CN115414300B - 一种具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液及其制备方法和应用，涉及生物发酵技术领域。本发明所述绿茶复合发酵液的制备方法包括如下步骤：(1)将绿茶粉、金盏花粉加入发酵基质中，得到发酵培养基；所述绿茶粉和金盏花粉的质量比为(2～6)：1；(2)将干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液接种至发酵培养基中，发酵至pH值降至3～4时发酵完成，得到粗发酵液，对粗发酵液进行灭菌、过滤处理，得到所述绿茶复合发酵液。本发明通过使用干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液对绿茶和金盏花进行发酵，制得的绿茶复合发酵液兼具良好的抗氧化、控油以及收缩毛孔功效。

Description

一种具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液及其 制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液及其制备方法和应用。

背景技术

茶多酚是茶叶或茶饮料中的重要活性成分，是茶叶中酚类及其衍生物的总称，茶多酚主要包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮及黄酮醇类、酚酸及缩酚酸类等化合物。茶多酚是重要的天然抗氧化剂，并且具有一定的控油作用。

金盏花含有抗坏血酸、叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮等生理活性成分，金盏花同样具有抗氧化特性。

目前已有部分护肤产品通过添加茶叶或金盏花来提高产品的抗氧化功效，但其抗氧化功效有限，并且无法持久控油。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有抗氧化、持久控油以及收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液及其制备方法和应用，所述绿茶复合发酵液的制备方法简单，适合工业化生产。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

一种具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将绿茶粉、金盏花粉加入至发酵基质中，得到发酵培养基；所述绿茶粉和金盏花粉的质量比为(2～6)：1；

(2)将干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液接种至所述发酵培养基中，发酵至pH值降至3～4时发酵完成，得到粗发酵液，对所述粗发酵液进行灭菌、过滤处理，得到所述绿茶复合发酵液。

本发明采用共生发酵的方式对绿茶和金盏花进行发酵，极大地提高了细胞破壁率及有效物质的浸出率，并且绿茶发酵物及金盏花发酵物可相互作用，协同提升绿茶复合发酵液的抗氧化、控油及收缩毛孔的功效。此外，实验发现，绿茶复合发酵液的pH值对其性能具有极大的影响，本发明通过对发酵液的pH值进行研究，发现仅当pH值为3～4时，才能保证所述绿茶复合发酵液兼具良好的抗氧化、控油、收缩毛孔功效。

本发明中干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的制备方法如下：

制备菌悬液：将干酪乳杆菌种和植物乳杆菌种分别溶于无菌水中，得到干酪乳杆菌悬液和植物乳杆菌悬液；干酪乳杆菌在干酪乳杆菌悬液中的质量浓度为0.01％～2％，植物乳杆菌在植物乳杆菌悬液中的质量浓度为0.01％～2％；优选地，所述干酪乳杆菌、植物乳杆菌在菌悬液中的质量浓度为1％。

制备活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌：将干酪乳杆菌悬液、植物乳杆菌悬液分别接种于固体培养基活化培养，得到活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌；活化培养的温度为28～40℃，活化培养时间为24～72h，每1L固体培养基中干酪乳杆菌悬液的移取量为10～50μL、植物乳杆菌悬液的移取量为10～50μL；优选地，所述固体培养基为MRS固体培养基，活化培养的温度为37℃，活化培养时间为48h，菌悬液的移取量为30μL。

制备干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液：通过接种环将活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌分别接种至种子培养基中进行培养，在28～40℃、发酵摇瓶的转速为100～300r/min的条件下培养24～96h，得到干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液；优选地，所述种子培养基为MRS液体培养基，在37℃、发酵摇瓶的转速为180r/min的条件下培养48h。

优选地，步骤(1)中，所述发酵培养基中绿茶粉和金盏花粉的质量比为(2～4)：1。当绿茶粉和金盏花粉的配比超出上述范围时，所述绿茶复合发酵液的质量浓度为0.1％的日用化妆品或护肤品的DPPH抑制率无法达到50％，抗氧化效果明显更差。

