CN109694886B - 一种绿茶发酵滤液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种绿茶发酵滤液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种绿茶发酵滤液及其制备方法和应用。本发明提供了一种绿茶发酵滤液，其为包含绿茶提取物、碳源、氮源和酵母菌的原料混合物的发酵培养产物。本发明还提供了一种绿茶发酵滤液的制备方法，其包含下述步骤：(1)菌种活化，(2)菌种纯化，(3)菌种扩大培养，(4)接种发酵，(5)澄清处理，(6)灭菌。本发明的绿茶发酵滤液不含任何化学成分，制作过程中没有额外添加酶或其他加工助剂，生产成本较小，生产步骤简单。产品具有令人愉悦的发酵清香和良好的维持绿茶色泽和澄清度的效果。发酵滤液具有较强清除自由基能力，抑制酪氨酸酶效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种绿茶发酵滤液及其制备方法和应用。
背景技术
绿茶又称“不发酵”茶，由茶树新梢经过杀青、揉捻和干燥等工艺过程制成。茶多酚是多羟基酚类化合物的总称，是绿茶中的主要功效成分，占茶叶干重的22-30％。多酚物质的分子结构中含有多个苯环，而每个苯环上有两个或三个羟基，可作为氢的供体，具有较强的抗氧化作用，可以显著抑制自由基的损伤，同时绿茶中还具有其他一些生物活性物质在护肤及食品方面具有显著效果。
申请号为2011102710031667.4公开了一种绿茶发酵液与其制造方法，该制造方法包含下述步骤：(a)将新鲜茶叶高温加热进行杀青处理，去除新鲜茶叶中的多酚氧化酶的活性；(b)将步骤(a)处理过的新鲜茶叶浸泡于灭菌水中，制成茶水；(3)于茶水中混合加入糖类物质，制成含糖茶水；(d)于含糖茶水中混合加入酵母菌，制成发酵胚液；及(e)将发酵胚液于预定温度环境下发酵预定时间，制成绿茶发酵液。本发明所得到的发酵液作为一种新式酒液与茶类饮品使用，并未提及应用于化妆品、功能食品、营养功能食品中。
申请号为201610226591.3公开了一种含有茶多酚的美白护肤乳液，由以下质量份的组分组成：聚二甲基硅氧烷42-46份、环五聚二甲基硅氧烷44-48份、苹果酸40-44份、羟基化卵磷脂38-42份、茶多酚44-48份、丙烯酰二甲基牛磺酸钠40-44份、季戊四醇四异硬脂酸酯38-42份、椰油酰胺丙基甜菜碱44-48份、维生素E醋酸酯40-44份、白术根提取物38-42份、聚谷氨酸44-48份、乙二醇二硬脂酸酯40-44份、神经酰胺40-44份、对羟基苯甲酸甲酯38-42份、羟乙基纤维素44-48份、水10000-20000份。含有茶多酚的美白护肤乳液制备工艺方法简单，所制备的产品具有较为优越的美白效果，该产品能有效地清楚自由基，并能加快皮肤表层细胞更新，美白护肤功效显著。但是在本发明中加入化学试剂，容易对皮肤产生刺激。
目前，绿茶中的有效成分茶多酚作为功效因子应用于化妆品中，但还没有以绿茶发酵滤液作为化妆品以及作为食品应用的报道。
发明内容
本发明所解决的现有技术问题是：现有技术中采用绿茶进行发酵，以得到饮料或新式酒，并且在其他应用中，绿茶中的主要成分茶多酚作为功效因子应用于化妆品中，但没有与发酵技术相结合，主要突出的是茶多酚的抗氧化功效。
本发明提供了一种绿茶发酵滤液，其是通过将绿茶、氮源、碳源和酵母菌的原料混合进行发酵培养所得到的绿茶发酵滤液，所得到的绿茶发酵滤液不含任何化学成分，制作过程中没有额外添加酶或其他加工助剂。生产成本较小，生产步骤简单。可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，天然不刺激，且滤液中含有丰富的茶多酚、氨基酸、小分子多肽及有机酸等物质，有助于肌肤抗氧化和抗衰老。同时，该滤液可以作为一种原料添加到普通食品、饮料、功能食品、营养功能食品中。
本发明所得到的绿茶发酵滤液，在生产过程中特别添加了微生物生产所需营养物质，经过发酵后可以充分释放绿茶中的功效成分，并包含微生物生产代谢所产生的功效因子。所得到的绿茶发酵滤液具有令人愉悦的发酵清香，具有良好的维持绿茶色泽和澄清度的效果，并且具有较强清除自由基的能力，抑制酪氨酸酶效果显著。
本发明还提供了一种绿茶发酵滤液的制备方法，其是将酵母菌进行纯化、活化和扩大化培养，以得到处于对数期的发酵菌菌液；将绿茶浸泡，得到绿茶浸泡液，在绿茶浸泡液中加入氮源、碳源，然后将处于对数期的发酵菌菌液接种在含有绿茶提取物、碳源和氮源的混合液中，进行发酵培养，接着进行精滤得到上清液，将上清液进行灭菌即得到绿茶发酵滤液。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种绿茶发酵滤液，其为包含绿茶提取物、碳源、氮源和酵母菌的原料混合物的发酵培养产物。
优选的，对于所述的绿茶发酵滤液，其中，相对于100ml绿茶提取物，所述氮源为0.5-20g，所述碳源为0.5-20g，所述酵母菌的菌液为5-50g。
优选的，对于所述的绿茶发酵滤液，其中，所述碳源选自于葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖中的一种。
优选的，对于所述的绿茶发酵滤液，其中，所述氮源选自于硫酸铵、氯化铵、酪蛋白、奶粉和大豆分离蛋白中的一种或两种。
