KR20140034621A - 신규한 락토바실러스 플란타룸 ｔｏ-2100과 이를 이용한 뽕잎의 발효방법, 이에 의한 뽕잎 발효물 및 이를 포함하는 식품 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100, 수탁번호 KFCC 11537P)과 이를 이용한 뽕잎의 발효방법, 이에 의한 뽕잎 발효물 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신규의 섬유질 분해성 젖산균인 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100, 수탁번호 KFCC 11537P)로 뽕잎을 고체 발효시킴으로써, 당질 대사효소인 알파 글루코시다아제(α-glycosidase)의 저해 활성을 갖는 함질소 화합물 및 피페리딘 알카로이드 등의 함량을 증대시킨 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100과 이를 이용한 뽕잎의 발효방법, 이에 의한 뽕잎 발효물 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)과 이를 이용한 뽕잎의 발효방법, 이에 의한 뽕잎 발효물 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신규의 섬유질 분해성 젖산균인 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100, 수탁번호 KFCC 11537P)로 뽕잎을 고체 발효시킴으로써, 당질 대사효소인 알파 글루코시다아제(α-glycosidase)의 저해 활성을 갖는 함질소 화합물 및 피페리딘 알카로이드(piperidine alkaloid) 등의 함량을 증대시킨 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100과 이를 이용한 뽕잎의 발효방법, 이에 의한 뽕잎 발효물 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
뽕잎(Mulberry leaves)은 신농본초경(神農本草經), 본초강목(本草綱目), 일본의 오처경(五妻鏡), 끽다양생기(喫茶養生記) 및 동의보감에 의하면 각기병, 부종, 당뇨, 탈항 등 약용식물로서의 효과가 기록되어있다. 뽕잎에는 녹차보다 많은 미네랄이 함유되어 있고, 기능성 성분인 루틴(rutin), 쿠에르체틴(quercetin), 쿠에르치트린(quercitrin), 이소린(isoquercitrin) 등과 같은 플라보노이드(flavonoid)와 스테로이드(steroid), 아미노산(amino acid), 비타민(vitamin) 등이 함유되어 있다. 또한, 중추신경계의 억제성 신경전달물질로 혈압상승억제, 식욕 및 포만감 조절 등 중요한 역할을 하는 감마아미노뷰테릴산(γ-aminobutyric acid, GABA)가 비교적 풍부하며, 특히, 알파 글루코시다아제(α-glucosidase)의 활성을 저해하여 당의 흡수를 감소시켜 혈당을 저하시키는 항과혈당(anti-hyperglycemic) 활성이 우수한 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)과 질소 함유 당(N-containing sugar)이 다량으로 함유된 대표적인 천연물이다. 전 세계 모든 곳에서 발병되고, 2030년에 전 세계 인구의 4.4%까지 증가할 것으로 예상되는 당뇨병의 치료 및 예방에 가장 주목되는 천연물 소재이다.
약용식물은 치료의 목적으로 생물 및 건조분말의 형태로 사용되어 왔으며. 복용량의 과다 및 짧은 보존기간 등의 문제를 해결하기 위하여 물 및 유기용매 추출방법이 개발되었다. 그러나, 이와 같은 방법은 추출 용매의 극성도에 따른 추출 물질의 변화 및 식물 세포벽의 치밀도에 의한 수율 저하 등의 문제점을 안고 있다.
이러한 단점을 보완하고자 미생물을 이용한 발효 추출법이 주목되고 있다. 발효법에 이용되는 미생물은 식물세포의 섬유질을 분해할 수 있는 세균 및 곰팡이와 알코올을 생산하는 효모균이 주목을 받고 있다. 이러한 발효의 방법은 식물 세포벽을 자화하여 추출 수율을 증가시키고, 알코올의 함량을 점진적으로 증가시킴으로써 유용 성분의 추출을 용이하게 하고, 식물 내 존재하는 불필요한 당을 제거하여 유용한 물질로 전환시키는 이점을 가지고 있다.