进一步优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基中绿茶粉和金盏花粉的质量比为(2～2.4)：1。当两者的配比满足上述限定时，所述绿茶复合发酵液的质量浓度为1％的日用化妆品或护肤品的DPPH抑制率可以达到90％以上，具有优良的抗氧化性能，并且具有良好的持久控油性能以及收缩毛孔功效。

优选地，所述绿茶粉、金盏花粉在所述发酵培养基中的总质量浓度为1％～3％；进一步优选地，所述绿茶粉、金盏花粉在所述发酵培养基中的总质量浓度为2％。当绿茶粉和金盏花粉的添加量落入上述范围内时，发酵效果更好，绿茶复合发酵液具有更好的抗氧化、控油以及收缩毛孔性能。

优选地，所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的浓度分别为1×10⁷cfu/mL～1×10⁹cfu/mL；所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种量分别为1％～2％(干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的添加量占发酵培养基的质量分数)；进一步优选地，所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的浓度分别为1×10⁸cfu/mL；所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液接种至所述发酵培养基中的质量比为(1～2)：(1～2)，进一步优选地，所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液接种至所述发酵培养基中的质量比为1:1，当两者的配比符合上述限定时，共同发酵的效果明显更好，制备出的复合发酵液的抗氧化、控油以及收缩毛孔的性能相对更优。

优选地，所述发酵基质包含氮源、碳源、无机盐；所述氮源为铵盐、蛋白胨中的至少一种，所述氮源在发酵基质中的质量浓度为0.5％～3％；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖中的至少一种，所述碳源在发酵基质中的质量浓度为0.5％～3％；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐中的至少一种，所述无机盐在发酵基质中的质量浓度为0.05％～0.5％；所述绿茶为毛峰、碧螺春、龙井、蒙顶甘露、六安瓜片、毛尖、云雾、猴魁、雀舌、雪芽中的至少一种。进一步优选地，所述氮源在发酵基质中的质量浓度为1％；所述碳源在发酵基质中的质量浓度为1％；所述无机盐在发酵基质中的质量浓度为0.1％。

优选地，步骤(2)中，所述灭菌处理的方法为：在90～125℃下保温10～40min；所述过滤处理的方法为：将粗发酵液用板框压滤机过滤，然后依次以25μm、2.5μm、0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。

此外，本发明还提供了一种由上述方法制备而成的具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液以及所述绿茶复合发酵液在化妆品中的应用，所述绿茶复合发酵液在化妆品中的质量浓度为1％～10％。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过以干酪乳杆菌和植物乳杆菌对绿茶和金盏花进行发酵，对发酵条件以及绿茶和金盏花的配比进行选择，使得两者的发酵产物可以协同作用，显著提升绿茶复合发酵液的抗氧化、持久控油以及收缩毛孔的性能。适合应用于多种日用化妆品以及护肤品中。

附图说明

图1为实施例和对比例所述绿茶复合发酵液质量浓度为0.1％时的DPPH抑制率测试图；

图2为实施例和对比例所述绿茶复合发酵液质量浓度为1％时的DPPH抑制率测试图；

图3为实施例和对比例所述绿茶复合发酵液质量浓度为3％时的DPPH抑制率测试图；

图4为以实施例和对比例所述绿茶复合发酵液制备的面膜使用0.5h后皮肤油脂含量变化率图；

图5为以实施例和对比例所述绿茶复合发酵液制备的面膜使用1h后皮肤油脂含量变化率图；

图6为以实施例和对比例所述绿茶复合发酵液制备的面膜使用3h后皮肤油脂含量变化率图；

图7为以实施例和对比例所述绿茶复合发酵液制备的面膜收缩毛孔效果测试图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例及对比例中使用的发酵菌种购于广东省微生物菌种保藏中心：干酪乳杆菌(GDMCC 1.159)和植物乳杆菌(GDMCC 1.1516)。