优选的，对于所述的绿茶发酵滤液，其中，所述酵母菌选自于酿酒酵母Z2.1(Saccharomyces cerevisiae Hansen Z2.1)或酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiaeFX-2)中的一种，所述酿酒酵母Z2.1的保藏编号为CCTCC NO：M205127，所述酿酒酵母FX-2的保藏编号为CCTCC NO:M2016418。
本发明提供了一种绿茶发酵滤液的制备方法，其包含下述步骤：
(1)菌种活化：酵母菌放入液体培养基中进行活化培养；
(2)菌种纯化：将步骤(1)所述活化后菌液稀释，得到单个菌落；
(3)菌种扩大培养：将步骤(2)所得到的单个菌落接种到液体培养基中进行培养，得到发酵菌菌液；
(4)接种发酵：将步骤(3)的菌液加入到含有绿茶提取物、碳源和氮源的混合液中，25-35℃下培养；
(5)澄清处理：将步骤(4)所得到的发酵产物过滤得到上清液；
(6)灭菌：将步骤(5)所得到的上清液灭菌得到绿茶发酵滤液。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)和步骤(3)中所述的液体培养基为YPD液体培养基。
优选的，对于所述的制备方法，其中，所述YPD液体培养基的组分包含0.9重量％-1重量％的酵母膏，1.5重量％-2重量％蛋白胨和1.8重量％-2重量％葡萄糖。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，所述的培养是在28-35℃下摇床培养，至其菌种处在对数期时得到发酵菌菌液，优选为在28-32℃下摇床培养，更优选为28-30℃下培养。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，所述绿茶提取物包含将绿茶与水按质量比为1：10-1000进行混合，然后进行提取的步骤；优选的，所述提取温度为20-100℃，所述提取时间为2-24h。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，以100ml绿茶提取物计，所述氮源为0.5-20g，所述碳源为0.5-20g，所述酵母菌的菌液为5-50g。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，所述混合液进行灭菌，所述的灭菌温度为60-115℃，所述的灭菌时间为15-240min。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，所述培养为摇床培养，所述摇床转速为160-200rpm/min，所述培养时间为24-96小时。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(6)中，所述灭菌时间为5s-240min，所述灭菌温度为60-115℃。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(6)中，所述灭菌为超高温瞬时灭菌。
本发明的绿茶发酵滤液在化妆品中的应用，优选在护肤品中的应用。
本发明提供了一种化妆品，其通过包含绿茶发酵滤液和载体的原料制备得到。
本发明的绿茶发酵滤液在食品中的应用。
本发明提供了一种食品，其包含绿茶发酵滤液。
本发明所取得的有益效果是：在绿茶发酵滤液的制备过程中，不涉及非食品原料，保证了来源天然健康。本方法所得到的绿茶发酵滤液澄清透明，略带绿茶特有绿色，具有绿茶及发酵所特有的混合气味，气味芳香怡人。发酵液中还含有茶多酚、黄酮、氨基酸、小分子活性多肽、有机酸、矿物质等多种有益于皮肤的活性成分，可直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，天然不刺激；并且，所述绿茶发酵滤液不含任何化学成分，生产成本较小，生产步骤简单，本发明所述的绿茶发酵滤液添加到食品中，能够改善食品的功能性。
附图说明
图1是实施例1中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线；
图2是实施例2中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线；
图3是实施例3中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线；
图4是实施例4中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线；
图5是实施例5中空白组、样品1组和样品2组使用前后皮肤黑色素变化情况曲线图；
图6是实施例5中空白组、样品1组和样品2组相对涂抹前皮肤黑色素减少率变化图；
图7是实施例5中空白组、样品1组和样品2组使用前后皮肤血红素(红斑)变化情况曲线图；
图8是实施例5中空白组、样品1组和样品2组相对涂抹前皮肤血红素(红斑)减少率变化图。
菌种的来源
本发明所用的菌种酿酒酵母Z2.1(Saccharomyces cerevisiae Hansen Z2.1)于2005年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M205127，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68752319，酿酒酵母Z2.1记载在专利文献200810105973.6《一种富铁酵母及其生产方法》中。
