CN116064685B - 一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺和应用。本发明提出利用冠突散囊菌液体发酵中药材，促使中药材的有效成分在物理粉碎的基础上进一步得到更充分提取利用。一方面，利用冠突散囊菌自身代谢产物丰富及其所多种生理功能；另一方面，利用其丰富的酶系，显著提高中药产品的氨基酸含量，促进大分子多糖的转化，对中药活性成分的转化与修饰有助于提高产品利用率和稳定性，本发明使用孢子悬液接种发酵，有利于控制菌体形态、质量以及数量，使发酵更加均匀，发酵程度更加可控。本发明提供的发酵食用中药的制备工艺和应用，有助于得到药效增强或增多的新型炮制产品，进一步丰富和提高中药材价值，也为基于食用中药开发新型饮品提供思路。
Description
技术领域
本发明属于发酵食品和生物医药领域，具体涉及一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺及其应用。
背景技术
中药是我国的瑰宝，在我国医学史有着举足轻重的地位，大枣、莲子、薏苡仁、龙眼肉等药食同源中药材常见于人们的日常饮食中。药食同源物质，本质为可食用中药材，因兼具药食两用性，历来以食疗、食补和药膳等形式应用于医疗保健，食用中药是药食同源中药的重要发展方向。
中药材作为一种天然药物，具有诸多优势，诸如功能强大、不易产生耐药性、药效稳定、副作用小等，但也存在许多弊端，例如，活性成分含量低、药理作用不显著、溶解性差等，需要复杂的加工过程。中药加工技术陈旧是中药现代化进展缓慢的原因之一，在中药生产过程中，加工技术主要涉及粉碎、提取、浓缩、干燥、成型、灭菌及包装等环节。这些技术与中药的药效以及安全性有着密切的关系。由于中药成分复杂，传统的加工技术常导致产品生物利用率低、药效不稳定等问题，而现代技术的应用在一定程度上可以弥补传统加工技术的不足。超微粉碎技术可以大幅提高中药有效成分的生物利用率；微波、超声波、膜分离等技术可以有效地改善中药有效成分的提取率。这些新技术的应用和推广，对于中药产品的研发至关重要，但这些技术仍存在许多不足，例如超微粉碎技术在提高有效成分溶出的同时也会增加非有效成分的溶出，给后续工艺带来了隐患，此外随着物料粒径的减小，其粘附性会随之增强，从而影响后续多种药材的混合或者原辅料混合的均匀性；超声波技术存在能量分布不均、噪音污染等问题。
中药发酵是依托微生态学理论而形成的新型中药炮制技术，具体是指以优选后的一种或几种益生菌作为菌种发酵中药，意图得到药效增强或增多的新型炮制产品。1000多年前我国医药学家们就已将微生物发酵技术应用到中药炮制中，成为最早利用微生物发酵转化天然药物的国家，并且经过发酵工艺制成了许多种传统中药材药曲流传后世。中药经微生物发酵可以通过借助微生物生长代谢产生包含更多种生物活性成分的新型中药，即微生物在发酵过程中通过代谢活动将中药中的纤维糖类、蛋白质等物质利用后进行生物转化，产生多种有益次生代谢产物和生物酶等活性成分，提高中药的药理活性及适应症范围，微生物发酵工程改变了煎煮、蒸浸的传统工艺，促进了中药有效成分的充分提取利用，毒性成分是转化及新活性成分的生成，达到增效减毒，增加新型药理活性和提高中药资源利用度的效果。由此可见，微生物发酵中药能够转变中药药性，不但可以提高疗效、减少药材用量，提高中药资源利用度，还可以减弱中药毒副作用，增强安全性。
冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是茯砖茶发酵过程中的优势益生菌，俗称“金花”，是形成茯砖茶特有风味的决定性菌种。冠突散囊菌自身代谢产物丰富，包括各种胞外多糖、氨基酸、茶多酚等等，具有诸多功效，包括降脂减肥、提高人体免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等；另一方面其拥有丰富而强大的酶系，包括纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、多酚氧化酶、甘露聚糖酶等，对药用植物活性成分的转化与修饰存在巨大的潜力。