통상적으로 사용되는 액상 발효(submerged fermentation)는 복잡한 설비 및 발효 후 폐기물의 발생 등 몇 가지 단점을 가지고 있는 반면에, 고체 발효(solid-state fermentation)는 저렴한 장비와 농산폐기물과 같은 저비용의 원료를 사용하여 고효율의 생성물은 만들고 폐기물을 만들지 않는 친환경적인 방법이다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 갖는 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)이 피페리딘 알카로이드로 저 산성 조건에서 용이하게 추출되는 특성을 가진 것을 고려하여, 섬유질을 자화할 수 있는 신규의 섬유질 분해성 젖산균인 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 제공하는 것을 발명의 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규의 섬유질 분해성 젖산균인 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)으로 뽕잎을 고체 발효시킴으로써, 당질 대사효소인 알파 글루코시다아제(α-glycosidase)의 저해 활성을 갖는 함질소 화합물 및 피페리딘 알카로이드 등의 함량을 증대시킬 수 있는 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100를 이용한 뽕잎의 발효방법을 제공하는 것을 발명의 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 이용한 뽕잎의 발효방법에 의하여 발효되어 당질 대사효소인 알파 글루코시다아제(α-glycosidase)의 저해 활성을 갖는 함질소 화합물 및 피페리딘 알카로이드 등의 함량이 증대된 뽕잎 발효물을 제공하는 것을 발명의 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 이용한 뽕잎의 발효방법에 의하여 발효되어 당질 대사효소인 알파 글루코시다아제(α-glycosidase)의 저해 활성을 갖는 함질소 화합물 및 피페리딘 알카로이드 등의 함량이 증대된 뽕잎 발효물을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것을 발명의 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결하고자 하는 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어질 수 있을 것이다.
상기와 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 제공한다.
또한, 본 발명은 섬유질 분해 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 뽕잎의 발효 방법은 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 이용하여 뽕잎을 발효시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 뽕잎의 발효 방법은 고체 발효인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 뽕잎의 발효 방법은 상기 뽕잎에 함유된 1-디옥시노지리마이신(1-Deoxynojirimycin) 및 피페리딘 알칼로이드(Piperidine Alkaloid)의 함량이 증대되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 뽕잎의 발효 방법은 발효 초기 수분 함량 20%, 발효 온도 30 ~ 35℃ 및 발효 상대 습도 60 ~ 70%인 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 따른 뽕잎 발효물은 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 이용한 뽕잎의 발효 방법에 의하여 발효된 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 뽕잎 발효물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이상과 같은 구성의 본 발명에 의하면, 당질 대사 효소인 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 갖는 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)이 피페리딘 알카로이드로 저 산성 조건에서 용이하게 추출되는 특성을 가진 것을 고려하여, 섬유질을 자화할 수 있는 신규의 섬유질 분해성 젖산균인 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P), 이를 이용한 뽕잎의 발효방법 및 그 뽕잎 발효물, 그리고 이를 포함하는 식품 조성물을 제공함으로써 새로운 미생물 자원의 개발, 기능성 식품의 제조 및 개발, 이에 의하여 당뇨병의 예방 및 치료 그리고 생물 공정 공학 분야에 일차적으로 적용될 수 있는 효과를 제공한다.
본 발명에 의하여 달성되는 효과는 이상에서 언급한 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어질 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주의 16s rDNA 염기서열 분석 결과.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100)의 계통수(phylogenetic tree).
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주로 고체 발효한 뽕잎 분말에서 추출한 피페리딘 알카로이드의 TLC 패턴.
도 4는 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 비교 결과.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100)의 계통수(phylogenetic tree).
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주로 고체 발효한 뽕잎 분말에서 추출한 피페리딘 알카로이드의 TLC 패턴.
도 4는 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 비교 결과.
이하, 후술되어 있는 내용을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되어지는 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 부호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주의 16s rDNA 염기서열 분석 결과이고 도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100)의 계통수(phylogenetic tree)이며, 도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주로 고체 발효한 뽕잎 분말에서 추출한 피페리딘 알카로이드의 TLC 패턴이고 도 4는 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 비교 결과이다.
