CN111920040B - 牡丹发酵产物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种牡丹发酵产物及其制备方法。该制备方法包括：利用混合菌竞争性生长对牡丹原料进行发酵处理，得到牡丹发酵产物，其中，混合菌均包括至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌。通过采用至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌的混合菌对牡丹原料进行联合发酵，酵母菌和乳酸菌在共生条件下存在既竞争又相互依存的关系，在竞争营养物质的同时也会给对方制造对方所需的物质。因此，在共同发酵的过程中会释放各种酶类，促进牡丹原料中功效物质的释放，功能的升级，从而使所得的牡丹发酵产物具有良好的抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性以及提高机体免疫力的作用。

Description

牡丹发酵产物及其制备方法
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体而言，涉及一种牡丹发酵产物及其制备方法。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr)，属芍药科、芍药属的多年生落叶灌木，素有“花中之王，国色天香”的美誉，是我国的一种传统花卉，兼具重要的观赏及药食价值。《四川中药志》载:牡丹花性平、苦、淡，具有调经活血的功能，主治月经不调，痛经。牡丹干燥后的根皮即为牡丹皮，是中医临床常用中药之一。在《神农本草经》中记载牡丹皮列为中品，性微寒，味苦、辛，归心、肝、肾经，具有清热凉血，活血化淤之功效，用于治疗温毒发斑，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，痈肿疮毒，跌扑伤痛等。
现代研究发现牡丹花中富含黄酮类、多酚类、花色苷等活性成分，黄酮类化合物主要包含单萜糖苷类化合物(吡啶芍药苷、芍药新苷、乙酰芍药苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷)，以及没食子酸和没食子酸甲酯等酚酸类化合物。牡丹花瓣中含有6种花色苷，主要为芍药花素、矢车菊素、天竺葵素的单糖苷和二糖苷。花色苷有较强的抗氧化活性，抗肿瘤活性，它可以通过抑制肿瘤细胞的增殖、转移和诱导癌细胞的凋亡实现抗癌作用。相比牡丹花瓣，牡丹皮作为中药原料研究更加深入，现代医学研究表明牡丹皮中主要的功效成分为酚及酚苷类、单萜及其苷类，其他还有三萜、甾醇及其苷类、黄酮、有机酸、香豆素等。酚及酚苷类是含量最高的物质，其组成是以丹皮酚为母核，以葡萄糖、阿拉伯糖和芹糖三种糖为支链形成的糖苷类化合物。其次是单萜及其苷类化合物，已分离确定了芍药苷元、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷、没食子酰芍药苷、没食子酰氧化芍药苷等20个该类化合物。
牡丹皮在药用研究方面的进展表明：牡丹皮具有抗脉粥样硬化、降血压、降血糖、抗惊厥、保肝、利尿、抗菌消炎、保护心肌细胞，对血液流变性，对脑组织保护等作用。在护肤方面牡丹皮中所含有的黄酮、多酚等化合物已经被证明具有显著的淡斑、美白的功效，牡丹皮及牡丹花在食品、药品、护肤品中的作用已经得到了一致认可。
然而目前牡丹的药用、食用或护肤方面的功效，仍未得到有效的开发和利用。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种牡丹发酵产物及其制备方法，以解决现有技术中对牡丹的药用、食用或护肤方面的功效开发利用程度仍较低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种牡丹发酵产物的制备方法，该制备方法包括：利用混合菌竞争性生长对牡丹原料进行发酵处理，得到牡丹发酵产物，其中，混合菌均包括至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌。
进一步地，按重量份计，混合菌中包括0.1～5份的酵母菌与0.1～5份的乳酸菌；优选地，酵母菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017781的酿酒酵母A3.12、保藏编号为CCTCC NO:M2017780的毕赤酵母C1.8或保藏编号为CCTCC NO:M2017782的假丝酵母C1.7，优选地，乳酸菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为CCTCCNO:M2017629的植物乳杆菌001或保藏编号为CCTCC NO:M2017630的鼠李糖乳杆菌001。