本发明所用的菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2016418，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码：430072；电话：(027)-68752319。酿酒酵母FX-2记载在专利文献201611141122.8《酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法》中。
本发明所使用的酿酒酵母FX-2来自于发酵面团，发酵面团中含有多种野生菌，以发酵面团为样品，制备面团浸出液，经过稀释涂布平板分离法分离得到纯种的菌株，经鉴定确认该菌株属于酿酒酵母。
菌株鉴定方法为:将菌株的26S rDNA的D1/D2区序列，与GenBank核酸数据库中的序列进行同源性分析，结果表明序列同源性大于99％，从而确定本发明分离得到的菌株属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，生物学分类为酿酒酵母FX-2(Saccharomycescerevisiae)。
具体实施方式
图1是实施例1中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线，其中，纵坐标是DPPH自由基的清除率水平，根据线性回归方程计算IC50值，计算结果表明绿茶发酵滤液稀释至0.0030％后DPPH抑制率可以达到50％。
图2是实施例2中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线，根据线性回归方程计算IC50值，计算结果表明绿茶发酵滤液稀释至0.0026％后DPPH抑制率可以达到50％。
图3是实施例3中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线，根据线性回归方程计算IC50值，计算结果表明绿茶发酵滤液稀释至0.0030％后DPPH抑制率可以达到50％。
图4是实施例4中绿茶发酵滤液的DPPH自由基清除水平的线性回归曲线，根据线性回归方程计算IC50值，计算结果表明绿茶发酵滤液稀释至0.0030％后DPPH抑制率可以达到50％。
图5是实施例5中空白组、样品1组和样品2组使用前后皮肤黑色素变化情况曲线图，从图中可以看出，在测试周期内，受试者使用样品1组和样品2组后，黑色素呈下降趋势，但相对于样品1组，受试者使用样品组2后，所测的黑色素值较低。说明本发明所制备的绿茶发酵滤液具有美白的功效。
图6是实施例5中空白组、样品1组和样品2组相对涂抹前皮肤黑色素减少率变化图，从图中可以看出，在涂抹后1-4周内，样品2组相对于样品1组和空白组的相对黑色素减少率较大，说明本发明的绿茶发酵滤液的美白效果明显。
图7是实施例5中空白组、样品1组和样品2组使用前后皮肤血红素(红斑)变化情况曲线图，从图中可以看出，在测试周期内，受试者使用样品1组和样品2组后，皮肤血红素呈下降趋势，但相对于样品1组，受试者在使用样品2组后，血红素下降明显，说明本发明的绿茶发酵滤液可以降低皮肤血红素(红斑)。
图8是实施例5中空白组、样品1组和样品2组相对涂抹前皮肤血红素(红斑)减少率变化图，从图中看出，与空白组和样品1组相比，受试者使用样品2组后所得到的血红素相对减少率较大，说明本发明所制备的绿茶发酵滤液可以降低皮肤的血红素(红斑)。
如上所述，本发明提供了一种绿茶发酵滤液，其是通过将绿茶、氮源、碳源和酵母菌的原料混合，然后进行发酵培养得到绿茶发酵滤液。所得到的绿茶发酵滤液不含有任何化学成分，制作过程中没有额外添加酶或其他加工助剂，生产成本较小，生产步骤简单。同时，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，天然不刺激，滤液中含有丰富的茶多酚、氨基酸、小分子多肽及有机酸等物质，有助于肌肤抗氧化和抗衰老。
其中，所述碳源选自于葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖中的一种。
其中，所述氮源选自于硫酸铵、氯化铵、酪蛋白、奶粉和大豆分离蛋白中的一种或两种。
其中，所述酵母菌选自于酿酒酵母Z2.1和酿酒酵母FX-2中的一种。
本发明提供了一种绿茶发酵滤液的制备方法，其是将酵母菌进行活化、纯化及扩大化培养，以得到处于对数期的发酵菌菌液；将绿茶用水进行浸泡，得到绿茶浸泡液，然后在绿茶浸泡液中加入氮源、碳源进行灭菌；接种发酵菌菌液进行发酵，接着进行过滤灭菌得到绿茶发酵滤液。
其中，在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供了一种绿茶发酵滤液的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：酵母菌放入液体培养基中进行活化培养；
(2)菌种纯化：将步骤(1)所述活化后菌液稀释，得到单个菌落；
(3)菌种扩大培养：将步骤(2)所得到的单个菌落接种到液体培养基中进行培养，得到发酵菌菌液；
(4)接种发酵：将步骤(3)的菌液加入到含有绿茶提取物、碳源和氮源的混合液中，25-35℃下培养24-96h；
(5)澄清处理：将步骤(4)所得到的发酵产物精滤得到上清液；
(6)灭菌：将步骤(5)所得到的上清液灭菌得到绿茶发酵滤液。
其中，在步骤(1)和步骤(3)中所述的液体培养基为YPD液体培养基。
其中，在步骤(3)中，所述的培养是在28-35℃下摇床培养，至其菌种处在对数期时得到发酵菌菌液，优选为28-32℃下摇床培养，更优选为28-30℃下摇床培养。
