KR101936620B1 - 발효공법을 이용한 아로니아 함유 기능성 복합 사료첨가제의 제조방법. - Google Patents

발효공법을 이용한 아로니아 함유 기능성 복합 사료첨가제의 제조방법. Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효공법을 이용한 아로니아 함유 기능성 복합 사료첨가제의 제조방법에 관한 것으로서, 아로니아 원료에 균주를 접종하여 제조한 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 아로니아 발효물과 아미노레불린산을 포함함으로써 사육동물의 면역력 증진과 생산성을 증대시킬 수 있는 효과를 나타낸다.

Description

발효공법을 이용한 아로니아 함유 기능성 복합 사료첨가제의 제조방법.{Manufacturing Method of Feed Additives Comprising Aronia melanocarpa}
본 발명은 발효공법을 이용한 아로니아 함유 기능성 복합 사료첨가제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아로니아의 발효물을 포함하여 사육동물의 면역력 증진과 생산성을 높일 수 있는 사료첨가제의 제조방법에 관한 것이다.
가축, 어패류와 같이 사육을 통해 상품화 할 수 있는 사육동물을 기르기 위해 사용되는 사료의 소화와 영양성분 공급의 향상을 위하여 다양한 사료첨가제가 사용되고 있다. 기존의 항생제를 대신하여 미생물이 생산한 효소를 이용한 효소제나 유해 미생물에 대한 저항성 증진을 통해 가축의 생산성을 증진시키고자 하는 생균제가 사료첨가제로 널리 사용되고 있다.
상기 효소제는 생체 내에서 전분이나 단백질, 셀룰로오스 등의 분해 촉진으로 영양소의 흡수를 좋게 해주어 영양 이용률을 높여 주며, 생균제는 유해 미생물에 대한 저항성을 높여줌으로써 통한 가축의 생산성을 증진시키는 젖산균으로, 성장 촉진과 질병예방 및 소화율 증진 효과를 기대할 수 있다.
최근에는 환경보호와 안전한 식품이 새로운 패러다임으로 정착되면서 국내의 축산농가에서도 환경의 질을 개선하고, 경쟁력을 갖추기 위하여 항생제에 의존한 사육방법에서 벗어난 보다 안전한 사육을 위하여 생균제에 대한 수요가 증가하고 있다. 따라서 병원성 미생물에 대하여 경쟁적 배제효과를 발현하고 대사산물에 의한 억압작용으로 가축의 항병성을 강화시켜주는 생균제(미생물제제)를 이용하여 화학약품인 항생제의 사용량을 최소화하고 가축의 성장능력을 향상시키려는 다양한 연구가 진행되고 있다.
사료첨가제로 사용할 수 있는 생균제로는 엔테로코커스 훼시엄, 엔테로코커스 훼카리스, 클로스트리듐 브티리컴, 바실러스 코아글란스, 바실러스 서브틸리스, 비피도박테리움 서모필럼, 비피도박테리움 슈도롱검, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 프란타럼, 페디오코커스애 시디락티시, 락토바실러스 루테리, 바실러스 세레우스 등을 들 수 있으며, 아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 오리제와 같은 유익 곰팡이균이나 맥주효모, 토룰라효모, 제빵효모, 양조효모, 조사건조효모, 효모배양물 등의 효모제도 사료첨가제로 사용되고 있다.
한편, 천연유래의 사료첨가제로서 아로니아가 주목받고 있는데, 대한민국 공개특허공보 10-2016-0070393호에서는 아로니아 열매에 루코노스톡(Leuconostoc) 균주를 접종하여 발효시킨 발효물을 사료첨가제로 적용함으로써 가축의 면역력을 증진시키는 효과를 얻고 있으며, 대한민국 공개특허공보 10-2017-0128010호에서는 아로니아 가지, 잎 또는 이의 혼합물을 주정에 첨가하여 아로니아 발효물을 제조하여 사료첨가제로 이용함으로써 생육촉진과 육질개선의 효과를 얻고 있다.
그러나 상기 선행기술에서는 아로니아의 열매나 잎, 가지 등을 이용하고 있을 뿐 아로니아 제품의 생산시 발생하는 추출박과 같은 폐기물을 재활용하여 사료첨가제로 이용하고자 하는 시도는 이루어지고 있지 않다.
대한민국 공개특허공보 10-2016-0070393호 대한민국 공개특허공보 10-2017-0128010호
본 발명은 상기와 같은 종래기술을 감안하여 안출된 것으로서, 아로니아 발효물과 아미노레불린산을 포함함으로써 사육동물의 면역력 증진과 생산성을 증가시킬 수 있는 사료첨가제의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 아로니아 제품의 생산 시 발생하는 부산물을 재활용함으로써 자원재활용 및 사료첨가제의 효율을 향상시키는 사료첨가제의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 사료첨가제의 제조방법은 발효공법을 이용하여 제조한 아로니아 발효물을 함유하는 기능성 복합 사료첨가제의 제조방법에 관한 것으로서, 아로니아 원료에 균주를 접종하여 제조한 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하는 단계에 있어서 부형제를 추가적으로 혼합할 수도 있다.
또한, 상기 아로니아 원료는 아로니아 추출박일 수 있다.
또한, 상기 아로니아 발효물은 아로니아 원료에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 락토바실러스 플라타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 중 어느 하나의 균주를 접종하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 사료첨가제의 제조방법은 아로니아 발효물과 아미노레불린산을 포함함으로써 사육동물의 면역력 증진과 생산성을 높일 수 있는 사료첨가제를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 아로니아 제품의 생산 시 발생하는 부산물을 재활용함으로써 자원재활용 및 사료첨가제의 효율을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 사료첨가제의 제조방법을 나타낸 공정도이다.