进一步地，按重量份计，混合菌与牡丹原料的用量比为0.1～5：0.1～20。
进一步地，采用混合菌对牡丹原料进行发酵，得到牡丹发酵产物的步骤包括：将混合菌与牡丹原料混合后进行初培养，得到初培养物；对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到牡丹发酵产物。
进一步地，对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到牡丹发酵产物的步骤包括：将初培养物进行厌氧培养或好氧培养，得到粗发酵物；对粗发酵物进行过滤，所得上清液即为牡丹发酵产物。
进一步地，初培养在25℃～30℃采用摇床培养24～96h，优选摇床的转速为160～200rpm/min。
进一步地，厌氧培养或好氧培养的步骤为：向初培养物中加入氮源和碳源，得到待发酵液；调节待发酵液的pH值至6.5～7.5后进行厌氧培养或好氧培养；优选地，厌氧培养或好氧培养的时间为24～240h，温度为36.5～37.5℃。
进一步地，在采用混合菌对牡丹原料进行发酵之前，制备方法还包括配制牡丹原料的步骤；优选地，配制牡丹原料的步骤包括；向去离子水中，分别加入牡丹皮和/或牡丹花、氮源及碳源，得到混合液；对混合液进行灭菌处理，得到牡丹原料；优选地，混合液中，以离子水为100份计，牡丹皮为0～20份，牡丹花为0～20份，氮源为0.5～10份，碳源为0.5～10份；优选地，氮源选自硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋白、酵母提取物及奶粉中的任意一种或多种；优选地，碳源选自葡萄糖、果糖、麦芽糖及水解淀粉中的任意一种或多种；优选地，灭菌的温度为80℃～130℃，灭菌的时间为3s～120min。
进一步地，牡丹花的粒度为80～100目，牡丹皮的粒度为100～200目。
进一步地，在采用混合菌对牡丹原料进行发酵之前，制备方法还包括配制混合菌的步骤，优选地，配制混合菌的步骤包括：分别对至少一种酵母菌以及至少一种乳酸菌依次进行菌种活化、菌种纯化以及扩大培养，得到酵母菌菌体及乳酸菌菌体；将酵母菌菌体与乳酸菌菌体混合，得到混合菌。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种牡丹发酵产物，牡丹发酵产物采用上述任一种制备方法制备得到。
根据本发明的第三个方面，提供了一种牡丹发酵产物，牡丹发酵产物的自由基清除率为85.5～95.2％，酪氨酸酶抑制率为88～91.7％。
根据本发明的第四个方面，提供了一种牡丹发酵试剂盒，该试剂盒包括混合菌，混合菌包括至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌。
进一步地，酵母菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017781的酿酒酵母A3.12、保藏编号为CCTCC NO:M2017780的毕赤酵母C1.8及保藏编号为CCTCC NO:M2017782的假丝酵母C1.7中的至少一种，乳酸菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017629的植物乳杆菌001及保藏编号为CCTCC NO:M2017630的鼠李糖乳杆菌001中的至少一种。
应用本发明的技术方案，通过采用至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌的混合菌对牡丹原料进行联合发酵，酵母菌和乳酸菌在共生条件下存在既竞争又相互依存的关系，在竞争营养物质的同时也会给对方制造对方所需的物质。比如：乳酸菌是营养缺陷型菌株，酵母菌在发酵过程中未乳酸菌提供氨基酸维生素丙酮酸盐等物质，而乳酸菌的代谢产物可以为酵母菌提供能量来源。因此，在共同发酵的过程中会释放各种酶类，促进牡丹原料中功效物质的释放，功能的升级，从而使所得的牡丹发酵产物具有良好的抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性以及提高机体免疫力的作用。
菌种保藏信息
本发明所用的菌种均保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。具体菌种的保藏信息如下：
酿酒酵母A3.12(Saccharomyces cerevisiae A3.12)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017781。
假丝酵母C1.7(Wickerhamomyces anomalus C1.7)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017782。