其中，在步骤(4)中，所述绿茶提取物包含将绿茶与水按质量比为1：10-1000进行混合，然后进行提取的步骤；优选的，所述提取温度为20-100℃，所述提取时间为2-24h。
其中，在步骤(4)中，所述混合液进行灭菌，所述的灭菌温度为60-115℃，所述的灭菌时间为15-240min。
其中，在步骤(4)中，所述的培养为摇床培养，所述的摇床转速为160-200rpm/min。
其中，在步骤(6)中，所述灭菌时间为5s-240min，所述灭菌温度为60-115℃。
本发明是基于发酵的独特优势，充分释放绿茶中的功效成分，结合发酵所产生的特有小分子功效因子，提高绿茶类产品在化妆品中的应用水平。绿茶发酵滤液可以有效避免绿茶类提取物变色浑浊的问题，并具有怡人的气味及良好的色泽。在制备过程中，所涉及的原料均为普通食品属性，天然不刺激，安全无负担。
本发明还提供了一种化妆品，其是通过绿茶发酵滤液与载体的原料制备得到。
本发明还提供了一种食品，其包含绿茶发酵滤液。其作用机理为：
绿茶中含有大量的多酚类化合物，具有较强的抗氧化清除自由基的功效，同时微生物发酵多酚类物质可产生较多的有机酸，多酚和有机酸两者都能对胃肠道消化功起促进作用。而且发酵能改变营养组成及风味并强化产品的的保健性和功能性。
绿茶发酵液采用绿茶作为原料，配合各种食品级的发酵底物，利用酿酒酵母菌进行发酵，发酵后的发酵滤液中各类活性物质含量更加丰富。
首先发酵过程中会促进茶叶中活性物质在温和条件下溶出，提高功效成分的含量，同时发酵过程中儿茶素经过酵母的吸收利用，会转变为其它的代谢产物。酵母会产生α-葡萄糖苷转移酶，将儿茶素转变为糖苷化的儿茶素，提高了绿茶发酵液的生物学活性。
其次发酵过程中产生大量的有机酸，主要包括乙酸和三羧酸循环中苹果酸、异柠檬酸和琥珀酸等多种有机酸。儿茶素与有机酸具有协同作用，绿茶发酵液对平衡肠道菌群有一定作用，二者对胃肠道中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，对乳酸杆菌具有促生作用。
综上所述，绿茶发酵滤液中活性成分具有显著的改善。
下述所述的原料均为常规的原料，如无特殊说明，均可以从市场上购买得到。
实施例1
(一)绿茶发酵滤液的制备
采用如下方法制备得到绿茶发酵滤液：
(1)菌种活化：挑取酿酒酵母Z2.1(Saccharomyces cerevisiae Hansen Z2.1)菌落一环放入含有0.9重量％酵母膏、1.5重量％蛋白胨、1.8重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化；
(2)菌种纯化：将步骤(1)活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落；
(3)菌种扩大化培养：挑取步骤(2)平板中单个菌落接种至含有0.9重量％酵母膏、1.5重量％蛋白胨、1.8重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，28℃下摇床培养，当OD＝1.0时，即菌种处于对数期时，得到发酵菌菌液；
(4)接种发酵：将5g步骤(3)的发酵菌菌液加入到含有绿茶提取物、蔗糖、酪蛋白和硫酸铵的混合液中，在25℃下摇床培养24h；
所述混合液的制备方法包含下述步骤：
(a)绿茶提取浸泡：将0.5g绿茶与500ml水混合，加热至60℃后搅拌，提取4小时，得到绿茶提取物；
(b)原材料混合：在步骤(a)的提取液中，以100ml绿茶提取物计，加入15g的蔗糖、15g的酪蛋白及5g的硫酸铵，在100℃下灭菌20min；
(5)澄清处理：将步骤(4)所得到的发酵产物进行精滤得到上清液；
(6)灭菌：将步骤(5)中的上清液在60℃下灭菌240min得到绿茶发酵滤液。
(二)理化检测
1.绿茶发酵滤液DPPH自由基清除水平测定比(平行三次平均结果)
(1)原理
DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。DPPH结构式如下所示：
当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。
(2)实验步骤
a.DPPH测试液的配制
以无水乙醇配制0.16mmol/L DPPH溶液。首先称取0.0030g DPPH(纯度大于97％，由北京华越洋生物科技有限公司提供)于小烧杯中，随后用少量无水乙醇溶解，溶解饱和后将溶液倒入50ml棕色容量瓶中，再用少量乙醇继续溶解烧杯中的未溶DPPH。如此往复，保证最后定容时小烧杯中乙醇澄清，不含残留DPPH。将棕色容量瓶超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
b.预试
先将1％浓度的发酵茶叶滤液分别稀释100、200、400、600、1000倍，制成五个浓度的溶液，然后分别取3ml的样品溶液，分别加入3mlDPPH溶液黑暗中30分钟后，在517nm测得试样吸光度(Ai),取3ml蒸馏水代替样品测得空白吸光度(Ao),以50％酒精水溶液为空白，以3ml样品中加入3ml蒸馏水测得样品本底吸光度(Aj)，蒸馏水为空白。利用公式清除率S(％)＝[(A0-(Ai-Aj))/A0]×100％计算清除率，并以浓度为横坐标、清除率为纵坐标制作散点图，观察线性相关性。然后根据预实验摸索，将正式的稀释倍数200、250、300、400、500倍，5个稀释溶液的浓度分别为：0.0050％、0.0040％、0.0033％、0.0025％、0.0020％，按照上述方法进行测定，计算清除率并制作线性回归方程，根据线性回归方程计算IC50，线性回归曲线如图1所示。
