CN114933989A - 一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法 - Google Patents
一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114933989A CN114933989A CN202210539777.XA CN202210539777A CN114933989A CN 114933989 A CN114933989 A CN 114933989A CN 202210539777 A CN202210539777 A CN 202210539777A CN 114933989 A CN114933989 A CN 114933989A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus plantarum
- gamma
- aminobutyric acid
- mulberry leaf
- fermentation medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 117
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 title claims abstract description 71
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 title claims abstract description 69
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 title claims abstract description 65
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 title claims abstract description 65
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 62
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 57
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 title claims abstract 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 18
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 12
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 10
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 claims description 10
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 claims description 10
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 claims description 10
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 6
- 238000003892 spreading Methods 0.000 claims description 6
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 abstract 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000218213 Morus <angiosperm> Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001393 triammonium citrate Substances 0.000 description 2
- 235000011046 triammonium citrate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 201000010538 Lactose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010565 inoculated fermentation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
- A23F3/00—Tea; Tea substitutes; Preparations thereof
- A23F3/34—Tea substitutes, e.g. matè; Extracts or infusions thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/169—Plantarum
Abstract
本发明涉及一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ‑氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法，属于发酵技术领域。所述植物乳杆菌YX‑1，拉丁文名称为：Lactobacillusplantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月21日，保藏编号为CGMCC No.24751。本发明的植物乳杆菌利用本发明的发酵培养基可以发酵得到富含γ‑氨基丁酸的发酵液，利用该发酵液可以制备得到富含γ‑氨基丁酸的桑叶茶，为桑叶功能食品的研究寻求了一条新途径。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，尤其涉及一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)，又称4-氨基丁酸、哌啶酸、氨酪酸，分子式为C4H9O2N，相对分子质量为103.12，是一种天然存在的非蛋白质氨基酸。GABA是哺乳动物脑和脊髓中的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能，能够降低血压、治疗癫痫、调节激素分泌、控制哮喘、缓解老年痴呆症及防止动脉硬化等。