도 2는 아로니아 생과 및 아로니아 추출박에 대하여 선택균주 별로 혼합하여 발효한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 시험군 A 내지 D에 대한 Lysozyme 활성을 평가한 결과이다.
도 4는 시험군 A 내지 D에 대한 혈청 살해능을 평가한 결과이다.
도 5는 시험군 A 내지 D에 대한 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 평가한 결과이다.
도 6은 시험군 A 내지 D에 대한 탐식능(Phagocytic activity)의 측정 결과이다.
도 7은 시험군 A 내지 D의 Miamiensis avidus 감염에 대한 항병능 평가를 수행한 결과이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명에 따른 사료첨가제의 제조방법은 발효공법을 이용하여 아로니아 발효물을 제조하고, 이를 함유함으로써 기능성 복합 사료첨가제를 제조하는 방법이다. 상기 제조방법은 아로니아 원료에 균주를 접종하여 제조한 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하는 단계를 포함하며, 이를 구체적으로 설명하면, 도 1에서 도시된 바와 같이, 발효물 제조를 위한 균주를 배양하여 아로니아 원료에 접종함으로써 아로니아 발효물을 제조하고, 상기 아로니아 발효물과 아미노레불린산 배양액을 혼합하되 필요에 따라 부형제를 함께 혼합하고 고체발효 및 건조 공정을 거쳐 사료첨가제를 제조하게 된다.
상기 사료첨가제는 사육동물에게 급여하는 사료에 첨가되는 것으로서 상기 사육동물은 소, 돼지와 같이 농장에서 사육하는 가축뿐만 아니라, 어류, 갑각류, 폐각류 등의 양식장에서 사육하는 동물을 포괄하는 것으로 사육하여 상품화할 수 있는 동물을 모두 포함하는 것이다.
상기 아로니아 원료로는 대한민국 공개특허공보 10-2017-0128010호에서와 같이 아로니아 가지와 잎을 이용하거나, 대한민국 공개특허공보 10-2016-0070393호에서와 같이 아로니아 열매를 이용하기도 하는데, 본 발명에서는 상기 아로니아 원료로서 아로니아 추출박을 이용하고 있다.
상기 아로니아 추출박은 아로니아 생과를 착즙하고 남은 추출박으로서 통상적으로 폐기물로 처리되는 것인데, 이를 재활용하기 때문에 자원 재활용의 측면과 생산단가의 측면에서 종래의 아로니아를 원료로 하는 제조방법에 비해 효과적이라 할 수 있다. 특히, 실험적으로 아로니아 추출박은 배양에 따른 생균수 증가의 면에서 아로니아 생과에 비해 유리한 것으로 나타났다. 상기 아로니아 추출박은 당도 1brix 이상과 수분 80% 이하인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 이러한 조건에서 발효 효율이 최적화되는 것으로 나타났다.
상기 아로니아 추출박의 적절한 당도와 수분을 유지하기 위하여, 아로니아 추출박의 수분(함수율)은 착즙한 후의 추출박을 1일 이상 냉동보관 하여 수분 함량을 조절하는 방법으로 감소시킬 수 있으며, 자동수분측정기(Mettler Toledo)에 시료 5g을 정량하여 105℃에서 무게가 항량될 때까지 측정을 하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 당도는 아로니아 추출박 100g을 착즙하여 나온 액상시료를 당도계로 측정하여 관리한다.
아로니아 생과와 착즙을 하고 남은 추출박을 효모나 유산균 종류별로 생균수 증가 시험을 하여 적합한 균주 및 조건을 확인하였다.
아로니아 생과 및 아로니아 추출박에 대하여 표 1에서와 같이 선택균주 별로 혼합하여 37℃에서 24시간 발효하였다. 표 1에서 함량은 ㎏이다.
생과 5 5 5 5
추출박 5 5 5 5
효모배지 5 5
유산균배지 5 5 5 5 5 5
사카로마이세스 세레비지애 0.2 0.2
락토바실러스 플라타룸 0.2 0.2
락토바실러스 아시도필루스 0.2 0.2
페디오코쿠스 에시디락티시 0.2 0.2
37℃에서 24시간 발효에 의한 생균수 측정을 위하여 9㎖의 멸균주사용수에 시료 1g을 넣고 10진법 시험방법으로 희석하며 대한약전 미생물한도 시험법의 한천평판혼합법에 따라 시험하였다. 그 결과 아로니아 생과 및 추출박의 선택균주 혼합별 생균수 증가는 표 2 및 도 2와 같다. 표 2에서 단위는 CUF/g이다.
성분 배양액 아로니아생과 아로니아추출박
사카로마이세스 세레비지애 2.0×107 3.0×107 1.0×107
락토바실러스 플라타룸 2.0×109 2.0×107 2.0×108
락토바실러스 아시도필루스 4.0×109 6.0×108 3.0×108
페디오코쿠스 에시디락티시 2.0×109 2.0×108 3.0×108
표 2의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 사용하여도 생균수 증가가 나타나 원료로서 사용할 수 있는 것으로 나타났으며, 특히, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 사용하였을 때 가장 우수한 것으로 나타났다.
다음으로 상기와 같이 균주를 이용하여 발효함으로써 얻어진 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하는 단계를 통해 사료 첨가제를 제조하게 된다.
상기 아미노레불린산 배양액을 seed를 배양하여 얻을 수 있는데, 일 실시예에서 숙신산 10 중량부, 글라이신 5 중량부, 효모 추출물 10 중량부, 펩톤 5 중량부, Pot. phos. dibasic 10 중량부, Ampicillin Sod. 0.005 중량부를 혼합한 용액의 pH를 pH를 6.5로 조절하고 멸균 후 종균을 2~5%(V/V) 접종하고 pH를 6.5로 유지하면서 35℃에서 24~48시간 배양함으로써 배양액을 제조할 수 있다.