MRS固体培养基的制备方法：将10g蛋白陈、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉混合，蒸馏水加至1L，在120℃下灭菌20min后贮存备用。

MRS液体培养基的制备方法：将10g蛋白陈、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰混合，蒸馏水加至1L，在120℃下灭菌20min后贮存备用。

实施例1

本发明所述绿茶复合发酵液的一种实施例，本实施例所述绿茶复合发酵液的制备方法如下：

(1)制备种子发酵液：将干酪乳杆菌种和植物乳杆菌种分别溶于无菌水中，得到干酪乳杆菌质量浓度为1％的干酪乳杆菌悬液和植物乳杆菌质量浓度为1％的植物乳杆菌悬液；各取30μL干酪乳杆菌悬液和植物乳杆菌悬液分别接种于MRS固体培养基中，在37℃的条件下活化培养48h，得到活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌。通过接种环将活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌分别接种至MRS液体培养基中，在37℃、发酵摇瓶的转速为180r/min的条件下培养48h，得到干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液，干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液的浓度分别为1×10⁸cfu/mL。

(2)制备发酵培养基：将大豆蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁溶于水中，混合均匀，得到发酵基质；所述大豆蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁在发酵基质中的质量浓度分别为1％、1％、0.1％。将1.4kg毛峰绿茶、0.6kg金盏花分别用粉碎机打碎，过80目筛网，得到绿茶粉和金盏花粉。将绿茶粉和金盏花粉注入至98kg发酵基质中，使绿茶、金盏花在发酵培养基中的总质量浓度为2％。将发酵罐密闭，升温至121℃，保持30min进行灭菌处理，降温至室温，得到发酵培养基。

(3)制备绿茶复合发酵液：将干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液加入至发酵培养基中，在37℃下搅拌，搅拌桨的转速为180r/min。待发酵至pH值为3.7时完成发酵，得到粗发酵液。干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种量分别为3％(干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的添加量占发酵培养基的质量分数)。利用巴氏灭菌法对粗发酵液中的微生物进行灭菌处理。灭菌处理温度为90℃，灭菌处理时间为10min。待粗发酵液完成灭菌后，利用板框压滤机对灭菌后的粗发酵液过滤，所得滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到绿茶复合发酵液。

实施例2～8

实施例2～8为本发明所述绿茶复合发酵液，其制备方法与实施例1相同，仅步骤(2)中使用的毛峰绿茶和金盏花的用量、绿茶的种类或发酵完成时的pH值不同，具体如表1所示：

表1

实施例9

本发明所述绿茶复合发酵液的一种实施例，本实施例所述绿茶复合发酵液的制备方法如下：

(1)制备种子发酵液：将干酪乳杆菌种和植物乳杆菌种分别溶于无菌水中，得到干酪乳杆菌质量浓度为1.5％的干酪乳杆菌悬液和植物乳杆菌质量浓度为1.5％的植物乳杆菌悬液；各取20μL干酪乳杆菌悬液和植物乳杆菌悬液分别接种于MRS固体培养基中，在32℃的条件下活化培养72h，得到活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌。通过接种环将活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌分别接种至MRS液体培养基中，在30℃、发酵摇瓶的转速为300r/min的条件下培养52h，得到干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液，干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液的浓度分别为1×10⁷cfu/mL。

(2)制备发酵培养基：将胰蛋白胨、蔗糖、磷酸氢二钾溶于水中，混合均匀，得到发酵基质；所述胰蛋白胨、蔗糖、磷酸氢二钾在发酵基质中的质量浓度分别为2％、1.5％和0.2％。将0.7kg毛峰绿茶、0.3kg金盏花分别用粉碎机打碎，过70目筛网，得到绿茶粉和金盏花粉，将绿茶粉和金盏花粉注入至99kg发酵基质中，使绿茶、金盏花在发酵培养基中的总质量浓度为1％。将发酵罐密闭，升温至122℃，保持30min进行灭菌处理，降温至室温，得到发酵培养基。