실시예
1. 섬유질 분해 활성을 갖는 유산균의 분리
본 발명은 유산균을 분리하기 위해서 전통 누룩을 강원 태백, 전북 익산, 부산 금정에서 수집하였다. 수집된 누룩은 생리 식염수에 현탁하여 여과 후 적정 배율로 희석하였다. 희석액은 유산균용 MRS(Lactobacilli MRS) 배지에 도말 후 37℃-24시간 배양하였다. 배양 후 형성된 콜로니는 2% CaCO3가 첨가된 MRS 배지에 획선 접종하여 투명환의 크기가 균체로부터 5 mm 이상 되는 균주 15종을 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주 15종을 덱스트로오스(dextrose)와 구연산 암모늄(ammonium citrate)를 제외시키고 10 g/L 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymetyl cellulose)를 첨가한 유산균용 MRS(Lactobacilli MRS) 한천(agar) 배지에 획선 접종하고 37℃-48시간 배양하였다. 배양 후 2% I2, 3% KI를 70% 에탄올에 용해시킨 Gram's Iodine 용액으로 염색 후 노란색의 투명환을 형성하는 균주를 최종 선별하였다.
뽕잎의 젖산 발효를 위한 섬유질 분해능을 갖는 유산균의 분리는 2% CaCO3가 첨가된 MRS 배지에서 투명환의 크기가 5mm 이상되는 균주 15종을 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymetyl cellulose, CMC)가 포함된 MRS 배지에서 Gram's Iodine 염색 시 노란색의 투명환의 크기가 가장 큰 균주를 최종 선별하였으며 이를 TO-2100로 명명하였다.
실시예
2.
TO
-2100의 동정
(1) 형태 및 배양학적 특성
균주의 크기와 형태는 Gerhardt 등 (1994)의 방법에 따라 그람 염색(Gram staining)하여 광학현미경(Nicon, FK-IIA, Japan)으로 관찰하였고, 또한 분리균주의 정밀한 외형은 2.0% PTA(phosphotungstinic acid)로 음성 염색(negative staining)하여 전자현미경(Hitachi S-4800, Japan)으로 관찰하였다.
상기 선별된 TO-2100 균주는 산성 평판배지(pH 3.0)에서의 colony 형태는 원형이었고, 색깔은 밝은 유백색이었으며 표면은 볼록하고 매끄러운 상태를 나타내어 젖산균 특유의 배양학적 특성을 보였다.
(2) 생리학적 특성
균주의 생리학적 특성으로는 카세인(casein) 분해능, 전분(starch) 분해능, 젤라틴(gelatin) 액화력, 당 발효성, 인돌(indole) 생성능, 질산염(nitrate) 환원력, 카탈라아제(catalase)와 산화효소(oxidase) 생산능을 미생물학 실험 매뉴얼(microbiology laboratory manual)에 따라 조사하였다.
상기 TO-2100의 생리적 특성을 검토한 결과는 표 1과 같다. 생육 pH 범위는 2.0 ~ 9.0 이었고, 생육온도 범위는 15 ~ 45℃ 이었다. 또한, 염농도 15%까지 생육이 가능하였으며, 카탈라아제(catalase) 양성, 산화효소(oxidase) 양성 및 전분(starch), 카세인(casein)을 가수분해하였으며, 셀룰로오스(cellulose) 가수 분해능은 양성이었다. 또한, 인돌(indol) 생산능을 갖고 있었고, 아르기닌(arginin)과 펩톤(pepton)으로부터 NH3를 생산하였으며, 중성의 영양 배지에서는 생육이 확인되지 않았다.