植物乳杆菌具有一定的免疫调节作用；对致病菌有抑制作用；降低血清胆固醇含量和预防心血管疾病；维持肠道内菌群平衡；促进营养物质吸收；缓解乳糖不耐症；抑制肿瘤细胞的形成等功效。
桑树在我国已有4000多年的栽培历史，有几百万亩桑园，是世界上最大的桑树种植国。随着农业结构的调整和退耕还林政策的实施，很多地方都种植了桑树，作为特种经济林，桑园面积增加很快。桑叶是桑树的主要产物，每年可摘3～6次，生命力很强，在我国有着极大的资源优势。目前桑叶除养蚕外，出现了大量桑叶过剩的现象，浪费了大量宝贵资源。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构的变化，均在寻求天然、安全、保健性食品，桑叶因其含有丰富的氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素和钙、铁、锰、锌等矿物质，且富含人体所必需多种生物活性成分，而成为天然、价廉物美的功能性食品的理想来源之一，我国国家卫生部于1993年也公布了桑叶为药食两用品。
如何利用植物乳杆菌制备富含γ-氨基丁酸的桑叶茶在现有技术并未公开。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植物乳杆菌YX-1，所述植物乳杆菌YX-1，拉丁文名称为：Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月21日，保藏编号为CGMCCNo.24751。
本发明还提供了一种所述的植物乳杆菌YX-1的发酵培养基，所述发酵培养基以水为溶剂包括如下浓度的组分：
玉米糖化液20～40mL/L、葡萄糖10～14g/L、味精8～12g/L、胰蛋白胨2～4g/L、酵母粉1.5～2.5g/L、丁二酸钠4～6g/L。
作为优选，所述发酵培养基以水为溶剂包括如下浓度的组分：
玉米糖化液25～35mL/L、葡萄糖11～13g/L、味精9～11g/L、胰蛋白胨2.5～3.5g/L、酵母粉1.75～2.25g/L、丁二酸钠4.5～5.5g/L。
作为优选，所述发酵培养基以水为溶剂包括如下浓度的组分：
玉米糖化液30mL/L、葡萄糖12g/L、味精10g/L、胰蛋白胨3g/L、酵母粉2g/L、丁二酸钠5g/L。
本发明还提供了一种利用所述的植物乳杆菌YX-1以及所述的发酵培养基制备富含γ-氨基丁酸的桑叶茶的方法，包括如下步骤：
(1)将所述的植物乳杆菌YX-1接种于所述的发酵培养基中，培养64～96h，得到含有γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1发酵液；
(2)将步骤(1)所述的γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1发酵液接种于桑叶中，揉捻，发酵4～6h，干燥，得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
作为优选，步骤(1)所述接种的植物乳杆菌YX-1的初始活菌浓度为1.0～1.5×109cfu/mL；
所述植物乳杆菌YX-1与发酵培养基的体积比为1～5:100；
步骤(1)所述培养的温度为35～39℃。
作为优选，步骤(2)所述桑叶为新鲜桑叶经过杀青处理，初步揉捻后的桑叶；
所述杀青处理为：将新鲜桑叶切成宽0.5～0.8cm的条状，摊晾8～12h后，蒸汽杀青2～3min。
作为优选，步骤(2)所述接种植物乳杆菌YX-1发酵液的体积与新鲜桑叶的质量比为10～15mL：100g；
步骤(2)所述发酵的温度为33～37℃。
作为优选，步骤(2)所述干燥的温度为95～105℃；
所述干燥的时间为1～2h。
本发明还提供了所述的方法制备得到的富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
本发明提供了一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法。本发明的菌株和制备方法具有如下优点：
(1)本发明的植物乳杆菌利用本发明的发酵培养基可以发酵得到富含γ-氨基丁酸的发酵液，利用该发酵液可以制备得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶，为桑叶功能食品的研究寻求了一条新途径；
(2)按照上述方法得到的γ-氨基丁酸的桑叶茶中含有的γ-氨基丁酸的含量丰富。
保藏说明
所述植物乳杆菌YX-1，拉丁文名称为：Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月21日，保藏编号为CGMCC No.24751。
具体实施方式
本发明提供了一种植物乳杆菌YX-1，所述植物乳杆菌YX-1，拉丁文名称为：Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月21日，保藏编号为CGMCCNo.24751。
本发明还提供了一种所述的植物乳杆菌YX-1的发酵培养基，所述发酵培养基以水为溶剂包括如下浓度的组分：
玉米糖化液20～40mL/L，优选为25～35mL/L，进一步优选为30mL/L；
葡萄糖10～14g/L，优选为11～13g/L，进一步优选为12g/L；
味精8～12g/L，优选为9～11g/L，进一步优选为10g/L；
胰蛋白胨2～4g/L，优选为2.5～3.5g/L，进一步优选为3g/L；
酵母粉1.5～2.5g/L，优选为1.75～2.25g/L，进一步优选为2g/L；
丁二酸钠4～6g/L，优选为4.5～5.5g/L，进一步优选为5g/L。
本发明还提供了一种利用所述的植物乳杆菌YX-1以及所述的发酵培养基制备富含γ-氨基丁酸的桑叶茶的方法，包括如下步骤：
(1)将所述的植物乳杆菌YX-1接种于所述的发酵培养基中，培养64～96h，得到含有γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1发酵液；