(3)制备绿茶复合发酵液：将干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液加入至发酵培养基中，在37℃下搅拌，搅拌桨的转速为250r/min。待发酵至pH值为3.5时完成发酵，得到粗发酵液。干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种量分别为2％(干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的添加量占发酵培养基的质量分数)。利用巴氏灭菌法对粗发酵液中的微生物进行灭菌处理。灭菌处理温度为100℃，灭菌处理时间为40min。待粗发酵液完成灭菌后，利用板框压滤机对灭菌后的粗发酵液过滤，所得滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到绿茶复合发酵液。

实施例10

本发明所述绿茶复合发酵液的一种实施例，本实施例所述绿茶复合发酵液的制备方法如下：

(1)制备种子发酵液：将干酪乳杆菌种和植物乳杆菌种分别溶于无菌水中，得到干酪乳杆菌质量浓度为0.5％的干酪乳杆菌悬液和植物乳杆菌质量浓度为0.5％的植物乳杆菌悬液；各取50μL干酪乳杆菌悬液和植物乳杆菌悬液分别接种于MRS固体培养基中，在38℃的条件下活化培养36h，得到活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌。通过接种环将活化的干酪乳杆菌和植物乳杆菌分别接种至MRS液体培养基中，在36℃、发酵摇瓶的转速为100r/min的条件下培养72h，得到干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液，干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液的浓度分别为1×10⁹cfu/mL。

(2)制备发酵培养基：将硫酸铵、果糖、磷酸氢二钾溶于水中，混合均匀，得到发酵基质；所述硫酸铵、果糖、磷酸氢二钾在发酵基质中的质量浓度分别为3％、0.5％和0.3％。将2kg毛峰绿茶、1kg金盏花分别用粉碎机打碎，过90目筛网，得到绿茶粉和金盏花粉。将绿茶粉和金盏花粉注入至99kg发酵基质中，使绿茶、金盏花在发酵培养基中的总质量浓度为3％。将发酵罐密闭，升温至115℃，保持40min进行灭菌处理，降温至室温，得到发酵培养基。

(3)制备绿茶复合发酵液：将干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液加入至发酵培养基中，在38℃下搅拌，搅拌桨的转速为250r/min。待发酵至pH值为3.8时完成发酵，得到粗发酵液。干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种量分别为1％(干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的添加量占发酵培养基的质量分数)。利用巴氏灭菌法对粗发酵液中的微生物进行灭菌处理。灭菌处理温度为115℃，灭菌处理时间为30min。待粗发酵液完成灭菌后，利用板框压滤机对灭菌后的粗发酵液过滤，所得滤液再依次经过25μm、2.5μm及0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到绿茶复合发酵液。

对比例1

一种绿茶复合提取液，所述绿茶复合发酵液的制备方法如下：

分别称取1.4kg毛峰绿茶和0.6kg金盏花，用粉碎机将其粉碎，过80目筛网，然后加入98kg水中，在80℃、180r/min的条件下提取48h，得到粗提取液。提取完成后利用板框压滤机对粗提取液过滤，所得滤液再依次经过25μm、2.5μm、0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到复合提取液。

对比例2～10

对比例2～10为绿茶复合发酵液，所述绿茶复合发酵液的制备方法与实施例1相同，仅茶的种类、茶与金盏花的配比、干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液在发酵培养基中的质量浓度或发酵完成时的pH值不同，具体如表2所示：

表2

对实施例1～10、对比例1～10所述绿茶复合发酵液、复合提取液进行性能测试：

1、抗氧化性能测试

利用DPPH法测试实施例和对比例所述绿茶复合发酵液、复合提取液对自由基的清除效果。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，具有单电子，在517nm处有一强吸收，其无水乙醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

