KR102457367B1 - 제주산 방울 양배추 절임식품에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주 및 이를 이용한 조성물 제조방법 - Google Patents
제주산 방울 양배추 절임식품에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주 및 이를 이용한 조성물 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 제주산 양배추 절임식품에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항염용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적 조성물, 피부 외용제, 화장료 조성물, 식품 조성물, 정장제 조성물, 유산균 스타터 및 사료 또는 사료 첨가제 조성물 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적 조성물, 피부 외용제, 화장료 조성물, 식품 조성물, 정장제 조성물, 유산균 스타터 및 사료 또는 사료 첨가제 조성물 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이를 포함하는 항균 또는 항염용 조성물에 관한 것이다.
피부 염증의 원인은 피부 염증의 종류에 따라 다양하지만, 예를 들어, 여드름은 피부 염증을 유발하는 균(bacteria)에 의해 발생한다. 이와 같이 균에 의한 여드름을 치료하기 위해서는 에리스로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline) 또는 신다마이신(cindamycine)과 같은 항생제를 사용하여 치료한다.
그러나 이러한 항생제는 장기간 사용시 여드름균 및 기타 상재균에 대하여 내성균을 유발시켜 치료효과를 감소시키고, 광과민작용 등의 부작용을 일으키는 등의 문제를 유발하는 것으로 보고되고 있다.
또한, 합성 항균제로서 사용되는 파라옥시안식향산에스텔 및 파라벤류 등의 방부제는 피부에 알러지 또 는 부종을 유발하는 부작용이 보고되고 있다(비특허문헌 1). 천연항균제로서, 예를 들어, 히노키티올 (hinokitiol, 편백추출물), 바이칼린 (baicalin, 황금추출물), 메그노놀 (megnonol, 목련 추출물), 및 자몽종자추출물인 DF-100 등이 상용화되어 있다. 이러한 천연항균제는 pH 또는 킬레이트에 의한 항균효과를 갖는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 2).
이에, 본 발명자들은 여드름을 포함하는 피부 염증 질환을 일으키는 균에 대한 항균 활성 및 항염 활성을 갖는 신규한 유산균을 발견하고자 노력한 결과, 제주산 방울 양배추 절임식품에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 유산균이 항균 또는 항염 활성을 보이는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Andrea Counti et al., Contact Dermatitis, 1997, 37: 35-36; Edwin et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 1998, 153: 12-19
EI-shenawy et al., J. Food Protec. 1989, 52(11): 771-778; Bizri et al ., J. Food Science, 1994, 59(1):130-135
본 발명의 목적은 수탁번호 KFCC11872P의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항염용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 피부 외용제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항염용 화장료 조성물, 및 항균용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 정장제 조성물, 발효용 유산균 스타터, 및 사료 또는 사료첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 절임식품으로부터 피부 항균 또는 항염 효과, 피부 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 락토바실러스 속 유산균 균주인 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126)을 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126)을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126)은 절임식품인 제주산 양배추 절임식품 유래의 락토바실러스 플란타룸 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126을 제주산 양배추 절임식품에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에의 실시예를 통해 분리된 유산균 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 서열번호: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
따라서, 서열번호: 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2020년 10월 15일자로 기탁하였다(수탁번호 KFCC11872P).
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126은 그람양성균이고 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultative anaerobe)이며, 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 세포는 간균의 형태를 취하고 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126이 피부 염증 질환 유발 균주인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대해 항균 활성을 나타냄을 확인하기 위해 생육 억제환을 측정하였다. 그 결과, 10 ㎜ 이상의 생육 억제환을 형성하여 높은 생육 억제활성을 보임을 확인하였다.
또한, 일 실시예에 있어서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126의 피부 염증 질환 유발 균주인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 생육 억제능을 평가하였다. 그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주의 상등액을 10% 농도로 처리한 경우 45%의 생육 억제능을 보이고, 25% 농도로 상등액을 처리한 경우 100%의 생육 억제능을 보임을 확인하였다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126이 피부 염증 유발 균주인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 항균 활성을 나타냄을 확인하기 위해 생육 억제환을 측정하였다. 그 결과, 7 ㎜ 이상의 생육 억제환을 형성해 생육 억제활성을 보임을 확인하였다.