상기 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하면 사료 첨가제를 제조할 수 있는데, 고형제제로 제조하기 위하여 부형제를 첨가하여 혼합할 수도 있다. 상기 부형제로는 유당, 전분, 당밀, 단백피, 옥수수 전분, 결정 셀룰로오스, 분당, 과립당, 만니톨, 경질 무수 규산, L-시스테인, 석분 중 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 적용할 수 있으며, 사료첨가제 전체에 대하여 60 내지 90 중량%의 범위에서 적절히 사용할 수 있다.
또한, 아미노레불린산 배양액은 사료첨가제 전체에 대하여 5 내지 10 중량%의 범위에서 혼합되는데, 아미노레불린산 배양액의 함량이 지나치게 적으면 아로니아 발효물과의 병용에 따른 향상된 효과를 얻을 수 없으며, 너무 많아도 오히려 효과가 감소되며 경제성이 떨어지는 것으로 나타나 상기 범위에서 사용하는 것이 바람직하다.
상기 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액에 부형제를 혼합하는 경우, 혼합을 끝내고 30 내지 40℃에서 24 내지 72시간 동안 고체 발효시키고 40 내지 60℃에서 36 내지 96시간 동안 건조하여 고형제제인 사료첨가제를 제조할 수 있게 된다.
상기 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하여 제조되는 사료첨가제의 효과를 확인하기 위하여 락토바실러스 아시도필루스 균주를 사용하여 아로니아 추출박을 발효하여 제조한 아로니아 발효물을 표 3에서와 같은 비율로 아미노레불린산 배양액과 혼합하여 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 시 상기 부형제로 단백피, 당밀, 석분을 추가적으로 첨가하였으며, 혼합 후 35℃에서 48시간 동안 고체 발효한 후 60℃에서 72시간 동안 건조하여 사료첨가제를 얻었다. 표 3에서 단위는 중량%이다.
성분 실시예1 실시예2 실시예3
아로니아 발효물 8.7 16.7 24.0
아미노레불린산 배양액 8.7 8.3 8.0
단백피 76.0 68.5 61.8
당밀 2.3 2.3 2.2
석분 4.3 4.2 4.0
아로니아 발효물의 함량을 달리한 실시예 1 내지 3에 대하여 단미사료협회에 조단백질, 조지방, 조회분, 수분 등을 분석의뢰하였다. 또한, 비교를 위하여 사카로마이세스 세레비지애 균주로 발효한 아로니아 발효물을 표 3에서와 같은 조성으로 제조하여(실시예 4 내지 6) 성분을 분석하였다. 그 결과는 표 4와 같다.
성분 조단백질(%) 조섬유(%)
아로니아 추출박 2.54 5.41
실시예1 18.02 9.35
실시예2 17.07 8.12
실시예3 14.84 7.02
실시예4 18.00 8.32
실시예5 17.17 7.74
실시예6 14.42 7.19
표 4의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 단독으로 사용했을 때에 비해 본 발명의 사료첨가제는 모두 조단백질 및 조섬유의 양이 대폭 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 실시예 1 및 실시예 4에서 조단백질이 가장 우수한 것으로 나타났는데, 아로니아 발효물이 8.7 중량%인 경우 지나치게 많은 시료보다 조단백질 함량이 더 많은 것으로 나타났다. 또한, 락토바실러스 아시도필루스 균주로 발효한 아로니아 발효물과 사카로마이세스 세레비지애 균주로 발효한 아로니아 발효물의 조단백질과 조섬유의 성분 차이에는 큰 차이가 없는 것으로 나타나 상기 균주들에서 따라 본 발명에서 목적하는 아로니아 발효물을 얻을 수 있는 것을 확인하였다.
항산화 성분 분석을 위한 총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin-Ciocalteus’reagent가 알칼리 조건에서 발효물 열수 및 주정 추출물 시료의 폴리페놀 화합물에 의해 환원되면 청색에서 노란색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하였다. 발효물의 추출물 시료 100 ㎕에 알칼리 조건을 형성하기 위해 2% Na2CO3을 2 ㎖를 가한 후 3분간 반응시키고 50%의 Folin-Ciocalteu’s 시약 100 ㎕를 첨가해 30분간 반응된 색을 750 ㎚에서 측정함으로써 주요한 항산화 성분인 총 폴리페놀 함량을 확인하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하여 표준곡선을 작성한 후 발효물 용매 추출물 시료 100 ㎍에 대한 gallic acid 상당량(GAE) ㎍으로 나타내었다.
또한, 총 플라보노이드 함량측정은 플라보노이드에 알칼리를 반응시키면 플라반 또는 플라보놀 배당체가 황색을 나타내는 것을 원리로 하여 측정하였다. 80% 에탄올을 사용해 적당히 희석한 발효물의 추출물 시료 500 ㎕에 10% aluminium nitrate 100 ㎕와 1 M potassium acetate 100 ㎕를 가한 후 암소에서 40분간 방치하고 변한 흡광도 값을 415 ㎚에서 측정하여 발효물 용매 추출물 시료 100 ㎍에 대한 표준물질인 quercetin 상당량(QE) ㎍으로 나타내었다.
항산화 활성 시험을 위하여 발효물 용매추출물에 따른 DPPH 및 ABTS의 색이 옅어지는 정도를 측정하였다. DPPH 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 0.2 mM DPPH 라디칼 용액에 발효물의 추출물 시료 50 ㎕를 가한 후 상온에서 60분간 반응시켜 반응액의 흡광도 변화를 517 ㎚에서 측정하여 발효물 용매 추출물 시료 100 ㎍에 대한 표준물질인 ascorbic acid의 상당량(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity/AEAC) ㎍으로 나타내었다.
ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM potassium persulphate 용액을 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색 ABTS 라디칼을 형성시킨 다음 734 ㎚에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 희석해 사용하였다. 상기 용액에 발효물의 추출물 시료 50 ㎕를 가한 후 상온에서 60분 방치시켜 반응액의 흡광도 값의 변화를 측정하고 발효물 용매 추출물 시료 100 ㎍에 대한 AEAC ㎍으로 나타내었다.
또한, 마크로파지 자극활성을 확인하기 위하여, 2 ㎖의 thioglycollate medium을 복강주사하여 48~72시간 동안 마크로파지 염증반응을 유도시킨 ICR 마우스의 복강에서 마크로파지를 회수하고 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에 1×106 cell/㎖의 농도로 현탁하였다. 상기 마크로파지 현탁액은 96 well plate에 200 ㎕씩 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하여 monolayer를 형성시킨 후, non-adherent cell은 3회 세척으로 제거하고 새로운 10% FBS-함유 RPMI-1640 배지 180 ㎕와 적당 농도로 희석된 시료 20 ㎕를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 재배양시켰다. 발효물 용매추출물 시료의 마크로파지에 대한 독성활성은 24시간 배양된 마크로파지에 CCK-8 kit 용액 20 ㎕를 첨가하여 4시간 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 시료가 첨가되지 않은 음성대조군(시료를 함유하지 않은 saline에 마크로파지를 배양한 군)에 대한 세포의 생존율(%)로 나타내었다.
또한, 시료와 마크로파지의 배양을 통해 얻어진 배양 상등액에 마크로파지 활성화에 따라 생산되는 사이토카인인 tumor-necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-6 및 IL-12의 생산정도를 ELISA kit로 측정하였다.
또한, 활성화된 마크로파지로부터 생산되는 nitric oxide(NO)는 Griess reagent (sulfanilamide+N-ethylene diamide dihydrochloride) 100 ㎕와 함께 10분 동안 실온에서 반응시킨 후 흡광도 변화를 492 ㎚에서 측정하여 표준물질인 sodium nitrite(NaNO2)에 대비한 μM로 측정하여 발효물 용매추출물 시료에 따른 마크로파지 자극정도를 검토하였다.
열수추출물 당도(Brix, 용해성분량)를 측정하기 위하여 전제에 의한 열수추출 후 여과 및 원심분리를 통해 얻은 추출액을 농축하기 전에 수용성 물질 굴절율을 이용한 당도계(Atago)를 이용하여 발효물 열수추출물의 당도(Brix, 용해성분량)를 측정하였다. 그 결과는 표 5와 같다.
아로니아 추출박 당도(Brix) 아로니아 생과 당도(Brix)
비발효 1.0 비발효 1.0
락토바실러스 아시도필루스 0.9 락토바실러스 아시도필루스 1.6
락토바실러스 플라타룸 1.0 락토바실러스 플라타룸 0.6
페디오코쿠스 에시디락티시 1.4 페디오코쿠스 에시디락티시 1.7
사카로마이세스 세레비지애 1.1 사카로마이세스 세레비지애 0.9
그 결과를 살펴보면, 열수 추출물은 20배의 증류수를 첨가하여 전제 추출한 경우 균주와 무관하게 2일간 발효시켰을 때 표준관리 기준으로 설정하고 있는 1 Brix 수준을 나타내고 있었다. 그러나 생과 발효물은 그 편차가 아로니아 추출박 발효물에 비하여 커서 표준관리가 용이하지 않은 것으로 나타났다. 이는 생과의 경우 배양조건마다 다를 수 있지만 아로니아 추출박은 착즙 후 일정 고형분 함량으로 농축된 부산물 원료이기 때문에 원료로서의 표준관리가 훨씬 용이할 수 있음을 나타내는 결과이다.
또한, 주정 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과는 표 6과 같다. 표 6에서 총 폴리페놀 함량의 단위는 ㎍ GAE/100㎍이다.
아로니아 추출박 총 폴리페놀 아로니아 생과 총 폴리페놀
비발효 6.18±0.36 비발효 3.29±0.35
락토바실러스 아시도필루스 3.23±0.27 락토바실러스 아시도필루스 1.93±0.39
락토바실러스 플라타룸 3.44±0.55 락토바실러스 플라타룸 2.08±0.22
페디오코쿠스 에시디락티시 3.43±0.41 페디오코쿠스 에시디락티시 2.05±0.23
사카로마이세스 세레비지애 5.78±0.37 사카로마이세스 세레비지애 3.14±0.35
표 6의 결과를 살펴보면, 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 아로니아 추출박 및 생과가 총 폴리페놀 함량이 높게 나타났고, 비발효 아로니아 추출박 대조군과 유사한 함량을 나타내었다. 발효물은 아로니아 추출박이 50%만 함유되어 있다는 점을 고려할 때 이러한 결과는 발효를 통하여 항산화 활성성분이 증진된 것을 시사하는 결과이다.
또한, 열수 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과는 표 7과 같다. 표 7에서 총 폴리페놀 함량의 단위는 ㎍ GAE/100㎍이다.
아로니아 추출박 총 폴리페놀 아로니아 생과 총 폴리페놀
비발효 5.96±0.15 비발효 4.46±0.25
락토바실러스 아시도필루스 3.88±0.25 락토바실러스 아시도필루스 2.38±0.07
락토바실러스 플라타룸 3.36±0.33 락토바실러스 플라타룸 2.03±0.03
페디오코쿠스 에시디락티시 3.24±0.06 페디오코쿠스 에시디락티시 2.37±0.02
사카로마이세스 세레비지애 6.61±0.04 사카로마이세스 세레비지애 3.87±0.09
표 7의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 아로니아 추출박 및 생과의 발효물이 다른 발효물보다 총 폴리페놀 함량이 높으며, 주정 추출물보다도 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내는 것을 알 수 있다.또한, 비발효 아로니아 추출박과 비교하여도 11%의 총 폴리페놀 함량의 증진효과를 나타냄으로써 아로니아 추출박이 50% 함유된 원료의 특성까지 고려한다면 열수 추출물에서 발효를 통한 뚜렷한 증진효과를 보이는 것으로 추정된다.