毕赤酵母C1.8(Cyberlindnera fabianii C1.8)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017780。
戊糖乳杆菌001(Pediococcus pentosaceus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017625。
植物乳杆菌001(Lactobacillus plantarum 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017629。
鼠李糖乳杆菌001(Lactobacillus rhamnosus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017630。
嗜酸乳杆菌001(Lactobacillus acidophilus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017628。
干酪乳杆菌001(Lactobacillus casei 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017631。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
由于在现有技术中，在食品属性的发酵中采用单一菌种发酵或者几种菌的分步发酵，而这种方法制得的发酵产物对牡丹的功效提升有限，为了改善这一现状，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种牡丹发酵产物的制备方法，该制备方法包括：利用混合菌竞争性生长对牡丹原料进行发酵处理，得到牡丹发酵产物，其中，混合菌均包括至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌。
本申请的上述方法通过采用至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌的混合菌对牡丹原料进行混合发酵，酵母菌和乳酸菌在共生条件下存在既竞争又相互依存的关系，在竞争营养物质的同时也会给对方制造对方所需的物质。比如：乳酸菌是营养缺陷型菌株，酵母菌在发酵过程中未乳酸菌提供氨基酸维生素丙酮酸盐等物质，而乳酸菌的代谢产物可以为酵母菌提供能量来源。因此，在共同发酵的过程中会释放各种酶类，促进牡丹原料中功效物质的释放，功能的升级，从而使所得的牡丹发酵产物具有良好的抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性以及提高机体免疫力的作用。
本申请的上述方法通过采用至少上述两种菌进行混合发酵能够提高发酵产物的功效，对混合菌中各菌种的混合比例可以根据实际需要进行合理选择。在本申请一种优选的实施例中，按重量份计，混合菌中包括0.1～5份酵母菌与0.1～5份乳酸菌。将两种菌的比例控制在上述范围内，有助于缩短发酵过程，提高发酵转化效率。
上述制备方法中，酵母菌及乳酸菌均可以采用现有的菌种。在本申请的优选实施例中，酵母菌选自酵母菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017781的酿酒酵母A3.12、保藏编号为CCTCC NO:M2017780的毕赤酵母C1.8或保藏编号为CCTCC NO:M2017782的假丝酵母C1.7。另一些优选实施例中，乳酸菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017629的植物乳杆菌001或保藏编号为CCTCC NO:M2017630的鼠李糖乳杆菌001。本申请中，优选上述种类的酵母菌菌种与上述种类的乳酸菌菌种，具有共生及竞争的生长特点，生长过程中所产生功效物质种类多，酶系复杂，具有促进牡丹原料成分释放，功效提升.的有益效果。
上述制备方法中，根据牡丹原料的量的不同，相应的混合菌的用量也相应存在差异。在本申请一种优选的实施例中，按重量份计，混合菌与牡丹原料的用量比为0.1～5：0.1～20。将混合菌与牡丹原料的用量比控制在上述范围内，有助于实现对牡丹原料的发酵更彻底，发酵产物的功效更高。
上述对牡丹原料进行发酵的具体步骤可以在现有的发酵步骤基础上改进得到。在本申请一种优选的实施例中，采用混合菌对牡丹原料进行发酵，得到牡丹发酵产物的步骤包括：将混合菌与牡丹原料混合后进行初培养，得到初培养物；对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到牡丹发酵产物。