또한, 일 실시예에 있어서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126의 피부 염증 질환 유발 균주인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 생육 억제능을 평가하였다. 그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126의 상등액을 10%로 처리한 경우 대조군(control) 대비 63.1%의 생존율을 보임을 확인하였다.
한편, 한 구체예에 있어서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126의 소재 활용을 위해 사균체 및 배양액을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 배양액은 발효물과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
하기 실시예에서는, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126이 일산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 대식세포 유래 전염증성 매개물질의 분비를 효과적으로 저해하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항염용 조성물을 제공한다.
상기 항균용 조성물은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균에 대해 항균 활성을 가지는 것일 수 있으나, 피부 염증 질환을 일으키는 균이라면 제한되지 않고 적용될 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물이 약학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제를 제공한다.
상기 외용제 조성물은 인체의 외부에 사용하는 것으로, 제형화 형태에 따라, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 제형일 수 있으나, 외용 요법으로 사용될 수 있는 것이라면 형태에 따라 제한되지 않는다. 예컨대, 연고로 제형화될 경우 피부 온도, pH, 수분량, 지질량 등이 고려되야 하고 바셀린, 파라핀, 플라스틱, 라드, 실리콘, 식물성 오일, 왁스, 라놀린 등의 유지성 기제, 유제성 기제, 수용성 기제 및 현탁성 기제 등으로 제형화할 수 있으며, 산화방지제, 방부제, 보습제, 용해보조제, 연화보보제 등의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “염증 질환”은 염증을 일으키는 균에 의해 발생되는 질환이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 여드름, 모낭염, 비부비동염, 심내막염, 식중독, 장염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, “피부 염증 질환”은 피부에 염증을 일으키는 균에 의해 발생되는 질환이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 여드름, 모낭염 및 피부 농양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항균 또는 항염용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 앰플, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션, 비누 또는 세정제의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상적인 사용 방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 통상의 화장품에 사용가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 보습제, 자외선 차단제, 중화제, 점증제, 향료, 방부제, 산화방지제 또는 색소를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 음료, 바 등의 형태를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 발효유 등의 음료를 포함할 수 있다. 이에, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 또는 이의 배양물로 이루어지는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각 종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
상기 본 발명에 따른 조성물은 사료첨가제 또는 사료로서 이용될 수 있다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서 동물을 포유류를 포함하고 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주의 양은 1회를 기준으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다. 균주를 투여할 경우에는 생균 상태로 투여하는 것이 바람직하며, 섭취 전에 사멸시키거나 감쇄(attenuation) 상태로 투여할 수 있다. 또한, 배양 상등액 등을 사용하여 제조할 경우에는 열처리 과정을 통한 멸균화 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 균주량 및 일일 섭취 정도는 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126는, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126은 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화 등의 용도뿐만 아니라 상기 기술한 병원균의 항균을 위한 용도 및 항염 용도로 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126은 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 배양물 또는 발효물이거나, 상기 균주를 유기용매로 추출한 추출물, 상기 균주의 세포막을 용해시키거나 패쇄 또는 균질화 처리한 용해물(또는 파쇄물) 등의 형태로 제제화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 처리한 결과, 7.3 mm 이상의 생육 억제환을 형성함을 확인하였다. 이에 따라 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주가 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 활성을 나타내고 동시에 이들 균주와 관련된 염증 질환에 대해 효과를 나타냄을 알 수 있다.
본 발명에 있어서, "대장균(Escherichia coli)"은 당업계에서 일반적으로 식중독, 장염 및 패혈증을 유발하는 것으로 알려진 균주를 의미한다. 대장균은 한국 공개특허 제10-2016-0135775호에 따르면 식중독을 일으키고, 한국 등록특허 제10-2204327호에 따르면 패혈증을 일으키며, 한국 공개특허 제10-2002-0032890호에 따르면 장염을 일으키는 것으로 보고된다.
본 발명에 있어서, “살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)”은 사람에게 가장 빈번한 감염을 일으키는 살모넬라 균주로 알려져 있으며, 가금에서뿐만 아니라, 사람에게 감염하여 식중독을 일으킬 수 있는 인수공통 감염 균으로 알려져 있다(한국 등록특허 제10-1151532호 참고). 또한, 살모넬라 균은 장염, 폐렴 및 패혈증의 질환을 일이키는 것으로도 알려져 있다(한국 공개특허 제10-2019-0079850호 참고).