또한, 주정 추출물에 대한 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 표 8과 같다. 표 8에서 총 플라보노이드 함량의 단위는 ㎍ GAE/100㎍이다.
아로니아 추출박 총플라보노이드 아로니아 생과 총플라보노이드
비발효 1.18±0.04 비발효 0.55±0.01
락토바실러스 아시도필루스 0.53±0.00 락토바실러스 아시도필루스 0.22±0.00
락토바실러스 플라타룸 0.59±0.00 락토바실러스 플라타룸 0.32±0.07
페디오코쿠스 에시디락티시 0.62±0.00 페디오코쿠스 에시디락티시 0.25±0.01
사카로마이세스 세레비지애 1.12±0.01 사카로마이세스 세레비지애 0.36±0.00
표 8의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 경우, 다른 발효물보다 총 플라보노이드 함량이 더 높은 것으로 나타났으며, 비발효 아로니아 추출박과 유사한 함량을 나타내었다. 발효물이 50% 아로니아 추출박에 50% 미생물을 접종하여 발효한 것이므로 발효를 통하여 총 플라보노이드 함량이 증진된 것으로 추정되나 생과 발효물의 경우에는 모든 미생물 발효물에서 비발효 대조군보다 현저히 낮은 함량을 나타내었다.
또한, 열수 추출물에 대한 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 표 9와 같다. 표 9에서 총 플라보노이드 함량의 단위는 ㎍ GAE/100㎍이다.
아로니아 추출박 총플라보노이드 아로니아 생과 총플라보노이드
비발효 0.98±0.08 비발효 0.55±0.04
락토바실러스 아시도필루스 0.58±0.06 락토바실러스 아시도필루스 0.21±0.01
락토바실러스 플라타룸 0.45±0.01 락토바실러스 플라타룸 0.23±0.02
페디오코쿠스 에시디락티시 0.50±0.01 페디오코쿠스 에시디락티시 0.24±0.01
사카로마이세스 세레비지애 0.95±0.06 사카로마이세스 세레비지애 0.34±0.01
표 9의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 경우, 다른 발효물보다 더 높은 총 플라보노이드 함량을 나타내었으며, 비발효 아로니아 추출박과도 유사한 함량을 나타내었다. 이는 아로니아 추출박이 50% 함유된 원료의 특성을 고려할 때 열수 추출물에서도 발효를 통한 총 플라보노이드 함량의 증진되는 것을 시사하는 결과이다.
또한, 아로니아 추출박의 주정 추출물에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과는 표 10과 같다. 표 10에서 단위는 ㎍ AEAC/100 ㎍이다.
아로니아 추출박 라디칼소거능 아로니아 생과 라디칼소거능
비발효 32.69±0.31 비발효 15.95±0.26
락토바실러스 아시도필루스 9.80±0.03 락토바실러스 아시도필루스 11.26±0.06
락토바실러스 플라타룸 9.56±0.05 락토바실러스 플라타룸 11.31±0.06
페디오코쿠스 에시디락티시 9.41±0.01 페디오코쿠스 에시디락티시 11.32±0.03
사카로마이세스 세레비지애 32.61±0.20 사카로마이세스 세레비지애 9.60±0.02
표 10의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 경우, 다른 발효물보다 높은 라디칼 소거능을 나타내었고, 비발효 아로니아 추출박과 유사한 값을 나타내었다. 그러나 아로니아 생과로부터 얻은 발효물의 주정 추출물은 비발효 대조군인 생과의 주정 추출물보다 현저히 낮은 ABTS 라디칼 소거능 수준을 나타내었다.
또한, 아로니아 추출박의 열수 추출물에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과는 표 11과 같다. 표 11에서 단위는 ㎍ AEAC/100 ㎍이다.
아로니아 추출박 라디칼소거능 아로니아 생과 라디칼소거능
비발효 12.98±0.05 비발효 9.69±0.11
락토바실러스 아시도필루스 7.37±0.35 락토바실러스 아시도필루스 4.25±0.18
락토바실러스 플라타룸 6.68±0.30 락토바실러스 플라타룸 3.82±0.07
페디오코쿠스 에시디락티시 7.29±0.00 페디오코쿠스 에시디락티시 4.51±0.01
사카로마이세스 세레비지애 13.40±0.34 사카로마이세스 세레비지애 8.19±0.12
표 11의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 경우, 다른 발효물보다 높은 라디칼 소거능을 나타내었으나, 주정 추출물의 라디칼 소거능보다는 낮은 수준을 유지하였는데 이는 추출용매(주정과 열수)의 극성에 기인하는 추출성분의 차이에 따른 것으로 보이며 주정에서 항산화 활성에 관여하는 저분자 성분의 추출이 증가한 것으로 보인다.
또한, 주정 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 표 12와 같다. 표 12에서 단위는 ㎍ AEAC/100 ㎍이다.
아로니아 추출박 라디칼소거능 아로니아 생과 라디칼소거능
비발효 9.14±0.15 비발효 7.32±0.18
락토바실러스 아시도필루스 5.97±0.31 락토바실러스 아시도필루스 2.65±0.11
락토바실러스 플라타룸 5.24±0.04 락토바실러스 플라타룸 2.63±0.02
페디오코쿠스 에시디락티시 4.88±0.21 페디오코쿠스 에시디락티시 2.42±0.07
사카로마이세스 세레비지애 9.49±0.04 사카로마이세스 세레비지애 4.69±0.08
표 12의 결과를 살펴보면, 아로니아 추출박을 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 경우 다른 발효물보다 우수한 라디칼 소거능을 나타낼 뿐만 아니라 비발효 아로니아 추출박과 비교해도 4%의 증진 효과를 나타내었다. 그러나 아로니아 생과를 이용하여 배양된 생과 발효물은 모든 군에서 비발효 생과 대조군보다 현저히 낮은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다.