(3) 세포 지방산 분석
균주의 세포 지방산(whole cell fatty acid) 조성은 가스 크로마토그래피(gas chromatography(GC, HP 6890))를 사용하여 분석하였다. 표준 지방산으로는 Hewlett-Packard(HP)사에서 제공하는 표준 지방산(calibration standard kit)을 사용하였으며, 균주의 배양은 사부로 한천(Sabouraud's agar, Difco, USA)) 배지를 사용하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 배양된 균체를 시험관에 취한 후 비누화 시약(sponification reagent : 45 g sodium hydroxide(NaOH), 150 methanol(CH3OH, 150 D.W(distilled water, 증류수))을 1 ㎖를 가한 후 30분간 100℃에서 중탕 후 유수에 냉각하였다.
비누화된 균체를 6 N HCl와 메탄올(methanol)의 2.6:1 혼합물 2 ㎖를 가한 후 80℃에서 10분간 메틸화(methylation) 시키고, 헥산(hexane)과 메틸 삼차 부틸 에테르(methyl tert-butyl ether)의 1:1(v/v) 혼합물 1.25 ㎖를 가한 후 10분간 상온에서 천천히 진탕한 후 하층액을 제거하여 세포 지방산을 추출하였다. 이를 5.4% NaCl로 세척 후 분석용 시료로 하였으며 분석용 시료는 GC를 사용하여 분석 후 MIDI사의 균주 동정 프로그램인 sherlock program을 통하여 분석하였다.
상기 TO-2100의 세포 지방산 성분을 검토한 결과, 주성분은 18:1과 16:0 normal로 각각의 함량은 51.63%와 16.17%를 나타내었다(표 2). 이는 Lactobacillus 와 Bifidobacterium 속 세균의 대표적인 특성으로, Lactobacillus와 Bifidobacterium 속 세균의 지방산 주성분인 18:1 normal은 종에 따라 25 ~ 55% 및 17 ~ 40%, 16:0 normal 또한 21 ~ 35% 및 15 ~ 38%로 다양하다는 Veerkamp(1971)의 보고와 일치하는 경향을 보였다. 이 보고에 따르면, 18:0의 함량은 Bifidobacterium 속 세균의 경우 4 ~ 22%로 비교적 높은 반면, Lactobacillus 속의 경우 0.5 ~ 4.0%로 낮았다. 따라서, 상기 TO-2100 균주는 Lactobacillus 속 젖산균으로 추정되었다.
(4) 16s rDNA 시퀀싱(sequencing)
16S rDNA 유전자 분석은 Wizard Genomic DNA Prep Kit(Promega)를 사용하여, PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)을 행하였다. 이때, 반응조건은 94℃ 1분간 변성(denaturation), 60℃ 1분 30초간 결합(anneal) 시킨 후, 72℃ 1분간 신장(extend)하였으며, 이 조작을 총 30 사이클(cycle)을 반복하였다. 이때 사용한 프라이머(primer)는 27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492r(5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT)이었다.
증폭된 절편(amplified fragment)(16S rDNA region)를 pGEM T Easy vector(Promega)에 삽입하고, 숙주 세포(host cell)로 E. coli DH5를 사용하여 일반적인 분자 클로닝(molecular cloning) 방법에 의하여 형질전환(transformation) 시킨 후, Wizard Plus SV miniprep DNA purification system을 이용하여 플라스미드(plasmid)의 mini-preparation(small scale preparation)시키고, 자동 DNA 시퀀저(automated DNA sequencer (ABI 3700, Applied Biosystems Inc.)를 사용하여 시퀸싱(sequencing)하였다. 도 1은 상기 TO-2100 균주의 16s rDNA 염기서열 분석 결과를 보여준다.
정렬(Alignment)는 Clustal X(ver. 1.8) software를 사용하여 시퀸스(sequence)를 rRNA 이차 구조를 참고하여 정렬(alignment)한 후, 유사도(simmilarity) 값을 구하였다. 또한, 블라스트 검색(advanced blast search)을 통하여 유전자은행(genebank)의 염기서열과 비교하였다. 시료의 DNA로부터 16s rDNA 유전자 alignment를 행한 결과, 시료의 종은 Lactobacillus plantarum 임이 확인 되었고 NCBI(National Center for Biotechnology Information, 미국 국립생물공학정보센터) 유전자은행(genbank)에서 가장 유사한 종으로 등록되어 있는 균은 Lactobacillus plantarum > gi| 157907500|dbj|AB362768.1| 인 것으로 나타났으며 이와 99.67%(1526/1531)의 일치율을 보여 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100)으로 명명하였다. Neighbor-joining(NJ) method에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 동정된 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100)은 2012. 07. 17.자로 한국미생물보존센터(Korea Culture Center for Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 'KFCC 11537P'의 수탁번호를 부여받았다.