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 제주산 방울 양배추 절임식품에서 유래한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항염용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적 조성물, 피부 외용제, 화장료 조성물, 식품 조성물, 정장제 조성물, 유산균 스타터 및 사료 또는 사료 첨가제 조성물 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 방울 양배추로 제조된 절임식품에서 분리된 12균주의 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항균 활성 평가를 보여준다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 생육 억제환 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 생육 억제능이 45% 이상을 나타냄을 보여준다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 농도별로 처리했을 때 프로피오니박테리움 아크네스의 생장곡선을 보여준다.
도 5는 본 발명에 따라 방울 양배추로 제조된 절임식품에서 분리된 12균주의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균 활성 평가를 보여준다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 생육 억제환 결과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 생육 억제능이 35% 이상을 나타냄을 보여준다.
도 8은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 사균체를 처리한 경우 NO 생성량이 억제되는 것을 보여준다.
도 9는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 처리한 결과, 생육 억제환을 형성함을 확인한 결과를 보여준다. 이에 따라 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주가 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 활성을 나타내고 동시에 이들 균주와 관련된 염증 질환에 대해 효과를 나타냄을 알 수 있다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 생육 억제환 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 생육 억제능이 45% 이상을 나타냄을 보여준다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 농도별로 처리했을 때 프로피오니박테리움 아크네스의 생장곡선을 보여준다.
도 5는 본 발명에 따라 방울 양배추로 제조된 절임식품에서 분리된 12균주의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균 활성 평가를 보여준다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 생육 억제환 결과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 생육 억제능이 35% 이상을 나타냄을 보여준다.
도 8은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 사균체를 처리한 경우 NO 생성량이 억제되는 것을 보여준다.
도 9는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 처리한 결과, 생육 억제환을 형성함을 확인한 결과를 보여준다. 이에 따라 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주가 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 활성을 나타내고 동시에 이들 균주와 관련된 염증 질환에 대해 효과를 나타냄을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1:
락토바실러스
플란타룸
WiKim0126의
동정
종균 발굴을 위해 제주산 방울 양배추로 절임식품을 제조하였다. 제조된 절임식품의 발효 시간별 절임식품 종균을 분리하였다.
이를 위해 제주산 방울 양배추로 제조된 절임식품의 발효 시간별 절임식품 파쇄액을 제조하고 이를 희석하여 MRS agar에 배양 후 genomic DNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 template로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', forward), 1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3', reverse) 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다.
PCR 조건은 denaturation 95℃ 1분, annealing 45℃ 1분, extension 72℃ 1분 30초로 30 사이클을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 서열 분석을 진행하였다. 16S rRNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 이용하여 분석하고 절임식품으로부터 12균주를 분리 동정하였다.
실시예
2:
락토바실러스
플란타룸
WiKim0126의
항균 또는 항염 활성 확인
-피부 염증 질환 유발 균주 Propionibacterium acnes 에 대한 항균 활성 평가
피부 염증 질환 유발 균주인 Propionibacterium acnes에 대한 항균 활성 평가를 위해 생육 억제환을 측정하였다.
P. acnes를 37℃에서 48시간 배양하고 0.5 McFarland 표준 탁도 농도(1×108 CFU/mL)가 되도록 현탁시켜 stock culture로 사용한다. 1×107 CFU/mL 농도가 되도록 RCM 배지로 10배 희석하고 0.1 mL 분주하여 일회용 spreader로 균일하게 도말하였다.
평판 배지 표면에 각 유산균을 10 μL씩 분주하여 건조한 후 anaerobic jar (anaerojar, Oxoid Ltd)에서 anerobic gas kit (AnaerobegenTM 2.5L, Oxoid)를 이용하여 37℃에서 48시간 혐기 배양하고, 배양 후 각 clear zone (mm)의 직경을 측정하여 항균활성을 평가하였다.
상기 실시예 1에서 분리한 유산균 12균주의 상등액을 10배 농축하여 10 μL씩 항균활성 평가에 사용하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 처리한 경우 10 ㎜ 이상의 생육 억제환을 형성하여 높은 생육 억제활성을 보임을 확인하였다(도 1 및 2).
-피부 염증 질환 유발 균주 Propionibacterium acnes 에 대한 생육 억제능 평가
트러블 유발 균주 P. acnes에 대한 생육 저해능을 평가하였다.
