 프로폴리스를 80v/v% 에탄올 수용액으로부터 추출물을 제조하고, 상기 추출물을 10 v/v % 메탄올로 현탁한 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(H₂O)로 분획하여 제조된 추출물 중 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 분획된 추출분획물을 hexane-EtOAc(4:1)의 혼합용매에 용해시켜 컬럼크로마토그래피에서 분배하여 다섯번째로 분획된 추출물을 유효성분으로 하는,
   항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 따른 조성물이 포함된,
   위십이지장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 위십이지장의 질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양 및 위암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 위십이지장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 따른 조성물이 포함된,
   위십이지장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
6. 프로폴리스를 준비하는 제1단계;
   상기 프로폴리스를 에탄올(80v/v%)에 넣고 추출하여 프로폴리스 추출물을 제조하는 제2단계;
   상기 프로폴리스 추출물을 메탄올(10 v/v%)로 현탁한 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(BuOH), 물(H₂O)로 분획하여 추출분획물을 얻는 제3단계,
   상기 제 3단계의 추출물 중 에틸아세테이트 추출분획물을 hexane-EtOAc(4:1)의 혼합용매에 용해시켜 컬럼크로마토그래피에서 분배하여 다섯번째로 분획된 추출물을 유효성분으로 포함하여 항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물을 제조하는 제4단계;를 포함하는,
   항 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 조성물의 제조방법.
7. 삭제

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