由于冠突散囊菌的存在，茯砖茶的色、香、味得以不同于其他茶类，并具有抗氧化、促消化、降脂减肥、抑菌、抗癌等保健功效，因此人们日益重视冠突散囊菌的功能研究。冠突散囊菌可利用多种碳源生长，亦被用于谷类和豆类的加工过程，不同程度地丰富他们的生物学活性和感官品质。冠突散囊菌也被应用于中药材的深加工，可以有效促进中药的解毒和新型天然产物的产生，提高药效，如人工接种冠突散囊菌发酵银杏叶或种子，可有效脱除银杏毒素和银杏酸，增加总黄酮、聚戊烯乙酸酯和芳香物质的含量，提高发酵物抗氧化能力，增强淀粉酶和蛋白酶活性。因此，冠突散囊菌在中药开发方面的应用潜力显著，本发明认为冠突散囊菌是构建药用真菌和中药发酵组合的最佳菌种之一，基于冠突散囊菌发酵开发中药的加工工艺十分必要。
发明内容
针对传统的中药材加工技术常常会导致产品出现生物利用率低、药效不稳定等问题，以及部分现代新型技术，如超微粉碎技术以及超声波技术仍存在的一些隐患和活性成分不稳定等问题，本发明提供一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺，旨在增加营养活性成分、提高胞内营养活性成分释放率、转化大分子营养成分更有利于人体吸收。
本发明所涉及食用中药为三七、葛根、山药、铁皮石斛等，即三七、葛根、山药、铁皮石斛均属于药食同源的中药材，选择这类药食同源中药材主要有以下优势：1)三七具有促进全身血液循环、镇静、安神、抗肿瘤等功效；2)葛根含有多种黄酮类成分，能够改善心肌缺血状态，防治冠心病等心血管疾病，同时可以保护神经，预防及治疗骨质疏松；3)山药具有养脾健肾、化痰平喘、平稳血糖等功效，山药多糖是其主要活性成分，具有调节免疫活性等生理活性；4)铁皮石斛富含大量多糖成分，石斛多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力等生理功能。
本发明的发明构思是：利用冠突散囊菌液体发酵过程分泌的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种活性酶，催化食用中药中的淀粉、多糖、蛋白质、纤维素等大分子物质，转化为单糖、氨基酸等小分子活性成分。该过程不仅能提高中药附加值，营养物质更有利于人体吸收，也可以丰富活性成分。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明请求保护冠突散囊菌在发酵食用中药中的应用，即，利用冠突散囊菌发酵食用中药得到发酵食用中药产品。发酵食用中药产品包括制剂和饮品。
所述饮品，可采用本领域已知方法，将发酵食用中药与甜味剂、水、矫味剂和/或其他有效成分经复配、过滤、装瓶、杀菌等工艺处理得到。
同时，本发明还请求保护一种冠突散囊菌发酵食用中药粉的制备工艺，所述方法包括：以经过冷冻干燥处理后的食用中药材进行加工粉碎为粉末作为主要原料，开展冠突散囊菌液体发酵。
具体步骤包括：
(1)菌体活化、孢子悬液制备：制备马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基，接种环划线接种冠突散囊菌，28-30℃培养5-9d(待菌落周边呈金黄色，中间呈深褐色，菌落直径达到5cm以上)，制备107-109孢子/mL的孢子悬液。
(2)中药材的预处理：新鲜中药材除杂、洗净、切片、沥干；首先进行预冻结，在-30～-35℃条件下冷冻10-12h，待其中水分变为固态冰；进行升华干燥，在抽真空干燥室压力为30-50Pa下升温，并保持升华界面温度为-25～-20℃，并保温6-10h；解析干燥，在温度40-45℃加热，保持6-10h，进一步的利用粉碎机中进行粉碎，用40-60目筛子过筛，获得中药粉。所述中药材为含植物多糖的可食用的中药材。
(3)液体发酵：选用1-15％(w/v)中药粉制备冠突散囊菌液体培养基，110-121℃高压蒸汽灭菌15-30min，按2-15％(v/v)接种量接入冠突散囊菌孢子悬液，控制终浓度为106-108孢子/mL，28-30℃条件下振荡液体培养2-15d。