96 well microplate를 사용하여 각 well 당 200 μL를 총량으로 하여 10% 농도로 유산균 상등액을 혼합하여 48시간 배양하고 P. acnes의 생존율을 확인하였다.
유산균 상등액을 배합하지 않은 군을 control로 사용하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주의 상등액을 10%로 처리한 경우 control 대비 54.6%의 생존율을 보임을 확인하였다(도 3).
이후, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주의 상등액 처리구에 대한 생장 profile을 분석하였다.
96 well microplate를 사용하여 각 well 당 200 μL를 총량으로 하여 0%, 10%, 25%의 유산균 상등액을 혼합하여 37℃에서 배양하고 흡광도(OD600)를 측정하여 P. acnes의 생장을 확인하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주의 상등액을 10% 농도로 처리한 경우 45%의 생육 억제능을 보이고, 25% 농도로 상등액을 처리한 경우 100%의 생육 억제능을 보임을 확인하였다(도 4).
-피부 염증 질환 유발 균주 Staphylococcus aureus 에 대한 항균활성 평가
Staphylococcus aureus에 대한 항균활성 평가를 위해 생육 억제환을 측정하였다.
S. aureus를 37℃에서 24시간 배양하고 0.5 McFarland 표준 탁도 농도(1×108 CFU/mL)가 되도록 현탁시켜서 stock culture로 사용하였다. 1×107 CFU/mL 농도가 되도록 배지로 10배 희석하고 0.1 mL 분주하여 일회용 spreader로 균일하게 도말하였다. 평판 배지 표면에 각 유산균을 10 μL씩 분주하고 건조한 후 37℃에서 24시간 배양하고, 배양 후 각 clear zone (mm)의 직경을 측정하여 항균 활성을 평가하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주의 상등액을 처리한 경우 7 ㎜ 이상의 생육 억제환을 형성해 생육 억제활성을 보임을 확인하였다(도 5 및 6).
-피부 염증 질환 유발 균주 Staphylococcus aureus 에 대한 생육 억제능 평가
균주 S. aureus에 대한 생장저해능을 평가하였다.
96 well microplate를 사용하여 각 well 당 200μL를 총량으로 하여 10% 농도로 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 혼합하여 48시간 배양하고 S. aureus의 생장을 확인하였다.
락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액을 배합하지 않은 군을 control로 사용하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126의 상등액을 10%로 처리한 경우 control 대비 63.1%의 생존율을 보임을 확인하였다(도 7).
-락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 사균체 제조
락토바실러스 플란타룸 WiKim0126의 소재 활용을 위해 소재 활용을 위해 사균체 및 배양액(발효물)을 제조하였다.
사균체는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126을 30℃에서 24시간 배양하여 수득한 세포를 121℃에서 15 psi의 가압증기로 15분간 처리하여 제조하였다. 배양액은 원심분리를 통해 상등액만을 수득하여 제조하였다.
각 발효물 및 사균체는 동결건조하여 보존하고 농도별로 사용하였다.
-항염 활성 평가
RAW 264.7 세포를 96 well에 분주하여 2시간 배양한 후, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 상등액 및 사균체를 각각 처리하고 1시간 후, 염증 유발 물질인 LPS (Lipopolysaccharide) 1μg/mL을 처리하여 배양하였다.
이후, 세포배양 상등액을 회수하여, 그리스 시약(griess reagent)을 이용하여 NO 생성량을 측정하였다.
즉, 세포배양 상등액에 설파닐아미드(sulfanilamide) 용액을 넣고, 상온에서 10분간 반응시킨 후, NED(N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride) 용액을 넣고, 상온에서 10분간 반응하여 흡광도(520 nm)를 측정하였다.
NO 생성량은 아질산나트륨(sodium nitrite)을 표준물질로 사용하여 검량선을 작성하였고, 이에 대입하여 NO 생성량을 계산하여 나타내었다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 사균체를 0.1 mg/mL 농도로 처리한 경우 positive control 대비 28% 이상의 억제효과를 나타냄을 확인하였다(도 8).
-대장균 및 살모넬라 타이피뮤리움에 대한 생육 억제 활성
상기 제조된 본원발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126의 상등액을 10배 농축하여 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 처리한 결과, 상기 도 9와 같이 7.3 mm 이상의 생육 억제환을 형성함을 확인하였다(도 9).