测试方法：

按以下表3依次加样，其中，DPPH-乙醇溶液由以下步骤制备得到：称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(Macklin，纯度>96％)12mg溶解于无水乙醇中，加入乙醇定容至250mL棕色容量瓶。DPPH-乙醇溶液临用时现配。样品溶液为质量浓度分别为0.1％、1％、3％的绿茶复合发酵液(复合提取液)的水溶液。

表3

扫描C-DPPH组的最大吸收波长，在最大吸收波长处检测吸光度值。测量结果显示，溶液在517nm处有最大吸收峰。将各支试管反应溶液混匀后，移入3cm比色皿中，测量每组溶液在517nm的吸光度。

清除率计算公式为：

式中：

T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；

T₀—样品本底吸光值；

C—DPPH管吸光值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；

C₀—溶剂本底吸光值。

测试结果取三次测量平均值，记录在表4中。

表4

由表4可知，实施例1～10对DPPH的抑制率效果优于对比例1～10，表明本发明所述绿茶复合发酵液具有良好的抗氧化功效。对比例1水提获取绿茶和金盏花中的功效成分，得到的复合提取液的抗氧化性能不如发酵后的绿茶复合发酵液。对比例2～3分别使用了干酪乳杆菌和植物乳杆菌进行发酵，得到的产物的抗氧化性能明显不如以干酪乳杆菌和植物乳杆菌共生发酵得到的发酵液。对比例4对红茶和金盏花进行发酵处理，其抗氧化功效也明显不如以绿茶和金盏花进行发酵得到的发酵产物。对比例5、对比例6分别以毛峰绿茶和金盏花为原料进行发酵，当绿茶复合发酵液的质量浓度为0.1％时，DPPH抑制率仅为以毛峰绿茶和金盏花复合发酵得到的发酵产物的50％，该结果表明，绿茶和金盏花之间存在协同作用，两者共同发酵的抗氧化效果优于单一一种植物的发酵效果。对比例7中毛峰绿茶和金盏花的质量配比不在本发明限定的范围内，抗氧化功效急剧衰减。对比例8～9发酵终止pH值不在3～4范围内，当pH值过高时，说明发酵还未完成，绿茶和金盏花中的活性成分还没释放在发酵液中，影响最终产品的功效，当pH值过低，说明发酵过度，发酵液中的植物乳杆菌和干酪乳杆菌容易发生细胞自溶，消耗发酵液中产生的活性物质。对比例10中干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种质量比不在(1～2):(1～2)范围内，植物乳杆菌的接种量过多，影响干酪乳杆菌的增长，降低了共同发酵的效果，从而影响发酵液的抗氧化效果。图1～3为实施例和对比例所述绿茶复合发酵液(复合提取液)的质量浓度分别为0.1％、1％、3％时的DPPH抑制率测试结果图，从图中可以直观地看到，实施例1～10的抗氧化功效均优于对比例1～10，并且当绿茶复合发酵液(复合提取液)的质量浓度为0.1％时，抗氧化功效的差异更为明显。

此外，对比实施例1～4的测试结果可以发现，以毛峰绿茶和金盏花为原料发酵得到的绿茶复合发酵液的抗氧化性能相对更好。对比实施例1与实施例5～6的测试结果可以发现，发酵终止时的pH值会影响绿茶复合发酵液的功效，pH值为3.7时发酵产物的抗氧化性能最优。此外，对比实施例1与实施例7～8的测试结果可以发现，绿茶与金盏花的配比对发酵产物的性能影响较大，当绿茶和金盏花的质量比为(2～2.4)：1时，抗氧化性能相对更好。

2、控油测试

样品处理：制备样品面膜，用去离子水将实施例1～10和对比例1～10的绿茶复合发酵液或复合提取液配制成质量浓度为1％的水溶液，取2mL水溶液加入到面积约为4cm*7cm的无纺布上，使无纺布均匀润湿，得到待测样品。空白对照以去离子代替绿茶复合发酵液。