또한, 열수 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 표 13과 같다. 표 13에서 단위는 ㎍ AEAC/100 ㎍이다.
아로니아 추출박 라디칼소거능 아로니아 생과 라디칼소거능
비발효 9.83±0.57 비발효 9.56±0.14
락토바실러스 아시도필루스 4.56±0.27 락토바실러스 아시도필루스 3.88±0.24
락토바실러스 플라타룸 5.42±0.86 락토바실러스 플라타룸 3.33±0.23
페디오코쿠스 에시디락티시 4.90±0.25 페디오코쿠스 에시디락티시 3.84±0.30
사카로마이세스 세레비지애 9.80±0.43 사카로마이세스 세레비지애 4.86±0.27
표 13의 결과로부터, 아로니아 추출박을 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 경우 다른 발효물보다 우수한 라디칼 소거능을 나타내었으나, 아로니아 생과의 발효물은 비발효 생과 대조군보다 현저히 낮은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 사료첨가제를 급여했을 때 사육동물의 생장에 미치는 효과를 확인하기 위하여 넙치 사육 시 상기 사료첨가제를 적용하는 시험을 실시하였다. 시험은 일반성장 시험과 유효성 시험으로 나누어 실시하였으며, 일반성장 시험은 개시 및 최종 체중 변화, 사료계수 (FCR; feed-conversion ratio)를 측정하였고, 유효성 시험은 비특이적 면역지표 평가, Lysozyme 활성능, 혈청 살해능, ROI 생성능, 식세포의 탐식능, 항병력 효과 평가, 세균성 질병 (Streptococcus iniae)에 대한 항병력 시험, 원충성 질병 (Miamiensis avidus)에 대한 항병력 시험을 실시하였다.
시험용 넙치로 전남 고흥지역에서 27 g 전·후의 건강한 넙치를 입수하여 차광된 실험실내에서 여과순환수조에 수용하여 시험하였다. 수온을 23±3℃에서 지속적 폭기 하에서 자발적 급이가 가능한 기간까지 순치하였다. 순치기간 중 배합사료를 체중의 3% 정도의 급이율에 적응되도록 오전 9시와 오후 6시로 하루에 두 번 분할하여 공급하였다.
시험물질은 정해진 농도로 배합사료에 흡착시키고 건조시킨 후 냉장보관하면서 시험하였다. 성장단계와 섭이활동에 따라 적절한 급이량을 정하여 넙치 체중의 3-4%의 범위에서 매일 오전과 오후 2회로 나누어 공급하였다. 넙치에게 시험용 물질을 함유한 사료를 28일간 매일 연속투여한 후 시험 변수를 측정 및 병원성 생물을 넙치에 투여하고 일정기간 치사여부를 관찰하였다.
대조군 및 시험군 모두 각 3개의 수조 (350 ℓ, 1회/3일 절반 환수)에서 어체중이 유사하도록 군당 20마리씩 할당하여 시험에 사용하였다. 수온은 온풍기를 사용하여 23-25℃로 유지하였고 매일 수온을 확인하였다. 시험군으로는 일반사료를 급여한 대조군, 아로니아 0.1 중량%로 처리한 배합사료를 급여한 시험군 A, 아미노레불린산 배양액 0.1 중량%로 처리한 배합사료를 급여한 시험군 B, 아로니아 발효물 10 중량% 및 아미노레불린산 배양액 0.1 중량%를 포함하는 사료첨가제로 처리한 시험군 C, 아로니아 발효물 20 중량% 및 아미노레불린산 배양액 0.1 중량%를 포함하는 사료첨가제로 처리한 시험군 D의 4가지 시험군을 준비하였다.
성장에 미치는 사료첨가제의 영향의 평가하기 위하여 시험개시 시점과 종료시점에 체중을 측정하여 시험기간 동안 섭취한 사료량에 근거하여 체중증가율, 사료계수 (feed-conversion ratio) 및 증체율 (Weight gain)을 개략적으로 산출하였다.
사료첨가제가 비특이적 면역지표에 미치는 영향 평가하기 위하여 시험물질의 투여 종료 후 각 군별로 9 마리를 무작위로 포획해 비특이적 면역 지표를 측정하였다.
분석시료의 수집은 다음과 같이 이루어졌다. 넙치 혈청의 확보를 위해 MS-222로 마취 후 미부정맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액은 4℃에서 응고시킨 후 3,000 × g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 lysozyme 활성 및 혈청 살해능 분석에 사용하였다. 백혈구 분리를 위해 넙치를 개복하여 복막을 제거한 후 두신을 무균적으로 적출 (Secombe et al., 1990; Sheikhzadeh et al., 2012)하였다. 적출한 두신을 nylon mesh위에서 부드럽게 압착하여 백혈구를 유출하였고 Histopaque-1077 (Sigma)을 이용하여 2,500 × g에서 30분간 원심분리하였다. 그 후 분리된 buffy-coat 부근에서 백혈구만을 분리하였다. 분리된 백혈구는 혈구계산판을 이용하여 계수하였다. 백혈구의 세포 수는 1 x 106 cell/㎖로 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco)용액에 부유시켜 respiratory burst, phagocytosis활성 분석에 사용하였다.
또한, 혈청의 lysozyme 활성측정을 위해 96-well plate에 0.2 M phosphate buffer (pH 5.8)에 2 ㎎/㎖의 Micrococcus lysodeikticus (Sigma)를 부유시킨 용액을 well당 70 ㎕씩 넣고 혈청 30 ㎕를 첨가하여 25℃에서 반응시켰다. 반응개시 30초 후부터 4분 30초까지 감소하는 흡광도의 양을 Microplate reader로 405 ㎚에서 기록하였다. 이때 분당 0.001의 흡광도가 감소하는 양을 1 unit으로 표현하였다.