将混合菌与牡丹原料混合后进行初培养，目的是为了获得菌种的最佳培养条件，以利于后续发酵。然后再进行厌氧培养或好氧培养进行发酵，能够使发酵更充分，原料的利用率高。此处的好氧培养是指：酵过程中通灭菌空气。
上述对初培养物进行发酵的步骤为在上述最佳培养条件下进行的发酵，具体得到发酵产物的步骤也可以参照现有操作进行。在本申请一种优选的实施例中，对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到牡丹发酵产物的步骤包括：将初培养物进行厌氧培养或好氧培养，得到粗发酵物；对粗发酵物进行过滤，所得上清液即为牡丹发酵产物。
通过发酵后对发酵物中的发酵固体残渣进行过滤，得到的上清液即可为发酵产物。具体的过滤方式不限，现有任何有利于固液分离的过滤方式均适用于本申请。在本申请中，优选采用将发酵后的发酵产物通过离心、板框过滤的方式处理得到上清液即为牡丹发酵产物。
上述将混合菌与牡丹原料混合后进行初培养的具体条件可以根据牡丹原料及混合菌的菌种类别进行合理优化得到。在本申请一种优选的实施例中，初培养在25℃～30℃采用摇床培养24～96h，优选摇床的转速为160～200rpm/min。
摇床培养是常用的菌种培养条件筛选的培养方式。根据所使用的混合菌种的不同，选择25℃～30℃之间的温度进行培养，有利于两种菌种同时进行生长繁殖。摇床的转速越大，牡丹原料及混合菌的接触越频繁，菌种生长速度相对较快；反之，转速越慢，牡丹原料及混合菌的接触频率越低，菌种生长速度相对较慢。因此，对于得到一定数量的菌体而言，转速越快，培养时间相对较短，反之，转速越慢，培养时间相对较长。
上述压氧培养或好氧培养是在初培养得到相对最佳的培养条件后进行的，因而，可以根据所获得的最佳培养条件进行培养即可。在本申请一种优选的实施例中，厌氧培养或好氧培养的步骤为：向初培养物中加入氮源和碳源，得到待发酵液；调节待发酵液的pH值至6.5～7.5后进行厌氧培养或好氧培养；优选地，厌氧培养或好氧培养的时间为24～240h，温度为36.5～37.5℃。
上述优选实施例，通过在初培养阶段获得最佳的培养条件后，发酵阶段通常转移至发酵罐中进行，而发酵罐中的生长环境更接近理想环境(包括温度，pH值等)，因而生物菌体生长更旺盛，对营养的消耗较快，养料不够，因而需要补加氮源和碳源以使发酵达到最佳状态，从而使得菌体快速生长繁殖，直到其生产能力下降。
上述制备方法中，牡丹原料根据实际需要可以是牡丹皮和/或牡丹花，相应地，在对牡丹原料进行混合菌发酵之前，牡丹原料中还需要被配制成适合混合菌发酵的环境条件，比如需要包括菌种生长繁殖所需的氮源及碳源，具体的配制过程及配比可以根据实际需要进行合理调整。
在本申请一种优选的实施例中，在采用混合菌对牡丹原料进行发酵之前，制备方法还包括配制牡丹原料的步骤；优选地，配制牡丹原料的步骤包括；向去离子水中，分别加入牡丹皮和/或牡丹花、氮源及碳源，得到混合液；对混合液进行灭菌处理，得到牡丹原料；优选地，混合液中，以离子水为100份计，牡丹皮为0～20份，牡丹花为0～20份，氮源为0.5～10份，碳源为0.5～10份；优选地，氮源选自硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋白、酵母提取物及奶粉中的任意一种或多种；优选地，碳源选自葡萄糖、果糖、麦芽糖及水解淀粉中的任意一种或多种；优选地，灭菌的温度为80℃～130℃，灭菌的时间为3s～120min。
为防止发酵过程中杂菌的污染，影响发酵效率及发酵产物的性能，发酵所用原料均需灭菌处理。上述牡丹原料中，除了0～20份的牡丹皮及0～20份的牡丹花外，在100份的离子水中，还包括0.5～10份的氮源和0.5～10份的碳源，该原料配比形成的牡丹原料具有营养丰富均衡，利于混合菌高效发酵的有益效果。氮源采用上述类别的化合物具有无机氮源与有机氮源组合同时适合酵母和乳酸菌的好处，而采用的碳源具有单糖与多糖组合适合菌种不同时期不同需求的优点。
为使牡丹花和/或牡丹皮更适合被发酵，可以对牡丹花和/或牡丹皮进行有效的前处理，比如进行研磨成粉等。在本申请一种优选的实施例中，将牡丹花和/或牡丹皮粉碎，并过筛处理，并控制牡丹花的粒度为80～100目，牡丹皮的粒度为100～200目。具体地，取干燥牡丹皮(水分≤13％)，粉碎过100～200目筛待用，新鲜牡丹花瓣洗净去除杂质后冷冻干燥，粉碎机粉碎后过80～100目筛。
上述制备方法中，混合菌是至少一种酵母菌与至少一种乳酸菌的混合菌，该混合菌中的菌种量是适合进行后续发酵所用的。具体混合得到混合菌的步骤采用现有步骤即可。在本申请一种优选的实施例中，在采用混合菌对牡丹原料进行发酵之前，制备方法还包括配制混合菌的步骤，优选地，配制混合菌的步骤包括：分别对至少一种酵母菌以及至少一种乳酸菌依次进行菌种活化、菌种纯化及扩大培养，得到酵母菌菌体及乳酸菌菌体；将酵母菌菌体与乳酸菌菌体混合，得到混合菌。