测试仪器：皮肤油脂测试仪(Sebumeter SM815)。

使用方法：选取18～45岁、皮肤油脂分泌旺盛的志愿者200名(每一样品10个人使用)，样品及空白对照区按测试区域随机分布于志愿者左前额或右前额的区域，空白对照测试区域不使用任何样品。志愿者洁面后，取各待测面膜在相应检测区域贴敷5分钟后取下，待其自然吸收，在此后的3小时内不得碰触检测部位。在洁面后立即、使用第0.5小时、使用第1小时、使用第3小时对各检测区域进行皮肤油脂含量测试，数据记为初始值、0.5h、1h、3h。每个样品重复测试5次，取平均值。皮肤油脂含量值越大，表示皮肤油脂越多。皮肤油脂含量变化率越大，表示皮肤油脂分泌速率越高。

其中，皮肤油脂含量变化率＝(使用后第n个时间点皮肤油脂含量-使用前检测的皮肤油脂含量)/使用前检测的皮肤油脂含量×100％；测试结果如表5所示。

表5

由表5可知，实施例1～10的控油效果优于对比例1，说明本发明所述绿茶复合发酵液的控油效果优于水提法制备得到的复合提取液。实施例1～10的控油效果优于对比例2和3，说明使用干酪乳杆菌和植物乳杆菌共同发酵的效果优于使用单一菌种发酵的效果。实施例1～10的控油效果优于对比例4～6，说明在发酵过程中，绿茶和金盏花之间存在协同作用，两者共同发酵的控油效果优于单一植物的发酵效果，也优于红茶和金盏花共同发酵的效果。实施例1～10的控油效果优于对比例7，说明绿茶和金盏花的质量比影响绿茶复合发酵液的控油功效，结合实施例1、实施例7～8、对比例7的测试结果可知，本发明中绿茶和金盏花的质量比优选为(2～4):1，更优选为7:3。实施例1～10的控油效果优于对比例8～9，说明发酵最终完成时的pH影响了绿茶复合发酵液的功效，发酵完成时pH过高，说明发酵还没完成，绿茶和金盏花中的活性成分还没释放在发酵液中，影响最终产品的功效。发酵完成时pH过低，说明发酵过度，发酵液中的植物乳杆菌和干酪乳杆菌容易发生细胞自溶，消耗发酵液中产生的活性物质。结合实施例1、实施例5～6和对比例8～9的测试结果可知，本发明发酵完成时，发酵液的pH优选为3～4，更优选为3.7。对比例10中干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种质量比不在(1～2):(1～2)范围内，植物乳杆菌的接种量过多，影响干酪乳杆菌的增长，降低了共同发酵的效果，从而影响发酵液的控油效果。图4～6为以实施例和对比例所述绿茶复合发酵液制备的面膜使用0.5h、1h、3h后皮肤油脂含量变化率图，从图中可以看到，实施例1～10的控油效果明显优于对比例，并且具有持久控油性能。

3、收缩毛孔性能测试：

样品处理：制备样品面膜，用去离子水将实施例1～10和对比例1～10的绿茶复合发酵液或复合提取液配制成质量浓度为1％的水溶液，取10mL水溶液加入到面膜用无纺布(聚丙烯材质)上，使无纺布均匀润湿，得到待测样品。空白对照以去离子代替复合发酵液。

测试仪器：Visia皮肤测试仪。

测试方法：选取210名志愿者，选取条件18～45岁，皮肤油脂分泌旺盛，脸部毛孔较粗大(每一样品10个人使用)。志愿者按照要求每两天使用一次样品面膜，每次面膜在脸部停留10～15分钟，连续使用2周。在使用前和使用2周后通过仪器检测皮肤中毛孔的面积占比。皮肤中毛孔面积占比越小，表明皮肤中的毛孔越小，样品的收缩毛孔效果越好。