실시예
3.
락토바실러스
플란타룸
TO
-2100의 젖산
생성능
및 섬유소 분해 효소 활성 측정
(1) 젖산 생성능
분리 균주의 젖산 생성능은 pH 및 적정 산도로 측정하였다. 분리 균주를 25, 150 rpm 으로 48시간 진탕 배양 후, pH는 pH meter(sp-701, Suntex Inc. Korea)로 측정하였으며, 젖산 생성능은 Food analysis(Nielsen, 2003)에 의하여 발효액 20 ㎖를 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1 N NaOH 용액으로 적정한 후 0.1 N NaOH 소요량을 다음 식에 의해 젖산 생성량(Lactic acid %)으로 환산하였다.
(2) Carboxymethyl Cellulose(CMCase) 활성측정
Cx 또는 β-1.4 glucanase activity를 측정하기 위하여 Mandel and Weber (1969), Mandel (1975)의 방법에 따라 1% carboxymethyl cellulose(CMC) 100 ㎖, 0.5 mol citrate buffer(pH 4.8) 10 ml, 1% merthiolate를 증류수 1L로 희석한 용액을 기질로 사용하였다. 배양 후 원심분리하여 균체를 제거한 상등액 0.5 ㎖를 0.5 ㎖의 기질 용액에 첨가 후 50, 30분간 반응시켰다. 반응 후 3 ㎖ DNS reagent (Miller,1959) 을 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에서 5분간 정치 후 450 nm에서 비색정량하고, 사전에 작성된 표준곡선으로부터 환원당(D-glucose)의 양을 환산하였다. 1 unit는 1분 동안 1 mol D-glucose를 생성하는 효소의 양으로 하였다.
(3) Filter Paper(FPase) 측정
Filter paper hydrate activity는 Ghose (1987)의 방법에 준하여 Whatman No. 1 filter paper를 기질로 사용하여 측정하였다. filter paper를 16 cm strips (50 mg)으로 절단하고 0.05 mol citrate(pH 4.8) 1 ㎖ 첨가 후 50에서 1시간 동안 반응한 후 3 ㎖ DNS reagent를 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에 5분간 정치 후 생성된 환원당의 양을 450 nm에서 비색정량하고, 표준곡선으로부터 환원당 (D-glucose)의 양을 환산하였다. 1 unit는 1분 동안 1 mol D-glucose를 생성하는 효소의 양으로 하였다.
(4) 결과
분리 균주 락토바실러스 플란타룸 TO-2100의 젖산 생성능 및 섬유소 분해 효소 활성을 측정한 결과, pH는 3.2, 젖산 생성량은 0.68%이었다. FPase(filter paper cellulase)와 CMCase(carboxymethyl cellulase)의 활성은 각각 0.35와 40.1 units이었다(표 3).
실시예
4. 고체 발효(
Solid
-
state
fermentation
) 조건에 따른 뽕잎의 피페리딘
알카로이드
함량 변화
(1) 시험방법
1) 초기 수분 함량의 영향
초기 수분의 함량은 70℃, 24시간 저온 살균한 뽕잎 건조분말에 멸균 증류수를 20 ~ 40%(W/V)가 되게 첨가하였다. 이때 수분의 함량은 적외선 수분 측정기를 사용하여 측정하였다. 각각의 초기 수분 농도를 조절한 뽕잎 분말에 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주 배양액 3 ㎖(108/㎖)를 접종하고 30℃, 72시간 배양하여 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드(piperidine alkaloid)의 함량을 비 발효 뽕잎 분말과 비교 측정하였다.