上述对各菌种依次进行活化、纯化及扩大培养的步骤为常规步骤。具体地，在本申请某些优选的实施例中，酵母菌和乳酸菌菌种活化的步骤为：挑取假丝酵母(或上述其他酵母菌种)菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)菌落一环放入MRS液体培养基中，摇床中活化。
在另一些优选实施例中，对菌种纯化的步骤为：将活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
在某些优选实施例中，酵母菌种扩大培养的步骤为：挑取平板中单个酵母菌菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)，离心收集菌体。乳酸菌菌种扩大培养的步骤为：挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)单个菌落一环放入MRS液体培养基中，37℃厌氧或好氧培养，当OD值＝0.8以上时，得到乳酸菌发酵菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)，然后离心得到菌体。
经过上述扩大培养后的两种不同菌体按照需要，设置合理的比例进行混合得到混合菌。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种牡丹发酵产物，该牡丹发酵产物采用上述任一种制备方法制备得到。采用上述混合菌同步对牡丹原料进行发酵的方法而制备的牡丹发酵产物具有良好的抗氧化性及抑制酪氨酸酶活性，同时还具有提高机体免疫力的作用。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种牡丹发酵产物，该牡丹发酵产物为牡丹皮和/或牡丹花经混合菌发酵后的产物。相比现有的牡丹发酵产物，本申请的牡丹发酵产物的功效得到有效提升，不仅具有良好的抗氧化性及抑制酪氨酸酶活性，同时还具有提高机体免疫力的作用。在一种优选的实施例中，牡丹发酵产物的自由基清除率为85.5～95.2％，酪氨酸酶抑制率为88～91.7％。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种牡丹发酵试剂盒，该试剂盒包括混合菌，混合菌包括至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌。当包含至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌的混合菌的试剂盒用来对牡丹原料进行联合发酵时，酵母菌和乳酸菌在共生条件下存在既竞争又相互依存的关系，在竞争营养物质的同时也会给对方制造对方所需的物质。因此，在共同发酵的过程中会释放各种酶类，促进牡丹原料中功效物质的释放，功能的升级，从而使所得的牡丹发酵产物具有良好的抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性以及提高机体免疫力的作用。
在一种优选的实施例中，酵母菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017781的酿酒酵母A3.12、保藏编号为CCTCC NO:M2017780的毕赤酵母C1.8及保藏编号为CCTCC NO:M2017782的假丝酵母C1.7中的至少一种，乳酸菌选自保藏编号为CCTCC NO:M2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为CCTCC NO:M2017629的植物乳杆菌001及保藏编号为CCTCC NO:M2017630的鼠李糖乳杆菌001中的至少一种。优选上述种类的酵母菌菌种与上述种类的乳酸菌菌种，具有共生及竞争的生长特点，生长过程中所产生功效物质种类多，酶系复杂，具有促进牡丹原料成分释放，功效提升的有益效果。
在本申请一种最优选的实施例中，牡丹发酵产物的制备方法包括如下步骤：
1)酵母菌和乳酸菌菌种活化：挑取假丝酵母(或上述其他酵母菌种)菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)菌落一环放入MRS液体培养基中，摇床中活化。
2)菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
3)酵母菌种扩大培养：挑取上步平板中单个酵母菌菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)，离心收集菌体。
4)乳酸菌菌种扩大培养：挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)单个菌落一环放入MRS液体培养基中，37℃厌氧或好氧培养，当OD值＝0.8以上时，得到乳酸菌发酵菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)，然后离心得到菌体。