또한, 혈청의 항균효과평가를 위해 Aeromonas hydrophila 현탁액 (1 x 107 cells/㎖)을 96-well plate에 100㎕ 분주한 후 혈청 100㎕를 첨가하여 20℃에서 1시간 배양하였다. 이 후 혼합액을 PBS로 1:10 희석한 후 BHIA 배지에 Spreading하여 25℃에서 24시간 배양하여 colony를 계수하였다.
또한, 반응성 산소종(ROS) 생성능을 측정하기 위하여 넙치 두신에서 분리한 백혈구를 96-well plate에 200 ㎕ 씩 분주한 후 120 × g 에서 5분간 원심분리하였다. Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)으로 2회 washing한 후 phorbol myristate acetate (PMA)를 첨가 (1 ㎍/㎖) 하였다. 다시 nitroblue tetrazolium (NBT, 1 ㎎/㎖)를 well 당 100 ㎕씩 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 70% methanol로 고정하고 PBS로 2회 washing한 후 2 M KOH 120 ㎕와 dimethyl sulfoxide 를 첨가하였다. 첨가 후 Microplate reader로 620 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
또한, Phagocytic activity의 측정을 위하여 Phagocytosis 분석용 Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 이용하였다. 즉, 넙치 두신에서 분리한 백혈구 (5 x 105 cell/㎖)를 96-well plate에 100 ㎕ 분주한 후 25℃에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 직후 자이모산 suspension을 10 ㎕ 분주한 후 1시간 동안 배양하였다. Well의 용액을 가볍게 제거한 후 고정액과 blocking 용액을 넣어 배양하고 실온에서 60분간 진탕하였다. Well의 용액을 가볍게 제거한 후 permeabilization 용액을 100 ㎕ 분주한 후 실온에서 5분간 배양하였다. Well의 용액을 제거한 후 반응시약을 넣고 기질액을 첨가하여 반응시킨 후 stop solution 50 ㎕를 첨가하여 microplate reader (Tecan Sunrise, Salzburg, Austria)로 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 사료첨가제의 항병능을 평가하기 위하여 28일간 투여 후 군당 15마리 (3반복)의 넙치에 Streptococcus iniae를 복강투여 하였다. S. iniae는 3% NaCl을 첨가한 brain-heart infusion broth에서 27℃에서 24시간 배양한 후 균수를 2.0x107 CFU/fish의 농도로 조정하여 0.1㎖씩 복강내로 투여하였다. 시험기간 수온은 23±3℃로 유지하고 지속적으로 폭기를 실시하였다.
모든 데이터는 mean±SD로 표현하고 시험군간 평균의 통계학적 유의성 검정을 위해 ANOVA분석 후 Dunnett's 검정을 post-hoc test로 사용하였다. P 값이 0.05이하일 때 유의성이 있다고 판정하였다.
사료첨가제가 성장에 미치는 영향을 분석한 결과는 표 14와 같다.
대조군 시험군A 시험군B 시험군C 시험군D
초기체중(g) 28.1±1.2 27.4±1.4 28.1±0.9 27.9±1.3 27.5±0.9
최종체중(g) 41.8±8.9 43.9±9.5 44.1±5.6 47.2±7.9 45.9±4.7
증가체중(WG, g/fish) 13.7±3.4 16.4±6.1 15.1±2.7 17.5±5.1 17.9±3.3
증가율(%) 100 119 102 128 137
사료계수(FCR, g/g) 1.8±0.2 1.5±0.5 1.6±0.4 1.4±0.5 1.4±0.4
표 14의 결과를 살펴보면, 사료첨가제의 투여로 인해 대조군과 비교하여 28-37%가 28일 후 성장촉진효과가 관찰되었다. 사료첨가제로 인해 체중의 증가가 나타났으나 한편 FCR은 감소로 나타났기 때문에 본 발명의 사료첨가제가 넙치의 대사효능을 증가시키는 것으로 해석되었다.
다음으로 본 발명의 사료첨가제가 비특이적 면역능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Lysozyme 활성을 평가한 결과는 도 3과 같다.
도 3의 결과를 살펴보면, 사료첨가제의 투여로 인해 모든 시험군에서 통계적으로 유의한 높은 활성이 관찰되었다. 특히, 시험군 C에서 가장 높은 활성도를 나타냈다.
또한, 본 발명의 사료첨가제 급여에 따른 혈청 살해능(Serum bactericidal activity)을 평가한 결과는 도 4와 같다.
도 4의 결과를 살펴보면, 사료첨가제의 투여로 인해 모든 시험군에서 통계적으로 유의한 높은 활성이 관찰되었다. 특히, 라이소자임 활성능과 동일한 패턴으로 시험군 C에서 가장 높은 활성도를 나타냈다.
또한, 본 발명의 사료첨가제의 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성능을 평가한 결과는 도 5와 같다.
도 5의 결과를 살펴보면, Nitroblue tetrazolium을 환원하는 능력은 반응성산소종의 생성량을 평가하는 지표로 사용되며 ROS의 생성은 면역기능을 가진 세포의 활성화로 인해 일어나는 것으로 알려져 있다. 모든 시험군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있는 증가효과가 관찰되지 않았지만 아로니아발효물 10%와 ALA복합제 시험군 (0.1%)에서 평균적으로 증가하는 경향으로 나타났다.
또한, 본 발명의 사료첨가제 급여에 따른 탐식능(Phagocytic activity)의 측정 결과는 도 6과 같다.