IC50值计算绿茶发酵滤液稀释至0.0030％后DPPH抑制率可以达到50％。
2.绿茶发酵滤液酪氨酸酶抑制率水平测试
(1)原理
酪氨酸酶是黑色素生成过程中的主要限速酶，其活性与黑色素的合成量成正相关。人皮肤颜色的深浅主要取决于皮肤黑素细胞的量和合成黑色素的能力。酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，催化L-酪氨酸羟基化转变成L-多巴，同时氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌再经过一系列反应，最后形成黑色素。酪氨酸酶抑制剂的作用就是通过抑制酪氨酸酶的活性阻断酪氨酸向黑色素转化，达到美白的效果。
(2)试验方法
1)酪氨酸酶(纯度为≥500units/mg protein，由北京索莱宝科技有限公司提供)(试剂：25ku、-20℃保存)、L-酪氨酸(纯度＞99％，由北京索莱宝科技有限公司)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、恒温仪、紫外分光光度计(TU-1901双光束紫外可见光分光光度计，由北京普析通用仪器有限责任公司提供)、离心机。
2)试剂配制
a.磷酸钠缓冲液(1/15mol/L，pH＝6.8)
精确称取1.000g磷酸二氢钠，1.186g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500mL，4℃冰箱保存备用。
b.L-酪氨酸溶液(7.5mmol/L)
精确称取L-酪氨酸0.136g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50mL，90℃加热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至7左右，加去离子水定容至100mL棕色容量瓶中，避光保存。
c.受试液
1％发酵茶叶滤液，0.5％熊果苷溶液
d.酪氨酸酶液的制备
试剂配置：将小包装瓶中的固体粉末酶试剂用蒸馏水溶解，然后用胶头吸管吸出，转移至250ml容量瓶中，不断重复溶解、转移过程，直到吸出的酶液从黄棕色变为澄清透明为止，最后于容量瓶中定容250ml，获得100u/ml的酶液。将250ml酶液用小离心管分装，-20℃保存。实验过程中按需取出解冻后再使用。
3)检测方法
总反应体系为5mL。具体设计见下表。
其中，用分光光度计测量吸光值时，“受试液体系”、“标准对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”调零。
实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液、酶液，于30℃水浴10min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应40min时475nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液对酪氨酸酶的抑制率。
抑制率＝[(A-B)/A]×l00％
其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液的吸光值。每个实验做3个平行。实验结果如下表所示：
| 组别 | 项目 | 浓度 | 酪氨酸酶抑制率 |
| 1 | 绿茶发酵液 | 原液 | 89.98％ |
| 2 | 熊果苷 | 500mg/kg | 93.24％ |
其中，所述熊果苷纯度≥98％(HPLC)，由北京索莱宝科技有限公司提供。实验结果表明，绿茶发酵滤液酪氨酸酶抑制率达到90％，仅次于500mg/kg的熊果苷样品。
实施例2
(一)绿茶发酵滤液的制备
采用如下方法制备得到绿茶发酵滤液：
(1)菌种活化：挑取酿酒酵母Z2.1(Saccharomyces cerevisiae Hansen Z2.1)菌落一环放入含有0.9重量％酵母膏、1.5重量％蛋白胨、1.8重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化；
(2)菌种纯化：将步骤(1)活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落；
(3)菌种扩大化培养：挑取步骤(2)平板中单个菌落接种至含有0.9重量％酵母膏、1.5重量％蛋白胨、1.8重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，30℃下摇床培养，当OD＝1.0时，即菌种处于对数期时，得到发酵菌菌液；
(4)将20g步骤(3)的发酵菌菌液加入到含有绿茶提取物、葡萄糖和奶粉的混合液中，在35℃下摇床培养36h；
所述混合液的制备方法包含下述步骤：
(a)绿茶浸泡液：将5g绿茶与500ml水混合，加热至100℃后搅拌，提取2小时，得到绿茶提取物；
(b)原材料混合：在步骤(a)的提取液中，以100ml绿茶提取物计，加入0.5g葡萄糖、0.5g奶粉，在115℃下高压灭菌15min；
(5)澄清处理：将步骤(4)所得到的发酵产物进行精滤得到上清液；