(2)将步骤(1)所述的γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1发酵液接种于桑叶中，揉捻，发酵4～6h，干燥，得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
在本发明中，步骤(1)所述接种的植物乳杆菌YX-1为活化后的植物乳杆菌YX-1；所述活化的方法为：将植物乳杆菌YX-1斜面菌株接种于MRS培养基中，35～39℃活化培养18～22h。所述MRS培养基包括如下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、牛肉膏粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温-801.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L；所述活化培养的温度优选为37℃；所述活化培养的时间优选为20h。
在本发明中，步骤(1)所述接种的植物乳杆菌YX-1的初始活菌浓度为1.0～1.5×109cfu/mL，优选为1.25×109cfu/mL；所述植物乳杆菌YX-1与发酵培养基的体积比为1～5:100，优选为2.5:100；步骤(1)所述培养的温度为35～39℃，优选为37℃。步骤(1)所述培养的时间优选为74～86h，进一步优选为80h。
在本发明中，步骤(2)所述桑叶为新鲜桑叶经过杀青处理，初步揉捻后的桑叶；所述杀青处理为：将新鲜桑叶切成宽0.5～0.8cm的条状，摊晾8～12h后，蒸汽杀青2～3min。所述新鲜桑叶宽优选为0.65cm，所述摊晾的时间优选为10h，所述蒸汽杀青的时间优选为2.5min。所述初步揉捻的时间为30min。
在本发明中，步骤(2)所述接种植物乳杆菌YX-1发酵液的体积与新鲜桑叶的质量比为10～15mL:100g，优选为12.5mL:100g；所述揉捻的间为1min。步骤(2)所述发酵的温度为33～37℃，优选为35℃；所述发酵的时间优选为5h。在本发明中，步骤(2)所述干燥为烘干；所述干燥的温度为95～105℃，优选为100℃；所述干燥的时间为1～2h，优选为1.5h。
本发明还提供了所述的方法制备得到的富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所述的MRS培养基的制备方法为：
取600mL水，加入10g蛋白胨、4g酵母浸粉、5g牛肉膏粉、20g葡萄糖、1g吐温-80、2g磷酸二氢钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰，之后用水定容至1000mL。121℃，灭菌30min得到MRS培养基。
实施例1
挑取斜面植物乳杆菌YX-1，接种于装有100mLMRS培养基的250mL的三角瓶中，35℃活化培养20h，得到活菌数为1.2×109cfu/mL的植物乳杆菌YX-1，备用。
每升发酵培养基的制备：取600mL水，加入40mL玉米糖化液、13g葡萄糖、8g味精、4g胰蛋白胨、1.5g酵母粉、5g丁二酸钠，用水定容至1L，121℃，灭菌25min得到发酵培养基。
取2mL植物乳杆菌YX-1接种于装有100mL发酵培养基的三角瓶中，35℃发酵96h，得到含有γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1的发酵液。用BertheLot改良比色法检测γ-氨基丁酸含量为9.02g/L。
选用表面干净且无虫卵的新鲜桑叶100g，清洗，去除叶柄，切成0.8cm的条状，摊晾10h后，蒸汽杀青2min，初步揉捻30min后，接入15mL植物乳杆菌YX-1的发酵液，揉捻1min后，在35℃发酵4h，放入105℃烘箱中烘1h，得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
比色法检测桑叶茶中γ-氨基丁酸的含量，结果桑叶茶中γ-氨基丁酸的含量为320mg/100g。
比色法检测的具体步骤如下：
标准曲线的绘制
准确称取GABA标准样品0.010g，用蒸馏水溶解，定容至10mL，配制不同浓度的标准溶液。分别取1mL不同浓度的标准溶液，加入50μL 2mol/L的AlCl3溶液，混匀后室温振荡15min，12000r/min离心5min，取上清0.5mL加入300μL 1mol/L的KOH溶液，室温振荡5min，12000r/min离心5min。分别取上清液300μL，加0.1mol/L pH10.0的四硼酸钠缓冲液500μL，6％的重蒸酚400μL，混匀后再加入600μL 5％的NaClO溶液，充分混匀。于沸水浴中加热10min，立即置冰浴中5min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL60％乙醇，于645nm波长处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，GABA的浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。
GABA的初步提取分离
取桑叶茶，用蒸馏水冲洗干净，滤纸擦干水分得到样品。称取0.5g样品，研磨粉碎后，加入装2mL甲醇的离心管中，室温震荡10min，5000r/min离心15min，弃上清；再加入少许甲醇，室温震荡10min，5000r/min离心15min，弃上清。待沉淀完全干燥后，加水5mL，50℃水浴中振荡提取2h，5000r/min离心15min，取上清定容至20mL，得到样品提取液，低温保存备用。
桑叶中GABA含量的测定
分别取1mL样品提取液，加入50μL 2mol/L的AlCl3溶液，混匀后室温振荡15min，12000r/min离心5min，取上清0.5mL加入300μL 1mol/L的KOH溶液，室温振荡5min，12000r/min离心5min。分别取上清液300μL，加0.1mol/L pH10.0的四硼酸钠缓冲液500μL，6％的重蒸酚400μL，混匀后再加入600μL 5％的NaClO溶液，充分混匀。于沸水浴中加热10min，立即置冰浴中5min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL 60％乙醇，于645nm波长处测定吸光值。