5)牡丹皮及牡丹花瓣处理：取干燥牡丹皮(水分≤13％)，粉碎过100～200目筛待用，新鲜牡丹花瓣洗净去除杂质后冷冻干燥，粉碎机粉碎后过80～100目筛。
6)原材料混合：在100份去离子水中，取上述牡丹皮粉：牡丹花瓣＝0～20：0～20份的比例，加入0.5～10份葡萄糖或果糖或麦芽糖或水解淀粉，0.5～10份硫酸铵或氯化铵或水解大豆蛋白或酵母提取物或奶粉，80℃～130℃灭菌3s～120min。
7)混合同步发酵：将0.1～5份酵母菌菌体，0.1～5份植物乳杆菌菌体，加入至100份上步冷却后的原材料混合液中，25℃～30℃摇床培养24～96h(摇床转速160～200rpm/min)后加入灭菌后0.5～10份的葡萄糖或蔗糖或麦芽糖或水解淀粉，0.5～10份硫酸铵或氯化铵或大豆水解蛋白或奶粉或酵母提取物等，后调节pH＝6.5～7.5之间37℃厌氧或好氧培养发酵24～240h。
8)澄清处理：将发酵后的发酵产物通过离心、板框过滤的方式处理得到上清液即为牡丹发酵产物。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
以下实施例的原料为牡丹皮或牡丹皮牡丹花混合物、氮源(包括但不限于硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋白、奶粉、酵母提取物)、碳源(包括但不限于葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、水解淀粉等)及酵母菌(包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母)乳酸菌(包括但不限于戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)，上述各原料除菌种为本申请具有上述保藏信息的菌种外，其余均可以从市场购买得到。
实施例1
酵母及乳酸菌菌种活化：挑取酿酒酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取嗜酸乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，摇床中活化。
菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
酵母菌菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
乳酸菌菌种扩大培养：挑取嗜酸乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，进行纯化扩大培养，37℃厌氧发酵，当OD值＝1.0时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
牡丹皮：将5份牡丹皮粉,5份葡萄糖，5份奶粉加入到100份去离子水中，135℃高压瞬时灭菌5s。
混合发酵：取5份扩大培养后的酵母菌菌体，5份嗜酸乳杆菌菌体，加入至上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养96h(摇床转速160rpm/min)。再次加入灭菌后的营养液，营养液包含5份的葡萄糖，5份大豆水解蛋白，pH＝6.5，37℃厌氧或好氧培养发酵48h。
澄清处理：发酵结束后离心机高速5000r/min离心10min得到上清液即为牡丹发酵产物。
灭菌：上述人参发酵液80℃灭菌0.5h。
实施例2
酵母及乳酸菌菌种活化：挑取假丝酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取植物乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，摇床中活化。
菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
酵母菌菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值≥1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
乳酸菌菌种扩大培养：挑取干酪乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，进行纯化扩大培养，37℃厌氧发酵，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