이에 따라 본원발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주가 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 활성을 나타내고 동시에 이들 균주와 관련된 염증 질환에 대해 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실시예
3: 선별된
락토바실러스
플란타룸
WiKim0126의
생화학적 특성 분석
-
락토바실러스
플란타룸
WiKim0126의
특성 분석
본 연구를 통해 확보한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126에 대한 형태적, 생화학적 특성을 분석하였다.
분리 균주의 형태 관찰은 24시간 배양하고 crystal violet으로 그람염색한 후 광학현미경을 통해 형태 관찰을 진행하였다. 배양 특성을 분석하기 위해 Aerobic 및 anaerobic 조건에서 배양하여 생장 유무를 확인하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126은 rod 형태의 그람양성 균주임을 확인하였다. 또한, 산소 유무와 관계없이 증식하는 통성혐기성균임을 확인하였다(표 1).
| 균주 | 형태 | 그람 염색 (+/-) | 호기성/혐기성 |
| WiKim0126 | 간균(Rod) | + | +/+ |
-유전학적 동정
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126 균주의 16S rRNA 유전자 분석을 통한 유전학적 동정을 진행하였다.
분석 결과, 99% 이상의 상동성을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주로 확인되었다(표 2). 즉, 서열번호: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
이에, 본 발명의 미생물을 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126)으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2020년 10월 15일자로 기탁하였다(KFCC11872P).
| 균주 | 동정(Identification) | 상동성(%) | 수탁번호 |
| WiKim0126 | Lactobacillus plantarum | 99 | KFCC11872P |
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE
<120> LACTOBACILLUS PLANTARUM WIKIM126 STRAIN DERIVED FROM JEJU PICKLED
BRUSSELS SPROUT FOOD AND METHOD FOR PREPARING COMPOSITION USING
SAME
<130> P20E10C1889
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1524
<212> RNA
<213> Lactobacillus plantarum
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(1524)
<223> Lactobacillus plantarum WiKim126
<400> 1
gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgaactct ggtattgatt ggtgcttgca 60
tcatgattta catttgagtg agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa acctgcccag 120
aagcggggga taacacctgg aaacagatgc taataccgca taacaacttg gaccgcatgg 180
tccgagcttg aaagatggct tcggctatca cttttggatg gtcccgcggc gtattagcta 240
gatggtgggg taacggctca ccatggcaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg 300
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta 420
aaactctgtt gttaaagaag aacatatctg agagtaactg ttcaggtatt gacggtattt 480
aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540
ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag 600
ccttcggctc aaccgaagaa gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca 660
gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag 720
gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta 780
gataccctgg tagtccatac cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct 840
tcagtgctgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa 900
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta 960
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc taagagatta gacgttccct 1020
tcggggacat ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct 1140
ggtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200
ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg aactcgcgag 1260
agtaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat 1320
gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc caaagtcggt ggggtaacct 1440
tttaggaacc agccgcctaa ggtgggacag atgattaggg tgaagtcgta acaaggtagc 1500
cgtaggagaa cctgcggctg gatc 1524
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F Primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> Forward Primer
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1492R Primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<223> Reverse Primer
<400> 3
ggctaccttg ttacgactt 19
Claims (10)
- 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균에 의한 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 염증 질환은 식중독, 장염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균에 대한 항균용 약학 조성물.
- 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균에 의한 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제.
- 제4항에 있어서,
상기 외용제는 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 제형인 피부 외용제. - 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균에 대한 피부 항균용 화장료 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 앰플, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션, 비누 또는 세정제의 제형인 피부 항균용 화장료 조성물. - 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균에 대한 피부 항염용 화장료 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 앰플, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션, 비누 또는 세정제의 제형인 피부 항염용 화장료 조성물. - 락토바실러스 플란타룸 WiKim0126(Lactobacillus plantarum WiKim0126; 수탁번호 KFCC11872P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균에 대한 항균용 식품 조성물.
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Citations (3)
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| KR20190056177A (ko) * | 2017-11-16 | 2019-05-24 | 씨제이제일제당 (주) | 락토바실러스 플란타룸 배양물을 포함하는 항균용 화장료 조성물 |
| KR102254751B1 (ko) * | 2020-01-09 | 2021-05-24 | 한국식품연구원 | 신규의 락토바실러스 플란타럼 WiKim83 균주 및 이의 용도 |
-
2021
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