2) 발효 온도의 영향
무균적으로 처리한 20%의 수분 함량을 갖는 뽕잎 분말에 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주 배양액 3 ㎖(108/㎖)를 접종하고 25 ~ 40℃에서 72시간 배양 후 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드의 함량을 측정하였다.
3) 상대 습도의 영향
상대 습도의 영향은 20%의 수분 함량을 갖는 뽕잎 분말에 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주 배양액 3 ㎖(108/㎖)를 접종하고 항온 항습기를 이용하여 30℃에서 상대습도를 50 ~ 80%로 각각 조절하여 72시간 배양 후 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드의 함량을 측정하였다.
4) 질소화합물, 피페리딘 알카로이드 함량 및 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ) 정량
피페리딘 알카로이드의 추출은 Ahmad 등 (2002)의 방법을 변형하여 추출하였다. 발효 뽕잎 분말에 20배량의 0.5 mol HCl 용액을 첨가하고 80℃, 5시간 추출 후, 이를 감압 여과하여 잔사를 제거하였다. 여액에 4 mol의 NH4OH 용액을 첨가하여 pH 12로 조절하고 2시간 실온에서 방치하였다. 이때 생성된 침전물을 측정하여 염기성의 질소화합물 함량으로 하였으며, 이 침전물을 증류수로 재용해 후 CHCl3로 분획하였다. CHCl3 분획물을 감압 농축하고 70℃에서 12시간 건조 후 그 함량을 측정하여 피페리딘 알카로이드 함량으로 하였다. 건조분획 1 g/㎖의 시료 용액 10 ℓ를 TLC(thin-layer chromatography) plate(silica gel 60 F254, Merck Co.)에 점적(spotting)하고 CHCl3 : NH4OH : MeOH (30:1:1)의 용매 시스템에서 전개하였다. 점적 전개(spot development)는 요오드 증기(iodine vapor)를 스프레이하여 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)의 표준물질과 비교하였다. 동일 용매 시스템에서 분취용 TLC(preparative TLC, PTLC)를 행하여 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)을 분리하여 그 함량을 측정하였다.
(2) 결과
1) 초기 수분 함량의 영향
저온 살균한 뽕잎 건조분말에 멸균 증류수를 첨가하여 초기 수분 농도를 20 ~ 40% (w/v)가 되게 조절하고 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주 배양액 3 ㎖(108/㎖)를 접종하고 30℃, 72시간 배양하여 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드 함량 변화를 측정한 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 20% 초기 수분 함량을 가질 때 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드의 함량은 뽕잎 건조분말 100 g당 각각 13.21 g 및 2.29 g으로 3.12 및 0.40 g 인 비 발효 추출물(표 4에서 'Non-fermented')에 비해 4.23 및 5.73배 증가하는 결과를 나타내었다. 또한 초기 수분 함량이 증가하면 잡균의 오염의 가능성 및 발효 속도도 감소하는 것으로 나타났다.
2) 발효 온도의 영향
초기 수분 함량을 20%로 조절한 뽕잎 분말에 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주 배양액 3 ㎖(108/㎖)를 접종하고 25 ~ 40℃에서 72시간 배양 후 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드의 함량을 측정한 결과 비 발효 추출물(표 5에서 'Non-fermented')에 비해 30 ~ 35℃에서 발효 시 생성량이 가장 우수하였으며, 40℃ 이상의 온도에서는 생성량이 감소하는 것으로 나타났다(표 5).
3) 상대 습도의 영향
발효 과정 중 상대습도의 영향을 조사하기 위하여 초기 수분 함량을 20%로 조절한 뽕잎 분말에 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주 배양액 3 ㎖(108/㎖)를 접종하고 항온 항습기를 이용하여 30℃에서 상대 습도를 50 ~ 80%로 각각 조절하여 72시간 배양 후 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드 함량을 측정하였다.
표 6에 나타낸 바와 같이 60 ~ 70%의 상대 습도에서 질소화합물 및 피페리딘 알카로이드의 함량은 뽕잎 건조분말 100 g당 발효추출물은 각각 16.54 ~ 16.41 g 및 2.86 ~ 2.82 g으로 3.12 및 0.40g인 비 발효 추출물(표 6에서 'Non-fermented')에 비해 5.30 ~ 5.26 및 7.15 ~ 7.05배 증가하여 기능성 성분의 증가에 고체 발효의 방법이 효과가 있음을 알 수 있다. 또한 상대 습도가 증가하면 생성량이 감소하는 것은 분말 뭉침 등에 의해 원활한 통기가 일어나지 않음으로써 미생물의 생육을 저해하는 것으로 판단된다.
4) 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)의 함량
본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주로 고체 발효한 뽕잎 분말에서 추출한 피페리딘 알카로이드의 TLC 패턴을 도 3에 나타내었다. 도 3에서 A는 비 발효 추출물(Non-fermented extract)이고 B가 발효 추출물(Fermented extract))을 나타낸다. 뽕잎 알카로이드의 대부분이 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)라는 대부분의 보고와 일치하는 결과를 보였다(Lou et al., 2011, Kim et al ., 2003, Kojima et al ., 2010, Kimura et al 1995). 분취용 TLC(preparative TLC, PTLC)를 행하여 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)을 분리하여 그 함량을 측정한 결과 발효물(표 7에서 'Solid-state fermentation')의 경우 뽕잎 건조 분말 100 g당 2.02 g으로 0.25 g인 비 발효물(표 7에서 'Non fermentation')에 비해 8.08배 증가하여 뽕잎으로부터 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, 1-DNJ)을 다량으로 얻을 수 있는 가장 효과적인 방법으로 판단되며, 피페리딘 알카로이드 함량 중에는 약 70% 정도의 1-디옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin) 함량이 존재함을 알 수 있었다.
실시예
5. 알파
글루코시다아제
(α-
glucosidase
) 저해 활성
알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성은 Hsieh 등 (2010)의 방법에 준하여 측정하였다. 발효 및 비 발효 피페리딘 알카로이드 1 ~ 5%를 정제수에 용해 후 감압 여과하여 잔존물을 제거하고 그 상등액 50 ㎖를 0.15 U/㎖ 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 효소액 50 ㎖, 200 mmol potassium phosphate buffer (pH 6.8) 50 ㎖와 혼합하여 37℃에서 10 분간 preincubation 한 후 0.1 mol phosphate buffer(pH 7.0)에 녹인 3 mmol p-NPG (p-nitrophenyl--glucopyranoside) 100 ㎖를 가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 0.1 mol Na2CO3 750 ㎖로 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 뽕잎의 이용성을 증대시키기 위하여 뽕잎 발효 및 비 발효물을 열수 추출하여 동일한 저해 활성을 측정하였다.
알파 글루코시다아제(α-glucosidase)는 소장 상피세포의 brush-border membrane에 존재하는 효소로서 탄수화물이 소화 흡수되기 용이한 단당류로 가수분해하는 역할을 한다. 알파 글루코시다아제(α-glucosidase)에 대한 저해능은 탄수화물 식이 후 혈당상승을 억제할 수 있어 항 당뇨 활성 측정의 주 표적 효소이다. 비 발효물과 발효물에서 추출된 피페리딘 알카로이드와 이와 비교하기 위하여 열수 추출물의 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 비교한 결과는 도 4와 같다. 비 발효물(도 4에서 'A의 (a) Non-fermented mulberry leaves')과 발효물(도 4에서 'A의 (b) Solid-state fermentated mulberry leaves')에서 추출된 피페리딘 알카로이드 1% 첨가 시 70.6%, 73.2%의 저해활성을 보였으며, 3% 첨가 시 90.2%, 93.0%, 5% 첨가 시 95.0%, 97.0%의 저해활성을 보였으나 비 발효물과 발효물 간에는 유의성이 없었다. 이는 뽕잎에 함유된 피페리딘 알카로이드의 성분이 발효와 비 발효 간의 큰 차이가 없는 것으로 판단된다.
반면, 비 발효물과 발효물의 열수 추출물에 대한 알파 글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성은 비 발효 열수 추출물(도 4에서 'B의 (a) Non-fermented mulberry leaves') 1% 첨가 시 7.7%, 3% 첨가 시 16.2 %, 5% 첨가 시 40.2% 저해 활성을 보인 반면, 발효 열수 추출물(도 4에서 'B의 (b) Solid-state fermentated mulberry leaves') 1% 첨가 시 32.5%, 3 % 첨가 시 65.7%, 5% 첨가 시 84.7%의 저해활성을 보였다. 열수 추출의 경우 효소 저해 활성이 큰 차이를 보인 것은 발효와 비 발효물 간의 피페리딘 알카로이드 함량의 차이에 기인 한 것으로 판단되며, 본 발명의 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100) 균주에 의한 고체 발효를 통하여 뽕잎의 당질 관련 기능성을 한층 더 증가시킬 수 있음을 시사한다.
본 발명은 뽕잎을 이와 같은 신규한 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 이용하여 고체 발효시켜 얻어지는 당질 대사효소인 알파 글루코시다아제(α-glycosidase)의 저해 활성을 갖는 함질소 화합물 및 피페리딘 알카로이드 등의 함량이 증대된 뽕잎 발효물을 포함하는 식품 조성물을 제공할 수 있다.
이상에서 설명된 본 발명은 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation
<120> NOVEL LACTOBACILLUS PLANTARUM TO-2100, FERMENTATION METHOD OF
MULBERRY LEAVES USING THEREBY, FERMENTED MATERIALS THEREBY AND
FOOD COMPOSITION COMPRISING THE FERMENTED MATERIALS
<130> 10732.12543
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1205
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg 60
caactggtaa taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc 120
tgacgacaac catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga 180
tttgcatagt atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg 240
ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc 300
cccaggcgga atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact 360
tagcattcat cgtttacggt atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac 420
tttcgagcct cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca 480
tatatctacg catttcaccg ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt 540
ttccagtttc cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa 600
ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc 660
gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca 720
gttactctca gatatgttct tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca 780
ctcacgcggc gttgctccat cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct 840
cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc 900
tacgtatcat tgccatggtg agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca 960
tccaaaagtg gtagccgaag ccatctttca agctcggacc atgcggtcca agttgttatg 1020
cggtattagc atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt 1080
actcaccagt tcgccactca ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag 1140
agctcgttcg acttgcatgt attaggcacg ccgccagcgt tcgtcctgag ccatgatcaa 1200
actct 1205
Claims (8)
- 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P).
- 제1항에 있어서,
섬유질 분해 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P). - 청구항 1 또는 청구항 2의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO -2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 이용하여 뽕잎을 발효시키는 것을 특징으로 하는 뽕잎의 발효 방법.
- 제3항에 있어서,
고체 발효인 것을 특징으로 하는 뽕잎의 발효 방법. - 제3항에 있어서,
상기 뽕잎에 함유된 1-디옥시노지리마이신(1-Deoxynojirimycin) 및 피페리딘 알칼로이드(Piperidine Alkaloid)의 함량이 증대되는 것을 특징으로 하는 뽕잎의 발효 방법. - 제3항에 있어서,
발효 초기 수분 함량 20%, 발효 온도 30 ~ 35℃ 및 발효 상대 습도 60 ~ 70%인 것을 특징으로 하는 뽕잎의 발효 방법. - 청구항 3 내지 청구항 6 중 어느 하나의 항의 락토바실러스 플란타룸 TO-2100(Lactobacillus plantarum TO-2100, 수탁번호 KFCC 11537P)을 이용한 뽕잎의 발효 방법에 의하여 발효된 것을 특징으로 하는 뽕잎 발효물.
- 청구항 7의 뽕잎 발효물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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