(6)灭菌：将步骤(5)中的上清液超高温瞬时(UHT)灭菌5s得到绿茶发酵滤液。
(二)理化检测
1)采用与实施例1相同的方法进行DPPH自由基清除水平的测定，线性回归曲线如图2所示，根据线性回归方程计算IC50，结果表明绿茶发酵滤液稀释至0.0026％后DPPH抑制率可以达到50％。
2)采用与实施例1相同的方法进行酪氨酸酶抑制率水平的测试，实验结果见下表：
| 组别 | 项目 | 浓度 | 酪氨酸酶抑制率 |
| 1 | 绿茶发酵液 | 原液 | 88.28％ |
| 2 | 熊果苷 | 500mg/kg | 89.12％ |
实验结果表明，绿茶发酵滤液酪氨酸酶抑制率为88.28％，仅次于500mg/kg的熊果苷样品。
实施例3
(一)绿茶发酵滤液的制备
采用如下方法制备得到绿茶发酵滤液：
(1)菌种活化：挑取酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)菌落一环放入含有1重量％酵母膏、2重量％蛋白胨、2重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化；
(2)菌种纯化：将步骤(1)活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落；
(3)菌种扩大化培养：挑取步骤(2)平板中单个菌落接种至含有1重量％酵母膏、2重量％蛋白胨、2重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，28℃下摇床培养，当OD＝1.0时，即菌种处于对数期时，得到发酵菌菌液；
(4)接种发酵：将30g步骤(3)的发酵菌菌液加入到含有绿茶提取物、麦芽糖和硫酸铵的混合液中，在28℃下摇床培养96h；
所述混合液的制备方法包含下述步骤：
(a)绿茶浸泡液：将50g绿茶与500ml水混合，加热至20℃后搅拌，提取24小时，得到绿茶提取物；
(b)原材料混合：在步骤(a)的提取液中，以100ml绿茶提取物计，加入10g麦芽糖、20g硫酸铵，在80℃下灭菌30min；
(5)澄清处理：将步骤(4)所得到的发酵产物进行精滤得到上清液；
(6)灭菌：将步骤(5)中的上清液在80℃下灭菌30min得到绿茶发酵滤液。
(二)理化检测
1)采用与实施例1相同的方法进行DPPH自由基清除水平的测定，线性回归曲线如图3所示，根据线性回归方程计算IC50，结果表明绿茶发酵滤液稀释至0.0030％后DPPH抑制率可以达到50％。
2)采用与实施例1相同的方法进行酪氨酸酶抑制率水平的测试，实验结果见下表：
| 组别 | 项目 | 浓度 | 酪氨酸酶抑制率 |
| 1 | 绿茶发酵液 | 原液 | 87.26％ |
| 2 | 熊果苷 | 500mg/kg | 86.56％ |
实验结果表明，绿茶发酵滤液酪氨酸酶的抑制率为87.26％，高于500mg/kg的熊果苷样品。
实施例4
(一)绿茶发酵滤液的制备
采用如下方法制备得到绿茶发酵滤液：
(1)菌种活化：挑取酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)菌落一环放入含有1重量％酵母膏、2重量％蛋白胨、2重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化；
(2)菌种纯化：将步骤(1)活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落；
(3)菌种扩大化培养：挑取步骤(2)平板中单个菌落接种至含有1重量％酵母膏、2重量％蛋白胨、2重量％葡萄糖的YPD液体培养基中，28℃下摇床培养，当OD＝1.0时，即菌种处于对数期时，得到发酵菌菌液；
(4)接种发酵：将50g步骤(3)的发酵菌菌液加入到含有绿茶提取物、果糖、酪蛋白及大豆分离蛋白的混合液中，在30℃下摇床培养48h；
所述混合液的制备方法包含下述步骤：
(a)绿茶浸泡液：将1g绿茶与500ml水混合，加热至40℃后搅拌，提取12小时，得到绿茶提取物；
(b)原材料混合：在步骤(a)的提取液中，以100ml绿茶提取物计，加入10g果糖、10g酪蛋白及15g大豆分离蛋白，在60℃下灭菌240min；
(5)澄清处理：将步骤(4)所得到的发酵产物进行精滤得到上清液；
(6)灭菌：将步骤(5)中的上清液在115℃下灭菌15min得到绿茶发酵滤液。
(二)理化检测
1)采用与实施例1相同的方法进行DPPH自由基清除水平的测定，线性回归曲线如图4所示，根据线性回归方程计算IC50，结果表明绿茶发酵滤液稀释至0.0030％后DPPH抑制率可以达到50％。
2)采用与实施例1相同的方法进行酪氨酸酶抑制率水平的测试，实验结果见下表：
| 组别 | 项目 | 浓度 | 酪氨酸酶抑制率 |
| 1 | 绿茶发酵液 | 原液 | 91.25％ |
| 2 | 熊果苷 | 500mg/kg | 86.53％ |
实验结果表明，绿茶发酵滤液酪氨酸酶的抑制率为91.25％，高于500mg/kg的熊果苷样品。
实施例5应用实施例美白功效评价方案
1.实验原理
人体实验，由特定实验人群组成受试群体，测试受试者使用化妆品(以及化妆品功效成分)前后皮肤黑色素以及红斑的变化，从而确定化妆品(或功效成分)的美白功效。
2.实验仪器及样品
实验仪器：德国CK公司的皮肤黑色素和血红素测试仪
MX18。
样品：茶提取物(组方1)-以下简称样品1组，所述茶提取物纯度≥95％，由浙江天草生物科技股份有限公司提供