牡丹原料：将20份牡丹皮粉和2份的牡丹花瓣粉,10份蔗糖,5份酵母提取物加入到100份去离子水中，121℃灭菌15min。
混合发酵：取2份扩大培养后的酵母菌菌体，4份植物乳杆菌菌体，加入至上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养48h(摇床转速180rpm/min)。再次灭菌后加入营养液，其中营养液包含2份的蔗糖，2份大豆水解蛋白，pH＝6.5，37℃厌氧或好氧培养发酵96h。
澄清处理：发酵结束后板框过滤机过滤所得上清液即为牡丹发酵产物。
灭菌：上述人参发酵液130℃灭菌5s。
自由基清除率95.2％,酪氨酸酶抑制率91.7％(熊果苷500mg/kg抑制率95.2％)
实施例3
酵母及乳酸菌菌种活化：挑取毕赤酵母菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取干酪乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，摇床中活化。
菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
酵母菌菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值≥1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
乳酸菌菌种扩大培养：挑取干酪乳杆菌菌落一环放入MRS液体培养基中，进行纯化扩大培养，35℃耗氧发酵，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
牡丹原料：将5份牡丹皮粉和20份的牡丹花瓣粉,5份麦芽糖,2份奶粉及5份大豆水解蛋白加入到100份去离子水中，121℃灭菌15min。
混合发酵：取1份扩大培养后的酵母菌菌体，2份干酪乳杆菌菌体，加入至上步冷却后的原材料混合液中，28℃摇床培养24h(摇床转速180rpm/min)后加入灭菌后的5份的麦芽糖，4份奶粉，pH＝7，37℃厌氧发酵120h。
澄清处理：发酵结束后板框过滤机过滤所得上清液即为牡丹发酵产物。
灭菌：上述牡丹发酵产物120℃灭菌15min。
自由基清除率85.5％,酪氨酸酶抑制率88.3％(熊果苷500mg/kg抑制率95.2％)
实施例4至实施例9
实施例4-9采用表1所示原料，及表2所示条件，按照与实施例1相同的步骤进行操作，得到各实施例的发酵产物。
对比例1
对比例1利用CN 105559084 A中的制备方法，采用三次植入发酵菌的方式分步进行发酵，具体步骤如下：
采用实施例7所得的牡丹原料，加入10％的毕赤酵母菌种子液(每ml种子液中含有毕赤酵母菌5*107CFU)，搅拌均匀，在温度28℃发酵15天，当发酵体系的pH到达4.0时终止发酵，得到毕赤酵母发酵液。
向毕赤酵母发酵液加入10％的干酪乳杆菌种子液(每ml种子液中含有干酪乳杆菌5*108CFU)，搅拌均匀，在温度37℃发酵15天，当发酵体系的pH到达4.3时终止发酵，得到乳酸菌发酵液。
向乳酸菌发酵液中加入8％的植物乳杆菌(每ml种子液中含有植物乳杆菌4.5*107CFU)，搅拌均匀，在温度37℃发酵60天，得到植物乳杆菌发酵液。
澄清处理：发酵结束后板框过滤机过滤所得上清液即为牡丹发酵产物。
灭菌：上述牡丹发酵产物120℃灭菌15min。
表1：各实施例和对比例所用原料
Figure GDA0004054324270000111
附：实施例9中所用到的酿酒酵母和乳酸菌的菌种保加利亚乳酸杆菌均为市售产品，酿酒酵母购自安琪酵母股份有限公司的低糖高活性干酵母，生产批号为2018021201。乳酸菌购自上海紫石生物科技有限公司的保加利亚乳杆菌，生产批号为20171225。
表2：
Figure GDA0004054324270000112
Figure GDA0004054324270000121
测试：
测试DPPH自由基清除率(原理是：根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计快速进行定量分析。)及酪氨酸酶抑制率。
采用紫外分光光度法检测酪氨酸酶抑制率和熊果苷500mg/kg抑制率，检测结果见表3。
表3：
Figure GDA0004054324270000122
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：使用牡丹皮及其利用率较低的牡丹花瓣为原料，天然安全。本申请的牡丹发酵液通过酵母菌和乳酸菌两种可食用菌的同步混合发酵实现了牡丹发酵液功效的提升，生物利用度的提高，为牡丹的综合利用提供了新的思路及办法，有助于提高牡丹的综合利用开发。该产品可以应用到食品、药品、保健食品、护肤品诸多行业中，实现了牡丹及其副产物价值的提升。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种牡丹发酵产物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