桑叶茶中GABA的含量按下式计算：GABA质量比(mg/g)＝C×V/m。式中C-由直线方程计算的值(mg/mL)；V-样品提取液的总体积(mL)；m-样品质量(g)。
实施例2
挑取斜面植物乳杆菌YX-1，接种于装有100mLMRS培养基的250mL的三角瓶中，37℃活化培养18h，得到活菌数为1.5×109cfu/mL的植物乳杆菌YX-1，备用。
每升发酵培养基的制备：取600mL水，加入20mL玉米糖化液、10g葡萄糖、12g味精、2g胰蛋白胨、2.5g酵母粉、4g丁二酸钠，用水定容至1L，121℃，灭菌25min得到发酵培养基。
取5mL植物乳杆菌YX-1接种于装有100mL发酵培养基的三角瓶中，37℃发酵64h，得到含有γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1的发酵液。用BertheLot改良比色法检测γ-氨基丁酸含量为9.15g/L。
选用表面干净且无虫卵的新鲜桑叶100g，清洗，去除叶柄，切成0.5cm的条状，摊晾8h后，蒸汽杀青3min，初步揉捻30min后，接入10mL植物乳杆菌YX-1的发酵液，揉捻1min后，在33℃发酵5h，放入95℃烘箱中烘2h，得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
按照实施例1所述的比色法检测桑叶茶中γ-氨基丁酸的含量，结果桑叶茶中γ-氨基丁酸的含量为321mg/100g。
实施例3
挑取斜面植物乳杆菌YX-1，接种于装有100mLMRS培养基的250mL的三角瓶中，39℃活化培养22h，得到活菌数为1.0×109cfu/mL的植物乳杆菌YX-1，备用。
每升发酵培养基的制备：取600mL水，加入30mL玉米糖化液、14g葡萄糖、8g味精、3g胰蛋白胨、2g酵母粉、6g丁二酸钠，用水定容至1L，121℃，灭菌25min得到发酵培养基。
取1mL植物乳杆菌YX-1接种于装有100mL发酵培养基的三角瓶中，39℃发酵80h，得到含有γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1的发酵液。用BertheLot改良比色法检测γ-氨基丁酸含量为9.31g/L。
选用表面干净且无虫卵的新鲜桑叶100g，清洗，去除叶柄，切成0.6cm的条状，摊晾12h后，蒸汽杀青2min，初步揉捻30min后，接入10mL植物乳杆菌YX-1的发酵液，揉捻1min后，在37℃发酵6h，放入100℃烘箱中烘1.5h，得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
按照实施例1所述的比色法检测桑叶茶中γ-氨基丁酸的含量，结果桑叶茶中γ-氨基丁酸的含量为326mg/100g。
由以上实施例可知，本发明提供了一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法。本发明的植物乳杆菌利用本发明的发酵培养基可以发酵得到富含γ-氨基丁酸的发酵液，利用该发酵液可以制备得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶，为桑叶功能食品的研究寻求了一条新途径；按照本发明的方法得到的γ-氨基丁酸的桑叶茶中含有的γ-氨基丁酸的含量丰富。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌YX-1，其特征在于，所述植物乳杆菌YX-1，拉丁文名称为：Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月21日，保藏编号为CGMCCNo.24751。
2.一种权利要求1所述的植物乳杆菌YX-1的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基以水为溶剂包括如下浓度的组分：
玉米糖化液20～40mL/L、葡萄糖10～14g/L、味精8～12g/L、胰蛋白胨2～4g/L、酵母粉1.5～2.5g/L、丁二酸钠4～6g/L。
3.根据权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基以水为溶剂包括如下浓度的组分：
玉米糖化液25～35mL/L、葡萄糖11～13g/L、味精9～11g/L、胰蛋白胨2.5～3.5g/L、酵母粉1.75～2.25g/L、丁二酸钠4.5～5.5g/L。
4.根据权利要求2或3所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基以水为溶剂包括如下浓度的组分：
玉米糖化液30mL/L、葡萄糖12g/L、味精10g/L、胰蛋白胨3g/L、酵母粉2g/L、丁二酸钠5g/L。
5.一种利用权利要求1所述的植物乳杆菌YX-1制备富含γ-氨基丁酸的桑叶茶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的植物乳杆菌YX-1接种于权利要求2～4任意一项所述的发酵培养基中，培养64～96h，得到含有γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1发酵液；
(2)将步骤(1)所述的γ-氨基丁酸的植物乳杆菌YX-1发酵液接种于桑叶中，揉捻，发酵4～6h，干燥，得到富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述接种的植物乳杆菌YX-1的初始活菌浓度为1.0～1.5×109cfu/mL；
所述植物乳杆菌YX-1与发酵培养基的体积比为1～5:100；
步骤(1)所述培养的温度为35～39℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述桑叶为新鲜桑叶经过杀青处理，初步揉捻后的桑叶；
所述杀青处理为：将新鲜桑叶切成宽0.5～0.8cm的条状，摊晾8～12h后，蒸汽杀青2～3min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述接种植物乳杆菌YX-1发酵液的体积与新鲜桑叶的质量比为10～15mL：100g；
步骤(2)所述发酵的温度为33～37℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述干燥的温度为95～105℃；