发酵茶提取物(组方2)-以下简称样品2组
其中空白组、样品1组和样品2组的组分如下表1所示：
表1空白组、样品1组和样品2组的组分
| 样品1组 | 样品2组 | 空白组 |
| 甘油 | 甘油 | 甘油 |
| 丁二醇 | 丁二醇 | 丁二醇 |
| GTCC | GTCC | GTCC |
| 混醇 | 混醇 | 混醇 |
| 单甘脂 | 单甘脂 | 单甘脂 |
| IPM | IPM | IPM |
| 0100 | 0100 | 0100 |
| 绿茶浸泡液 | 绿茶发酵滤液 | --- |
其中，上表中所示IPM是指肉豆蔻酸异丙酯；
所述0100是指复配防腐剂。
3.实验人群和测试时间
受试者共计23人，具体性别构成和年龄构成随机确定。期间若有2人出现不良反应，则终止测试；结果未发现不良反应。
测试时间：2016年10-11月。
4.实验方法
1)选择受试者左、右手臂依次循环标记：受试样品区域和空白对照区域；
2)技术人员使用皮肤黑色素和血红素测试仪
MX18测量空白对照区域5次，取平均值，记为空白值；
其中，所述皮肤黑色素和血红素测试仪
MX18的工作原理为：基于光谱吸收的原理，通过测定特定波长的光照在人体皮肤上后的反射量来确定皮肤中黑色素和血红素的含量。仪器探头的发射器发出波长分别为568nm、660nm和880nm三种波长的光照射在皮肤表面，接收器测得皮肤反射的光，由于发射光的量是一定的，因此就可以测出被皮肤吸收的光的量，测出皮肤和色素和血红素的含量。
3)在受试者实验部位涂抹样品，依次使用：茶提取物(组方1)、发酵茶提取物(组方2)；
4)受试者在连续使用化妆品一周、两周、四周后，由技术人员使用皮肤黑色素和血红素测试仪
MX18测量5次，取平均值；
5)统计测得的数值，分析其黑色素及血红素变化规律。
5.结果分析
在测试周期内，本次测试项目共筛选23人纳入研究，且受试人群中未出现明显的全身不良反应或3级以上的皮肤刺激，故本次测试的有效志愿者人数为23人。
1)黑色素的变化
黑色素变化反应在测试周期内，实验区域黑色素随时间变化的规律，其值越小，黑色素越小，反之，黑色素越大。下表2是样品使用前后皮肤黑色素值的统计结果。
表2样品使用前后皮肤黑色素值的统计结果(n＝23)
由上表及图5可以看出，在测试周期内，受试者使用样品后，皮肤黑色素值呈下降趋势，其中，在一周内样品1组相对起始值存在无显著性差异(p大于0.05)其他各时间段样品1组相对起始值黑色素值均存在显著性差异(p<0.05)；对于样品2组，在各时间段内相对于起始值黑色素值均存在显著性差异(p＜0.05)。
应用SPSS20软件对数据组进行统计学分析，其结果符合正态分布，采用单因素方差分析对数据进行研究显著性分析：
a.各样品组在使用后的各时间段与空白组相比较，样品1组在使用2周后黑色素值存在明显地差异性(p<0.05)、样品2组在各时间段黑色素值存在明显地差异性(p<0.05)，黑色素明显降低；各样品组4周内清除黑色素效果明显，且持续性佳。
b.各样品组在使用后的各时间段相比较，样品1组与样品2组样品的黑色素值无明显地差异性(p>0.05)，但使用后各时间段样品2组黑色素值低于样品1组。
2)黑色素相对减少率
黑色素相对减少率，即相对减少率＝(涂抹前黑色素数值—空白/样品组黑色素数值)/涂抹前黑色素数值；此值越大，说明试验样品相对未处理皮肤的美白效果越明显。
实验测出的结果如图6所示，相对涂抹前，从1周开始到4周结束，样品使用后黑色素减少效果明显，且相对减少率一直为正值。并且，样品2组的黑色素相对减少值比样品1组的黑色素相对减少值大，说明此方法所得到的绿茶发酵滤液美白效果明显。
3.血红素(红斑)的变化
血红素(红斑)变化反映在测试周期内，实验区域血红素(红斑)随时间变化规律。其值越小，血红素(红斑)越小，反之，血红素(红斑)越大。下表3是样品使用前后皮肤血红素(红斑)值的统计结果。
表3样品使用前后皮肤血红素(红斑)值的统计结果(n＝23)
由表3及图7可以看出，在测试周期内，受试者使用样品后，皮肤血红素(红斑)值呈下降趋势，其中，样品2组的血红素(红斑)值比样品1组的血红素(红斑)值低。
相对于起始值，在各个时间段内样品1组不存在显著性差异(p＞0.05)，样品2组均存在显著性差异(p＜0.05)。
应用SPSS20软件对数据组进行统计学分析，其结果符合正态分布，采用单因素方差分析对数据进行研究显著性分析：
a.各样品组在使用后的4周时间段与空白组相比较，样品1组的血红素(红斑)值差异性(p>0.05)不明显，但样品2组在使用2周后，血红素(红斑)值差异性(p<0.05)明显，血红素(红斑)值显著降低，样品2组的消炎效果明显；
b.样品1组与样品2组在使用后各时间段相比较，无显著性差异(p>0.05)。
4.血红素相对减少率
血红素相对减少率，即相对减少率＝(涂抹前血红素值—空白/样品组血红素数值)/涂抹前血红素数值；此值越大，说明试验样品相对未处理皮肤的消炎效果越明显。
从图8可以看出，相对涂抹前，从1周开始到4周结束，样品使用后血红素减少效果明显，且相对减少率一直为正值。
综上所述，各样品组受试者皮肤黑色素、血红素(红斑)呈下降趋势，明显低于使用前，实验组皮肤黑色素、血红素(红斑)明显低于空白基质组，但样品2组的皮肤黑色素、血红素(红斑)明显低于样品1组，说明本发明的绿茶发酵滤液消除黑色素及消炎作用明显，且在4周内持续消除黑色素、血红素(红斑)能力好，说明本发明的绿茶发酵滤液可直接用作护肤品。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (23)
1.一种绿茶发酵滤液，其特征在于，其为包含绿茶提取物、碳源、氮源和酵母菌的原料混合物的发酵培养产物；
其中，所述酵母菌选自于酿酒酵母Z2.1或酿酒酵母FX-2中的一种，所述酿酒酵母Z2.1的保藏编号为CCTCC NO:M205127，所述酿酒酵母FX-2的保藏编号为CCTCC NO:M2016418；
所述绿茶提取物包含将绿茶与水按质量比为1：10-1000进行混合，然后进行提取的步骤，所述提取温度为20-100℃，所述提取时间为2-24h。
2.根据权利要求1所述的绿茶发酵滤液，其中，相对于100ml绿茶提取物，所述氮源为0.5-20g，所述碳源为0.5-20g，所述酵母菌的菌液为5-50g。
3.根据权利要求1所述的绿茶发酵滤液，其中，所述碳源选自于葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖中的一种。
4.根据权利要求2所述的绿茶发酵滤液，其中，所述碳源选自于葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖中的一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的绿茶发酵滤液，其中，所述氮源选自于硫酸铵、氯化铵、酪蛋白、奶粉和大豆分离蛋白中的一种或两种。
6.一种权利要求1-5任一项所述的绿茶发酵滤液的制备方法，其包含下述步骤：
（1）菌种活化：酵母菌放入液体培养基中进行活化培养；
（2）菌种纯化：将步骤（1）所述活化后菌液稀释，得到单个菌落；
（3）菌种扩大培养：将步骤（2）所得到的单个菌落接种到液体培养基中进行培养，得到菌液；
（4）接种发酵：将步骤（3）的菌液加入到含有绿茶提取物、碳源和氮源的混合液中，25-35℃下培养；
（5）澄清处理：将步骤（4）所得到的发酵产物过滤得到上清液；
（6）灭菌：将步骤（5）所得到的上清液灭菌得到绿茶发酵滤液；
其中，所述酵母菌选自于酿酒酵母Z2.1或酿酒酵母FX-2中的一种，所述酿酒酵母Z2.1的保藏编号为CCTCC NO:M205127，所述酿酒酵母FX-2的保藏编号为CCTCC NO:M2016418。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在步骤（1）和步骤（3）中所述的液体培养基为YPD液体培养基。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述YPD液体培养基的组分包含0.9重量%-1重量%的酵母膏，1.5重量%-2重量%蛋白胨和1.8重量%-2重量%葡萄糖。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在步骤（3）中，所述的培养是在28-35℃下摇床培养，至其菌种处在对数期时得到菌液。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在步骤（3）中，所述的培养是在28-35℃下摇床培养，至其菌种处在对数期时得到菌液。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤（3）中，所述的培养是在28-35℃下摇床培养，至其菌种处在对数期时得到菌液。
12.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在步骤（3）中，所述的培养是在28-32℃下摇床培养。
13.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在步骤（3）中，所述的培养是在28-30℃下培养。
14.根据权利要求6-13任一项所述的制备方法，其中，在步骤（4）中，以100ml绿茶提取物计，所述氮源为0.5-20g，所述碳源为0.5-20g，所述酵母菌的菌液为5-50g。
15.根据权利要求6-13任一项所述的制备方法，其中，在步骤（4）中，所述混合液进行灭菌，所述的灭菌温度为60-115℃，所述的灭菌时间为15-240min。
16.根据权利要求6-13任一项所述的制备方法，其中，在步骤（4）中，所述培养为摇床培养，所述摇床转速为160-200rpm/min，所述培养时间为24-96小时。
17.根据权利要求6-13任一项所述的制备方法，其中，在步骤（6）中，所述灭菌时间为5s-240min，所述灭菌温度为60-115℃。
18.根据权利要求6-13任一项所述的制备方法，其中，在步骤（6）中，所述灭菌为超高温瞬时灭菌。
19.权利要求1-5任一项所述的绿茶发酵滤液或权利要求6-18任一项所述方法制备的绿茶发酵滤液在化妆品中的应用。
20.权利要求1-5任一项所述的绿茶发酵滤液或权利要求6-18任一项所述方法制备的绿茶发酵滤液在护肤品中的应用。
21.一种化妆品，其含有权利要求1-5任一项所述的绿茶发酵滤液或权利要求6-18任一项所述方法制备得到的绿茶发酵滤液。
22.权利要求1-5任一项所述的绿茶发酵滤液或权利要求6-18任一项所述方法制备的绿茶发酵滤液在食品中的应用。
23.一种食品，其含有权利要求1-5任一项所述的绿茶发酵滤液或权利要求6-18任一项所述方法制备得到的绿茶发酵滤液。
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