利用混合菌竞争性生长对牡丹原料进行发酵处理，得到所述牡丹发酵产物，
其中，所述混合菌为酵母菌和乳酸菌，所述混合菌包括：
1)所述酵母菌为假丝酵母，所述乳酸菌为植物乳杆菌，或
2)所述酵母菌为毕赤酵母菌，所述乳酸菌为干酪乳杆菌和所述植物乳杆菌；
其中，所述假丝酵母包括保藏编号为CCTCC NO: M2017782的假丝酵母C1.7；
所述毕赤酵母菌包括保藏编号为CCTCC NO: M2017780的毕赤酵母C1.8；
所述植物乳杆菌包括保藏编号为CCTCC NO: M2017629的植物乳杆菌001；
所述干酪乳杆菌包括保藏编号为CCTCC NO: M2017631的干酪乳杆菌001；
采用混合菌对牡丹原料进行发酵，得到所述牡丹发酵产物的步骤包括：
将所述混合菌与所述牡丹原料混合后进行初培养，得到初培养物；
对所述初培养物进行厌氧培养或好氧培养，得到所述牡丹发酵产物；
对所述初培养物进行厌氧或好氧培养，得到所述牡丹发酵产物的步骤包括：
将所述初培养物进行所述厌氧培养或好氧培养，得到粗发酵物；
对所述粗发酵物进行过滤，所得上清液即为所述牡丹发酵产物；
在采用所述混合菌对所述牡丹原料进行发酵之前，所述制备方法还包括配制混合菌的步骤；
配制所述混合菌的步骤包括：
分别对所述酵母菌以及所述乳酸菌依次进行菌种活化、菌种纯化以及扩大培养，得到酵母菌菌体及乳酸菌菌体；
将所述酵母菌菌体与所述乳酸菌菌体混合，得到所述混合菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按重量份计，所述混合菌中包括0.1~5份的所述酵母菌与0.1~5份的所述乳酸菌。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按重量份计，所述混合菌与所述牡丹原料的用量比为0.1~5：0.1~20。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述初培养在25℃~30℃采用摇床培养24~96h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述摇床的转速为160~200rpm/min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述厌氧培养或好氧培养的步骤为：
向所述初培养物中加入氮源和碳源，得到待发酵液；
调节所述待发酵液的pH值至6.5~7.5后进行所述厌氧培养或好氧培养。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述厌氧培养或好氧培养的时间为24~240h，温度为36.5~37.5℃。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，在采用所述混合菌对所述牡丹原料进行发酵之前，所述制备方法还包括配制所述牡丹原料的步骤。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，配制所述牡丹原料的步骤包括；
向去离子水中，分别加入牡丹皮和/或牡丹花、氮源及碳源，得到混合液；
对所述混合液进行灭菌处理，得到所述牡丹原料。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述混合液中，以所述离子水为100份计，所述牡丹皮为 0~20份，所述牡丹花为 0~20份，所述氮源为 0.5~10份，所述碳源为0.5~10份。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述氮源选自硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋白、酵母提取物及奶粉中的任意一种或多种。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、果糖、麦芽糖及水解淀粉中的任意一种或多种。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌的温度为80℃~130℃，灭菌的时间为3s~120min。
14.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述牡丹花的粒度为80~100目，所述牡丹皮的粒度为100~200目。
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