所述干燥的时间为1～2h。
10.权利要求5～9任意一项所述的方法制备得到的富含γ-氨基丁酸的桑叶茶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210539777.XA CN114933989A (zh) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210539777.XA CN114933989A (zh) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114933989A true CN114933989A (zh) | 2022-08-23 |
Family
ID=82864456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210539777.XA Pending CN114933989A (zh) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114933989A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115895974A (zh) * | 2022-12-23 | 2023-04-04 | 闽榕茶业有限公司 | 一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102424807A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-04-25 | 黑龙江省乳品工业技术开发中心 | 一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株 |
| CN103146599A (zh) * | 2013-02-01 | 2013-06-12 | 浙江五养堂药业有限公司 | 高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用 |
| KR20140034621A (ko) * | 2012-09-12 | 2014-03-20 | 원광대학교산학협력단 | 신규한 락토바실러스 플란타룸 ｔｏ-2100과 이를 이용한 뽕잎의 발효방법, 이에 의한 뽕잎 발효물 및 이를 포함하는 식품 조성물 |
| WO2014208848A1 (ko) * | 2013-06-24 | 2014-12-31 | 목포대학교 산학협력단 | 감마아미노부틸산 고생산성 락토바실러스 브레비스 및 그의 용도 |
| KR20150051624A (ko) * | 2013-11-05 | 2015-05-13 | 전북대학교산학협력단 | 유산균을 이용한 항산화 활성 및 플라보놀이 증대된 뽕잎 발효액 및 이를 함유하는 식품 조성물 |
| CN106434482A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-02-22 | 华南农业大学 | 一株产γ‑氨基丁酸的植物乳杆菌SG5 |
| CN106900872A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-30 | 华南农业大学 | 一种含γ‑氨基丁酸的桑豆乳的制备方法 |
| CN106939288A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-07-11 | 华南农业大学 | 植物乳杆菌SG5在产γ‑氨基丁酸中的应用 |
| CN110747145A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-04 | 天津科技大学 | 一种高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及其分离培养方法和应用 |
| CN111004752A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 江南大学 | 一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用 |
| KR20200059773A (ko) * | 2018-11-21 | 2020-05-29 | (주) 건우에프피 | 가바 성분이 강화된 뽕잎 발효물의 제조방법 및 이로부터 제조된 뽕잎 발효물을 함유하는 식품 조성물 |
| KR20210012982A (ko) * | 2019-07-26 | 2021-02-03 | 에프시아로마 주식회사 | 유산균 발효를 이용한 뽕잎 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 뽕잎 추출물 |
-
2022
- 2022-05-18 CN CN202210539777.XA patent/CN114933989A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102424807A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-04-25 | 黑龙江省乳品工业技术开发中心 | 一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株 |
| CN103013879A (zh) * | 2011-12-23 | 2013-04-03 | 黑龙江省乳品工业技术开发中心 | 一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株 |
| KR20140034621A (ko) * | 2012-09-12 | 2014-03-20 | 원광대학교산학협력단 | 신규한 락토바실러스 플란타룸 ｔｏ-2100과 이를 이용한 뽕잎의 발효방법, 이에 의한 뽕잎 발효물 및 이를 포함하는 식품 조성물 |
| CN103146599A (zh) * | 2013-02-01 | 2013-06-12 | 浙江五养堂药业有限公司 | 高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用 |