(4)指标检测：发酵过程中检测冠突散囊菌生物量、还原糖含量、总糖含量、酶活力、氨基酸含量等指标，以此确定发酵终点，获得冠突散囊菌发酵食用中药产品。
进一步的，上述步骤(1)中所使用的菌株是由中国工业微生物菌种保藏管理中心获得冠突散囊菌(E.cristatumCICC2099)的菌体冻干粉。
进一步的，选择中药材为山药时，上述步骤(2)中对于新鲜山药还要额外进行护色处理，具体操作为将块茎进行清洗、沥干，迅速切成2-3mm薄片，于0.2％柠檬酸水溶液中、90-95℃温度下护色5-8min后取出，而后进行冷冻干燥。
进一步的，上述步骤(3)中所使用的中药粉液体培养基配制方法为经过预处理的中药粉10-60g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、七水硫酸镁1-2g/L、七水硫酸亚铁0.2-0.6g/L、维生素B18-15mg/L。
进一步的，上述步骤(4)中所使用的冠突散囊菌生物量采用干重法测定。
进一步的，上述步骤(4)中所使用的还原糖含量采用DNS法测定。
进一步的，上述步骤(4)中所使用的总糖含量采用酸水解法结合DNS法测定。
进一步的，上述步骤(4)中所使用的酶活力通过测定发酵前后的淀粉酶活力表征，反映发酵过程中的淀粉酶活力的变化。
进一步的，上述步骤(4)中所使用的游离氨基酸含量检测采用茚三酮法，参考GB/T8314-2013，国标对茶游离氨基酸总量的测定方法。
本发明选择冠突散囊菌发酵食用中药，一方面利用冠突散囊菌自身代谢产物丰富，包括各种胞外多糖、氨基酸、茶多酚等等，所具有的诸多功效，包括提高人体免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等；另一方面利用其拥有的丰富而强大的酶系，包括纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、多酚氧化酶、甘露聚糖酶等，显著提高中药产品氨基酸含量，促进大分子多糖的转化，对药用植物活性成分的转化与修饰存在巨大的潜力以提高产品利用率和稳定性。旨在得到药效增强或增多的新型炮制产品，进一步丰富和提高中药材价值，也为基于食用中药开发新型饮品提供思路。
本发明采用液体发酵方法，固体发酵与液体发酵是两种不同的发酵方式，其发酵代谢产物种类和含量也有较大差异，与丝状真菌的菌丝体形态、发酵液粘度等有着密切的关系。液体发酵相比固体发酵，生产强度更高、氧供应更均衡、空间利用率更高、发酵过程容易控制，适用于大规模生产。本发明的目的是得到药效增强或增多的新型炮制产品，进一步丰富和提高中药材价值，也为基于食用中药开发新型饮品提供思路，因此液体发酵方式更有利于达到本发明的目的。
由于液体发酵体系中，发酵条件、培养基组成、接种物及接种量都对发酵效果产生影响。本发明从以上几个方面对发酵体系进行优化。
发酵条件：选择冠突散囊菌菌丝体生长最快的发酵条件进行优化，易获得更高菌丝干重，更大菌丝球密度，进而也能提高冠突散囊菌产活性酶的效率，有助于提升中药粉末的发酵性能。
培养基：采用液体深层发酵，研究不同培养基成分，不同培养条件，以菌丝体干重为单一指标来优化冠突散囊菌发酵条件。以中药粉末来代替基本碳源来优化中药培养基。最优培养基配方为：中药粉10-60g/L、磷酸二氢钾1-4g/L、七水硫酸镁1-2g/L、七水硫酸亚铁0.2-0.6g/L、维生素B18-15mg/L。
接种物及接种量：对于丝状真菌，接种物的选择比较重要，孢子和菌丝接种都可以，但是液体培养的菌丝形态影响比较大，本发明选用孢子接种方式，有助于底物、产物及氧的传递，发酵过程易控制，批次实验之间差异小，发酵产品质量相对稳定。另外，发明人还比较了6％、8％、10％的接种量对发酵的影响，其他因素保持一致，以菌丝体干重为指标确定冠突散囊菌液体发酵的最佳接种量为8％。
本发明所选择的发酵参数具有通用性可广泛应用于多种食用中药材的发酵，其干重及酶活性都比较稳定。
与已有的冠突散囊菌对于中药的发酵专利相比，本发明研究涉及的发酵中药种类更多包括三七、葛根、山药以及铁皮石斛，因此本发明的中药液体发酵方法更具通用性，可广泛适用于各种食用中药的发酵液制备，还涉及部分中药(如山药)需要进行的护色处理。
本发明对于中药材的预处理采用冷冻干燥的方式，这种方式相较于传统晾干，这种处理工艺能够避免高温干燥处理对中药材热敏性成分的破坏，能最大保留其活性成分，能使药材的有效成分的分解和散失降到最低。冷冻干燥后的中药材更加疏松多孔，为之后的材料粉碎提供便利，同时有利于后续的发酵。且冷冻干燥处理几乎不存在材料损失、易于长期保存，取用方便。中药材在低温、缺氧状态下进行过干燥，其活力的破坏和损失是最小的,可有效保留原有有效成分，如多糖、挥发性物质、黄酮类成分等。比如，三七常用的处理方式为爆干或烘房烘干等，但此方法温度较高，三七中的皂苷、三七素、挥发油等主要成分易在高温下分解，已经无法满足人类对三七药材品质的要求，在比较了不同干燥方法对三七药材外观性状与内在结构及其品质的影响时发现，冻干法干燥的药材有效成分皂苷成分和三七素含量最高，总灰分也最高，可能原因为低温抑制了药材的呼吸作用，减缓了内部淀粉与糖分的分解。
冻干后的中药材在粉碎后又进行了过筛，本发明对各种中药材的过筛目数进行了完善，对发酵进行了优化，提高了发酵效率。
本发明主要是针对中药材的活性成分含量低、药理作用不显著、溶解性差以及需要复杂的加工过程的问题，通过中药发酵，这种依托微生态学理论而形成的新型中药炮制技术，来弥补传统加工技术的不足。进而提高其生物利用率、稳定其药效，进一步丰富和提高中药材价值，为中药的发展提供新的有效的思路方法，也为基于食用中药开发新型饮品提供思路。
虽然利用冠突散囊菌对于中药材进行发酵已经有过一些相关的尝试，然而，利用冠突散囊菌自身的丰富代谢产物以及强大而充足的酶系来提高中药产品氨基酸含量，促进大分子多糖的转化，对药用植物活性成分的转化与修饰存在巨大的潜力以提高产品利用率和稳定性的研究却鲜有报道，更没有具有广泛通用性的中药发酵方法。
与现有技术相比，本发明使用冠突散囊菌来发酵食用中药，促使中药材的有效成分在物理粉碎的基础上进一步得到更充分提取利用。通过冠突散囊菌的丰富而强大的酶系来将中药材中的大分子物质转化为小分子，并结合冠突散囊菌自身代谢产物丰富的特点(包括各种胞外多糖、氨基酸、茶多酚等活性成分)，进一步提高中药材的附加值。除此之外，本发明使用孢子悬液接种发酵，有利于控制菌体形态、质量以及数量，使发酵更加均匀，发酵程度更加可控。
附图说明
图1为冠突散囊菌菌落形态比较。(a)冠突散囊菌在茶叶上生长的形态；(b)为冠突散囊菌在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上生长的形态；(c)冠突散囊菌在PDA固体培养基上不同时间的菌落形态变化。
图2为三七原料及经冠突散囊菌发酵后的形态变化及参数变化。(a)新鲜三七根；(b)预处理的三七粉；(c)以三七粉为原料的液体发酵体系的菌体形态比较；(d)冠突散囊菌发酵三七粉的参数变化。
图3为葛根原料及经冠突散囊菌发酵后的形态变化及参数变化。(a)新鲜葛根；(b)预处理的葛根粉；(c)以葛根粉为原料的液体发酵体系的菌体形态比较；(d)冠突散囊菌发酵葛根粉的参数变化。
图4为山药原料及经冠突散囊菌发酵后的形态变化及参数变化。(a)新鲜山药；(b)预处理的山药粉；(c)以山药粉为原料的液体发酵体系的菌体形态比较；(d)冠突散囊菌发酵山药粉的参数变化。
图5为铁皮石斛原料及经冠突散囊菌发酵后的形态变化及参数变化。(a)新鲜铁皮石斛；(b)预处理的铁皮石斛粉；(c)以铁皮石斛粉为原料的液体发酵体系的菌体形态比较；(d)冠突散囊菌发酵铁皮石斛粉的参数变化。
图6为以四种中药材为原料的冠突散囊菌发酵体系的生物量和淀粉酶酶活的比较。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围，如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1:冠突散囊菌发酵三七的制备工艺
(1)菌体活化：制备马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基(将洗净去皮的马铃薯切至小于1cm3的小块与500mL蒸馏水一同蒸煮30min，用三层纱布趁热过滤，取滤液并补充至500mL。加入10g葡萄糖，15g琼脂(固体培养基加)，边加热边搅拌，待琼脂溶解后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min)，接种环划线接种冠突散囊菌(图1a)，30℃培养7d(图1b)。
(2)孢子悬液制备：在无菌操作条件下，在经培养7d后的冠突散囊菌的茄子瓶中加入适量生理盐水，用无菌玻璃棒充分刮洗固体培养物，直至孢子充分脱落，经三层纱布过滤得到孢子悬液(108-109孢子/mL)。
(3)三七预处理：将新鲜三七(图2a)洗净、剪掉须根、切片、沥干；首先进行预冻结，-30℃冷却12h，待三七中的水分变为固态冰；进行升华干燥，在抽真空干燥室压力为50Pa下升温，并保持升华界面温度为-20℃，并保温8h；解析干燥，在温度45℃加热，保持8h，进一步的利用粉碎机中进行粉碎，用60目筛子过筛，获得三七粉(图2b)备用。
(4)以三七粉为原料制备液体发酵培养基：三七粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、七水硫酸镁1.5g/L、七水硫酸亚铁0.4g/L、维生素B110mg/L。溶解后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(5)液体发酵：按接种量8％(v/v)接入冠突散囊菌孢子悬液，控制终浓度为8×107孢子/mL，30℃条件下180r/min摇瓶液体培养10d。发酵过程中检测冠突散囊菌生物量、还原糖含量、总糖含量、酶活力、氨基酸含量等指标，以此确定发酵终点，获得冠突散囊菌发酵三七。
由图1c可观察到，固体培养的冠突散囊菌不同时间的形态变化。菌落在培养2d后开始生长，白色菌丝不断向外延伸，菌落中心逐渐由白色变为浅黄色。第5d菌落直径达到18～20mm，质地似毡状，紧密、扁平，边缘纤维毛状，形状如球状蘑菇，周边呈黄色，中心部分颜色较深，固体培养基中有黑褐色色素分泌，并随着培养时间的增加颜色加深。第9d时，菌落直径达25～30mm，有大量色素合成并扩散入培养基。第25d，菌落直径达50～55mm，菌体外观基本不再发生变化，颜色全部呈褐色，分泌出的色素使整个培养基呈现黑褐色。
三七粉液体培养基经过冠突散囊菌发酵后发酵液颜色明显加深，并有均匀菌球出现(图2c)。实验结果显示，使用冠突散囊菌发酵三七粉，可提高三七原料中还原糖含量和游离氨基酸含量，同时淀粉酶酶活力较未发酵体系的提高118％。总糖含量减少表明，三七粉中的植物多糖被冠突散囊菌所产生的淀粉酶、纤维素酶所分解。三七粉经发酵后有助于人体对其营养物质的摄入，从而可提高三七粉的营养功效。
(6)生物量测定：采用干重法。
(7)还原糖含量测定：采用DNS法。利用碱性条件下，3-氨基-5-硝基水杨酸与还原糖发生氧化还原反应生成的产物在煮沸条件下显棕红色，在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例，依此利用比色法测定还原糖含量。
(8)总糖含量测定：采用酸水解法测总糖含量。对多糖使用酸水解法使其降解为有还原性的单糖进行检测。具体操作为，加入10mL6MHCl溶液，在沸水浴中进行酸化处理30min，用6MNaOH溶液调至pH7.0，再通过DNS法测定还原糖含量并计算总糖含量。
(9)淀粉酶酶活测定：利用DNS法来测定淀粉酶水解淀粉标准溶液生成的还原糖含量，以单位时间淀粉酶分解生成还原糖的量来表示淀粉酶活力的大小。
(10)游离氨基酸含量测定：采用茚三酮法。利用氨基酸与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
实施例2:冠突散囊菌发酵葛根的制备工艺
(1)菌体活化、孢子悬液制备：制备马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基，接种环划线接种冠突散囊菌，30℃培养7d，制备浓度为107孢子/mL的孢子悬液。
(2)葛根预处理：新鲜葛根(图3a)洗净、剪掉须根、沥干；首先进行预冻结，-30℃冷却12h，待葛根中的水分变为固态冰；进行升华干燥，在抽真空干燥室压力为50Pa下升温，并保持升华界面温度为-20℃，并保温8h；解析干燥，在温度40℃加热，保持8h，进一步的利用粉碎机中进行粉碎，用80目筛子过筛，获得葛根粉(图3b)备用。
(3)以葛根粉为原料制备液体发酵培养基：葛根粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、七水硫酸镁1.5g/L、七水硫酸亚铁0.4g/L、维生素B110mg/L。溶解后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(4)液体发酵：按接种量8％(v/v)接入冠突散囊菌孢子悬液，终浓度为8×107孢子/mL，30℃条件下180r/min摇瓶培养10d；发酵过程中检测冠突散囊菌生物量、还原糖含量、总糖含量、酶活力、氨基酸含量等指标，以此确定发酵终点，获得冠突散囊菌发酵葛根。
葛根粉经过冠突散囊菌发酵10d后发酵液颜色由奶白色变为深褐色，并有均匀的菌球出现(图3c)。如图3d所示，使用冠突散囊菌来发酵葛根粉，可溶性植物多糖总量以及还原糖含量显著提高。
实施例3:冠突散囊菌发酵山药的制备工艺
(1)菌体活化、孢子悬液制备：制备马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基，接种环划线接种冠突散囊菌，30℃培养7d，制备浓度为107孢子/mL的孢子悬液。
(2)山药预处理：新鲜山药块茎(图4a)洗净、淋干，迅速切成2mm薄片，于0.2％柠檬酸水溶液中、95℃温度下护色，5min后取出；首先进行预冻结，-30℃冷却12h，待山药中的水分变为固态冰；进行升华干燥，在抽真空干燥室压力为50Pa下加热，并保持升华界面温度为-20℃，并保温8h；解析干燥，在温度40℃加热，保持8h。得干山药片经粉碎机粉碎后过40目筛子过筛，获得山药粉(图4b)备用。
(3)以山药粉为原料制备液体发酵培养基：山药粉30g/L、磷酸二氢钾占2g/L、七水硫酸镁1.5g/L、七水硫酸亚铁占0.4g/L、维生素B110mg/L。溶解后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(4)液体发酵：按接种量8％(v/v)接入冠突散囊菌孢子悬液，终浓度为8×107孢子/mL，30℃条件下180r/min摇瓶培养10d；发酵过程中检测冠突散囊菌生物量、还原糖含量、总糖含量、酶活力、氨基酸含量等指标，以此确定发酵终点，获得冠突散囊菌发酵山药。
山药粉经过冠突散囊菌发酵10d后发酵液颜色由浅黄色变为褐绿色，并有大量均匀菌球出现(图4c)。如图4d所示，利用冠突散囊菌来发酵山药粉，显著提高了淀粉酶活力。
实施例4:冠突散囊菌发酵铁皮石斛的制备工艺
(1)菌体活化、孢子悬液制备：制备马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基，接种环划线接种冠突散囊菌，30℃培养7d，制备浓度为107孢子/mL的孢子悬液。
(2)铁皮石斛预处理：将新鲜铁皮石斛(图5a)进行清洗、去皮切片、沥干水分；首先进行预冻结，-30℃冷却12h，待铁皮石斛中的水分变为固态冰；进行升华干燥，在抽真空干燥室压力为50Pa下加热，并保持升华界面温度为-20℃，并保温8h；解析干燥，在温度40℃加热，保持8h，直至水分降至10％，进一步的利用粉碎机中进行粉碎，用40目筛子过筛，获得铁皮石斛粉(图5b)备用。
(3)以铁皮石斛粉为原料制备液体发酵培养基：铁皮石斛粉30g/L、磷酸二氢钾占2g/L、七水硫酸镁1.5g/L、七水硫酸亚铁占0.4g/L、维生素B110mg/L。溶解后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min。
(4)液体发酵：按接种量8％(v/v)接入冠突散囊菌孢子悬液，终浓度为8×107孢子/mL，30℃条件下180r/min摇瓶培养10d；发酵过程中检测冠突散囊菌生物量、还原糖含量、总糖含量、酶活力、氨基酸含量等指标，以此确定发酵终点，获得冠突散囊菌发酵食用中药产品。
铁皮石斛粉经过冠突散囊菌发酵10d后发酵液颜色颜色由浅绿变为绿褐色，发酵液中也可观察到有菌球出现(图5c)。如图5d所示，使用冠突散囊菌来发酵铁皮石斛，可提高铁皮石斛的还原糖含量、总糖含量以及游离氨基酸含量，同时淀粉酶酶活力较未发酵组的提高了近50倍，从图6可知冠突散囊菌利用不同食用中药生长情况和所产生的淀粉酶酶活力都有不同，相较之下葛根粉作为培养基所产淀粉酶酶活力更高。
Claims (4)
1.一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺，其特征在于，利用冠突散囊菌发酵食用中药得到发酵食用中药产品，发酵食用中药产品包括中药制剂、饮品；
包括如下步骤：
S1. 菌体活化、孢子悬液制备：制备马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基，接种环划线接种冠突散囊菌，28-30℃培养5-9 d，制备107-109孢子/mL的孢子悬液；
S2. 中药材的预处理：新鲜中药材除杂、洗净、切片、沥干；首先进行预冻结，在-30~-35℃条件下冷冻10-12 h，待其中水分变为固态冰；进行升华干燥，在抽真空干燥室压力为30-50 Pa下升温，并保持升华界面温度为-25~-20℃，并保温 6-10 h；解析干燥，在温度40-45℃加热，保持6-10 h；然后利用粉碎机中进行粉碎，用40-60目筛子过筛，获得中药粉；所述中药材为含植物多糖的可食用的中药材；所述中药材为山药或铁皮石斛；
S3. 液体发酵：选用1-15%（w/v）中药粉制备冠突散囊菌液体培养基，110-121℃高压蒸汽灭菌15-30 min，按2-15%（v/v）接种量接入冠突散囊菌孢子悬液，控制终浓度为106-108孢子/mL，28-30℃条件下振荡液体培养2-15 d；
在步骤S3中液体培养基为：经过预处理的中药粉10-60 g/L、磷酸二氢钾1-4 g/L、七水硫酸镁1-2 g/L、七水硫酸亚铁0.2-0.6 g/L、维生素B1 8-15 mg/L。
2.根据权利要求1所述的冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺，其特征在于：还包括步骤S4. 指标检测：发酵过程中检测冠突散囊菌生物量、还原糖含量、总糖含量、酶活力、氨基酸含量指标，以此确定发酵终点，获得冠突散囊菌发酵食用中药产品。
3.根据权利要求1所述的冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺，其特征在于：在步骤S1中所用菌株为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏的冠突散囊菌 ( Eurotium. cristatum CICC 2099)。
4.根据权利要求1所述的冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺，其特征在于：在步骤S2中药预处理步骤中，选择中药材为山药时，对于新鲜山药还要进行护色处理，具体操作为将块茎进行清洗、沥干，迅速切成 2-3 mm薄片，于90-95℃、0.2%柠檬酸水溶液中护色5-8 min后取出，再进行冷冻干燥。
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