测试结果如表6所示。

表6

如表6所示，使用以实施例所述绿茶复合发酵液制备的面膜两周后，毛孔面积占比差值均在-0.5以下，说明实施例所述绿茶复合发酵液具有良好的收缩毛孔的作用。对比例1的毛孔面积占比差值为-0.13，说明水提法无法有效提取出植物中的有效成分。对比例2～3的收缩毛孔功效也明显差于实施例，说明使用干酪乳杆菌和植物乳杆菌共同发酵的效果优于使用单一菌种发酵的效果。实施例1～10收缩毛孔的效果优于对比例4～6，说明在发酵过程中，绿茶和金盏花之间存在协同作用，两者共同发酵收缩毛孔的效果优于单一植物的发酵效果，也优于红茶和金盏花共同发酵的效果。实施例1～10收缩毛孔的效果优于对比例7，说明绿茶和金盏花加入的质量比影响绿茶复合发酵液的功效，结合实施例1、实施例7、8、对比例7可知，本发明中绿茶和金盏花加入的质量比优选为(2～4):1，进一步优选为(2～2.4):1，更优选为7:3。实施例1～10的毛孔收缩效果优于对比例8、9，说明发酵最终完成时的pH影响了绿茶复合发酵液的功效，发酵完成时pH过高，说明发酵还没完成，绿茶和金盏花中的活性成分还没释放在发酵液中，影响最终产品的功效。发酵完成时pH过低，说明发酵过度，发酵液中的植物乳杆菌和干酪乳杆菌容易发生细胞自溶，消耗发酵液中产生的活性物质。此外，对比实施例1、实施例5～6和对比例8～9的测试结果可知，本发明发酵完成时，发酵液的pH值优选为3～4，更优选为3.7。对比例10中干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种质量比不在(1～2):(1～2)范围内，植物乳杆菌的接种量过多，影响干酪乳杆菌的增长，降低了共同发酵的效果，从而影响发酵液的收缩毛孔的效果。图7为以实施例和对比例所述绿茶复合发酵液(复合提取液)制备的面膜收缩毛孔效果测试图。从图中可以看到，实施例1～10的收缩毛孔性能明显优于对比例。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但并不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将绿茶粉、金盏花粉加入至发酵基质中，得到发酵培养基；所述绿茶粉和金盏花粉的质量比为(2～6)：1；所述绿茶粉使用的绿茶为毛峰、碧螺春、龙井、蒙顶甘露、六安瓜片、毛尖、云雾、猴魁、雀舌、雪芽中的至少一种；所述绿茶粉、金盏花粉在所述发酵培养基中的总质量浓度为1％～3％；所述发酵基质包含氮源、碳源、无机盐；所述氮源为铵盐、蛋白胨中的至少一种，所述氮源在发酵基质中的质量浓度为0.5％～3％；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖中的至少一种，所述碳源在发酵基质中的质量浓度为0.5％～3％；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐中的至少一种，所述无机盐在发酵基质中的质量浓度为0.05％～0.5％；

(2)将干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液接种至所述发酵培养基中，发酵至pH值降至3～4时发酵完成，得到粗发酵液，对所述粗发酵液进行灭菌、过滤处理，得到所述绿茶复合发酵液；所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的浓度分别为1×10⁷cfu/mL～1×10⁹cfu/mL；所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液的接种量分别为1％～2％；所述干酪乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液接种至所述发酵培养基中的质量比为(1～2)：(1～2)。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基中绿茶粉和金盏花粉的质量比为(2～4)：1。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基中绿茶粉和金盏花粉的质量比为(2～2.4)：1。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述灭菌的方法为：在90～125℃下保温10～40min；所述过滤处理的方法为：将粗发酵液用压滤机过滤，然后依次以25μm、2.5μm、0.8μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。

5.一种具有抗氧化、控油、收缩毛孔功效的绿茶复合发酵液，其特征在于，由如权利要求1～4任一项所述方法制备而成。

6.一种如权利要求5所述绿茶复合发酵液在化妆品中的应用。