도 6의 결과를 살펴보면, 백혈구의 탐식작용은 시험체 C에서만 통계적으로 유의하게 증가되었다. 또한, 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액 단일 투여 시험군에서 통계적으로 유의한 탐식능 증가 효과는 나타나지 않았지만, 평균적으로 대조군에 비해 증가하는 경향이 나타났다.
또한, 본 발명의 사료첨가제 급여에 따른 인위감염에 대한 항병능 평가를 수행한 결과는 도 7과 같다.
도 7의 결과를 살펴보면, 세균 S. iniae 감염에 대한 영향에 대하여 시험체 C 및 D에서 최종 누적폐사율은 대조군 대비 상대생존률이 58-72%로 나타났다. 그러나 아로니아 발효물 또는 아미노레불린산 배양액의 단일물질 투여는 상대생존률 20-28%로 방어효과가 비교적 약하였다.
이와 같은 시험결과로부터 본 발명에 따른 사료첨가제를 급여함으로써 사육동물의 생장효율 및 질병에 대한 면역력이 증진되는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 사료첨가제를 급여했을 때 산란계에서의 산란율 개선효과 및 면역증진효과를 시험하였다.
25~26령의 산란계를 7수씩 나누어 대조군에게는 일반 사료를 급여했고, 시험군 A에게는 일반 사료에 아로니아 발효물(1㎏/사료 톤)을 혼합하여 급여했으며, 시험군 B에게는 음수에 아미노레불린산 배양액(1ℓ/물 톤)를 톤당 혼합하여 급여했고, 시험군 C에게는 일반사료 1톤에 대해 아로니아 발효물 10 중량% 및 아미노레불린산 배양액 10 중량%를 포함하는 사료첨가제 1㎏을 혼합하여 급여했고, 시험군 D에게는 일반사료 1톤에 대해 아로니아 발효물 20 중량% 및 아미노레불린산 배양액 10 중량%를 포함하는 사료첨가제 1㎏을 혼합하여 급여했다. 급여는 총 6주에 걸쳐 이루어졌다.
급여에 따른 산란계의 체중, 사료섭취량, 산란율, 난중 무게, 혈액학치, 혈액생화학치, 항산화효과, 면역증진 효과, 간 TG함량 등을 측정하였으며, 그 결과는 표 15와 같다.
대조군 시험군A 시험군B 시험군C 시험군D
체중(㎏) 2.090 2.185 2.087 2.134 2.085
사료섭취량(g/bird/day) 150.8 515.6 147.0 146.4 152.4
산란율(%) 83.6 94.2 93.1 96.2 96.9
난중(g) 59.5 61.4 61.7 62.2 61.7
혈중중성지방(㎎/㎗) 1520.3 - 1415.5 1348.0 1198.8
항산화효과(ℓ / ㎎/㎖) 252.8
/26.5		 288.6/
36.69		 274.0/
33.02		 315.1/
39.52		 -
간TG농도(㎎/㎗) 52.51 45.14 37.61 31.52 33.27
표 15의 결과를 살펴보면, 체중이나 사료섭취량에 있어서 대조군과 시험군 A 내지 D 간에 유의적 차이는 없는 것으로 나타났다. 그러나 산란율은 시험군 C 및 D에서 대조군에 비해 10% 이상 증가가 나타났고, 난중 역시 대조군에 비해 4.5% 증가하였으며, 혈중 중성지방은 대조군에 비해 21.1% 감소했고, 항산화 효과는 대조군 대비 24.6%/49.1% 증가하고, 간 TG 농도는 대조군 대비 39.9% 감소하는 것으로 나타나 본 발명의 사료 첨가제를 급여한 산란계에 있어서 산란율의 뚜렷한 증가와 면역증진 효과가 나타나는 것으로 파악되었다.
또한, 본 발명에 따른 사료첨가제를 급여했을 때 육계에서의 생산성 증가 효과를 시험하였다. 육계 목장을 대상으로 54,000수의 육계에 대하여 일반사료 1톤에 대해 아로니아 발효물 20 중량% 및 아미노레불린산 배양액 10 중량%를 포함하는 사료첨가제 1㎏을 혼합하여 급여하되 물과 사료는 자유급식으로 급여하였다. 4주간 급여 후 생산지수, 폐사율, 증체량, 사료요구율을 측정한 결과는 표 16과 같다.
표 16에서 증감율 대조구 대비 증감율로서 (사료첨가제 급여결과 - 사료첨가제 비급여결과)/사료첨가제 비급여결과×100 또는 (사료첨가제 비급여결과 - 사료첨가제 급여결과)/사료첨가제 비급여결과×100로 계산한 백분율 값이다.
사료첨가제 비급여 사료첨가제 급여 증감율(%)
생산지수(PI) 273 304 11.4
폐사율(%) 3.8 0 3.8
증체량(㎏) 1.23 1.6 30
사료요구율(g/g) 1.550 1.513 2.38
표 16의 결과를 살펴보면, 본 발명의 사료첨가제를 급여할 경우, 폐사율이 0%로 감소했으며, 생산지수가 11.4% 증가하여 생산성이 크게 향상되는 것으로 나타났다. 또한, 육계의 증체량도 30% 증가하여 품질도 향상되는 것으로 나타났다.
본 발명은 상술한 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 설명하였으나, 상기 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형과 변경이 가능하다. 그러한 변형예 및 변경예는 본 발명과 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 한다.

Claims (4)

  1. 아로니아 원료에 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 접종하여 제조한 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하는 단계를 포함하며,
    상기 아미노레불린산 배양액은 사료첨가제 전체에 대하여 5 내지 10 중량%의 범위에서 혼합되는 것을 특징으로 하는 사료첨가제의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 아로니아 발효물 및 아미노레불린산 배양액을 혼합하는 단계에 있어서 부형제를 추가적으로 혼합하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 아로니아 원료는 아로니아 추출박인 것을 특징으로 하는 사료첨가제의 제조방법.
  4. 삭제
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