| WO2014208848A1 (ko) * | 2013-06-24 | 2014-12-31 | 목포대학교 산학협력단 | 감마아미노부틸산 고생산성 락토바실러스 브레비스 및 그의 용도 |
| KR20150051624A (ko) * | 2013-11-05 | 2015-05-13 | 전북대학교산학협력단 | 유산균을 이용한 항산화 활성 및 플라보놀이 증대된 뽕잎 발효액 및 이를 함유하는 식품 조성물 |
| CN106434482A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-02-22 | 华南农业大学 | 一株产γ‑氨基丁酸的植物乳杆菌SG5 |
| CN106939288A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-07-11 | 华南农业大学 | 植物乳杆菌SG5在产γ‑氨基丁酸中的应用 |
| CN106900872A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-30 | 华南农业大学 | 一种含γ‑氨基丁酸的桑豆乳的制备方法 |
| KR20200059773A (ko) * | 2018-11-21 | 2020-05-29 | (주) 건우에프피 | 가바 성분이 강화된 뽕잎 발효물의 제조방법 및 이로부터 제조된 뽕잎 발효물을 함유하는 식품 조성물 |
| KR20210012982A (ko) * | 2019-07-26 | 2021-02-03 | 에프시아로마 주식회사 | 유산균 발효를 이용한 뽕잎 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 뽕잎 추출물 |
| CN110747145A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-04 | 天津科技大学 | 一种高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及其分离培养方法和应用 |
| CN111004752A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 江南大学 | 一株耐乙醇植物乳杆菌及其在发酵食品中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 何梦秀: "一株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌SG-5的筛选及其利用", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑, no. 5 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115895974A (zh) * | 2022-12-23 | 2023-04-04 | 闽榕茶业有限公司 | 一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用 |
| CN115895974B (zh) * | 2022-12-23 | 2024-02-13 | 闽榕茶业有限公司 | 一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101731568B (zh) | 一种采用固定化细胞发酵制备高盐稀态酱油的方法 | |
| CN101624560B (zh) | 一种海带果酒的制备方法 | |
| CN104531435A (zh) | 酒精处理-复合抑制剂法益生菌活菌格瓦斯制造方法 | |
| CN101597583A (zh) | 一种青梅果醋其制备及应用方法 | |
| CN111345416A (zh) | 一种桑葚酵素饮料的制备方法 | |
| CN101892141A (zh) | 一种甜型红枣酒的制备方法 | |
| CN101955980A (zh) | 一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株 | |
| CN109315656A (zh) | 一种多菌种复合发酵玫瑰花酵素的制备方法 | |
| CN105647756B (zh) | 一种富硒虫草桑葚保健稠酒 | |
| CN103184123A (zh) | 牡丹花樱桃白兰地的制作工艺 | |
| CN114933989A (zh) | 一种植物乳杆菌及其发酵培养基与一种富含γ-氨基丁酸的桑叶茶及其制备方法 | |
| CN114246208A (zh) | 一种槐米发酵提取制备果蔬保鲜剂的方法 | |
| CN109722341A (zh) | 一种金花葵烟用香料的制备方法和应用 | |
| CN101724531B (zh) | 大米原浆酒的制备方法 | |
| CN106047643B (zh) | 一种富含龙胆低聚糖的梅花醋及发酵制备方法 | |
| CN111838535A (zh) | 一种富含麦角固醇的青稞功能红曲米及其制备方法 | |
| CN105154292B (zh) | 一种黑苦荞健康养生酒及其酿造方法 | |
| CN105112263A (zh) | 一种利用扣囊复膜酵母生产调香液的方法 | |
| CN109321422A (zh) | 一种酿酒方法 | |
| CN107841410A (zh) | 一种余甘子发酵酒及其制备方法 | |
| CN104974849B (zh) | 一种发酵型烟用甜菜浸膏的制备方法 | |
| KR20080093215A (ko) | 함초 발효 진액 제조방법 | |
| CN113621472A (zh) | 路易波士茶醋及其制备方法和用途 | |
| CN106544224A (zh) | 一种功能性石榴冰酒的制备方法 | |
| CN105918547B (zh) | 一种双孢菇沙棘速溶茶及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |