KR101444196B1

KR101444196B1 - 신규한 미생물 바실러스 코아귤란스 km-1, 및 이를 이용한 발효대두박 및 양어용 사료의 제조방법

Info

Publication number: KR101444196B1
Application number: KR1020120129111A
Authority: KR
Inventors: 박희연; 장미순; 남기호; 김강웅; 김경덕; 안철민; 김영옥
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2014-09-26
Also published as: KR20140061915A

Abstract

본 발명은 신규한 미생물 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) KM-1, 이를 이용한 발효대두박 및 양어용 사료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알파-갈락토시다제 효소활성을 가지며 난소화성 탄수화물 분해활성이 우수한 신규한 미생물 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주를 이용하여 대두박을 고온발효시킴으로써 기존의 대두박보다 소화율이 향상된 양어용 사료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 미생물 바실러스 코아귤란스 KM-1, 및 이를 이용한 발효대두박 및 양어용 사료의 제조방법 {Novel microorganism Bacillus coagulans KM-1, and manufacturing method of fermented soybean meal and fish feed using the same}

본 발명은 신규한 미생물 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) KM-1, 이를 이용한 발효대두박 및 양어용 사료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알파-갈락토시다제 효소활성을 가지고 난소화성 탄수화물 분해활성이 우수한 신규한 미생물 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주를 이용하여 대두박을 고온발효시킴으로써 기존의 대두박보다 소화율이 향상된 양어용 사료를 제조하는 방법에 관한 것이며, 본 발명은 해양미생물학 및 수산사료학에서 유용한 기술로 사용될 수 있다.

오늘날 수산자원은 해양환경 변화와 과도한 어획 등으로 그 양이 감소하고 있고, 이에 따라 어획량도 크게 줄어들고 있다. 세계 각국은 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안의 하나로 어류양식을 지속적으로 확대해 나가고 있다. 그러나 사료의 주성분인 어분(fish meal)의 생산량은 어족자원의 감소로 인하여 정체 또는 감소하는 추세에 있어 어분의 수급불안정에 따른 어류양식업의 채산성악화가 문제점으로 대두되고 있다. 따라서 일부 어류양식업체에서는 어류의 사료를 제조함에 있어서 단백질 함량이 높고 수급이 비교적 안정적인 탈지대두박(이하 대두박으로 표기)을 어분 대체소재로 이용해 오고 있다.

대두박은 콩을 분쇄하여 헥산으로 기름을 추출하고 남은 부산물로, 대두박의 구성성분은 건조 중량을 기준으로 단백질 55~56%, 가용성 탄수화물 13~14%, 불용성 탄수화물 21~22%, 회분 4~6%, 지방 1% 내외로 구성되어 있다(한인규, 사료가공학, 선진문화사, pp 67~107, 1998년). 탄수화물의 경우, 대두박에는 단당류(monosaccharide)가 거의 없으며 올리고당(oligosaccharide)은 수크로스(sucrose) 8.1%, 말토스(maltose) 0.6%, 라피노스(raffinose) 1.1%, 스타치오스(stachyose) 4.9% 등으로 구성되어 있고 다당류(polysaccharide)는 아라비남(arabinnan) 15.0%, 아라비노갈락탄(arabinogalactan) 5.0%, 헤미셀룰로스(hemicellulose) 3.5%, 셀룰로스(cellulose) 2.0% 등으로 구성되어 있다. 이들 중 스타치오스와 라피노스는 알파-갈락토실(α-galactosyl)결합으로 이루어져 있어 알파-갈락토시다제(α-galactosidase) 효소를 갖지 않은 동물의 경우 이들을 소화할 능력이 없고, 이들은 어류의 생체 내에서 항 영양 및 알레르기 유발인자로 작용하여 어류의 성장을 억제하거나 질병을 유발시키는 것으로 알려져 있다(Animal Feed Science and Technology 79, pp 331-345, 1999년). 특히, 넙치 등 육식성 어류는 식물성 단백질에 대한 이용률이 낮고 기호성도 떨어져 어분 대체율이 약 10% 수준에 머무르고 있어 기술개발을 통한 개선이 절실하게 요청되고 있는 실정이다(한국수산학회지 33, pp 469-474).

따라서 사료 첨가용 대두박의 품질향상을 위해 미생물 발효기술을 이용한 기술개발이 국내외적으로 활발하게 추진되고 있다. 대두박 발효에 사용되는 미생물로는 바실러스 서브틸러스 TP6(한국특허등록 10-1139027호, 2012. 4. 16), 아스퍼질러스 오리재 GB-107(한국특허등록 10-0459240호, 2004. 11. 19), 바실러스 서브틸러스 GR-101 및 아스퍼질러스오리재 GB-107(한국특허등록 10-0645284호, 2006. 11. 06), 바실러스 서브틸러스 에스와이 8-24(한국특허등록 10-0265540호, 2000. 6. 15), 락토바실러스 루테리 GB-LC1 및 사카로마이세스 세레비지에 GB-LC4(한국특허등록 10-0925173호, 2009. 10. 29), 고초균 및 균류(한국특허등록 10-0372159호, 2003. 1. 30) 등이 있으며, 이들을 이용한 발효대두박의 경우 종래의 대두박과 비교하여 트립신 저해인자, 대두올리고당 및 다당류 등 다양한 항영양인자가 감소하였고 사료흡수율이 향상되는 효과가 있었다. 한편, 스타치오스, 라피노스 등의 난소화성 탄수화물을 분해할 수 있는 알파-갈락토시다제를 대량생산하기 위한 미생물로서 바실러스 리체니포미스 YB-42(한국특허등록 10-0606657호, 2006. 7. 24), 락토바실러스 에스피 JCC-27(한국특허등록 10-0607147호, 2006. 7. 24) 등이 공지되어 있다.

이상에서 제시된 미생물들은 최적 발육온도가 30~40℃인 중온세균(mesophilic bacteria)에 속하는 것으로 발효를 위해서는 원료에 대한 살균이 필수적이다.

한편, 식품의 영양소 손실, 부패 등을 야기하여 품질유지에 바람직하지 못한 불량세균에 해당하는 낙산균의 발육온도는 30~40℃의 범위이고, 이를 피하여 높은 온도에서 발효시키는 방법이 고온발효(thermophilic fermentation)이다. 통상적인 저온 및 중온발효는 잡균의 번식을 방지하기 위해 살균과정을 필수적으로 행해야하나, 고온발효는 발효가 고온에서 이루어지기 때문에 재료에 대한 살균과정을 거치지 않아도 부패성 미생물의 발육이 억제된 상태에서 신속한 발효를 할 수 있는 장점이 있으므로 산업적인 활용이 용이하다. 따라서 고온발효를 이용한 대두박의 발효는 살균공정이 없이 신속한 발효를 할 수 있어 생산성 향상에 아주 유리할 것으로 사료되나, 대두박의 고온발효에 관한 공지된 기술은 아직 찾아볼 수 없는 실정이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 해양유래의 신규한 미생물을 확보하여 대두박의 고온발효에 활용하는 것이다. 더욱 상세하게는 고온에서 알파-갈락토시다제를 생산하는 균주를 확보하여 균주의 최적 발육조건, 형태학적 및 생화학적 특성을 규명하고 유전자분석을 통해 균종을 밝히는 것이다. 나아가 대두박의 난소화성 탄수화물을 효과적으로 분해할 수 있는 발효조건을 규명한 후, 본 발명에 의해 제조된 발효대두박을 어분 대신에 사료에 첨가하여 어분대체효과를 검증하는 것이다.

상기한 과제를 해결하고자, 본 발명은 알파-갈락토시다제 효소활성을 가지며 난소화성 탄수화물 분해활성이 우수한 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) KM-1 균주(기탁번호: KCCM 11298P)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 균주를 사용하여 대두박을 발효시키는 것을 포함하는 발효대두박의 제조방법을 제공한다.

마지막으로 본 발명은 상기 방법으로 제조된 발효대두박을 포함하는 양어용 사료를 제공한다.

본 발명의 신규한 미생물, 바실러스 코아귤란스 KM-1은 대두박의 난소화성 탄수화물 함량을 낮추는 기능이 있어 양어사료용 대두박의 품질을 획기적으로 향상시키는 효과가 있다. 특히, 본 발명에 의해 제조된 발효대두박은 가격이 높고 수급이 불안정한 사료용 어분을 30% 이상 대체할 수 있는 효과가 있어 어류 양식업의 채산성 향상에 크게 기여할 것으로 전망된다.

도 1은 배양온도에 따른 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주의 발육도를 나타낸 것이다.
도 2는 배양액의 pH에 따른 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주의 발육도를 나타낸 것이다.
도 3은 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주의 전자현미경 관찰결과(×7,500)를 나타낸 것이다.
도 4는 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주의 16S rDNA 염기서열 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 바실러스 코아귤란스 KM-1이 생산하는 알파-갈락토시다제의 반응온도에 따른 효소활성을 나타낸 것이다.

본 발명의 제1측면은, 알파-갈락토시다제 효소활성을 가지며 난소화성 탄수화물 분해활성이 우수한 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) KM-1 균주(기탁번호: KCCM 11298P)에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주의 최적 발육온도는 45℃~55℃이고, 바람직하게 50℃이다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주의 최적 발육pH범위는 5.5~7.0이고, 바람직하게 6.0이다.

본 발명의 제2측면은, 상기 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주를 사용하여 대두박을 발효시키는 것을 포함하는 발효대두박의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 바실러스 코아귤란스 KM-1 균주가 접종된 정제수를 대두박에 분무하여 흡수시키는 단계;

정제수가 흡수된 대두박을 발효시키는 단계;

55℃~65℃에서 효소반응을 유도하는 단계; 및

효소반응이 완료된 대두박을 건조 후 분쇄하는 단계를 포함하는 발효대두박의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 발효 단계의 발효 온도는 바람직하게 60℃이다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 발효 단계에서 대두박 10 kg 당 정제수 8~12 L가 첨가되고, 바람직하게 10 L가 첨가된다.

마지막으로 본 발명의 제3측면은, 상기 방법으로 제조된 발효대두박을 포함하는 양어용 사료에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명자들은 고온에서 알파-갈락토시다제를 생산하는 미생물을 부산시 기장군 연안에서 어획한 멸치로부터 분리하였다. 생멸치 10 g을 멸균희석수 40 mL와 함께 균질기로 파쇄한 것을 보통한천배지(nutrient agar medium)에 도말하여 50℃의 배양기에서 배양하면서, 발생한 콜로니를 영양배지(nutrient broth)에 접종하고 48시간 동안 배양한 후 알파-갈락토시다제 활성을 측정하여 활성이 높은 균주를 선발하였다. 미생물의 생화학적 특성을 분석하기 위해 API-ZYM(bio Merieux SA사, 프랑스)을 이용하여 19종의 효소활성을 조사하였고 API-50CH(bio Merieux SA사, 프랑스)을 사용하여 50종의 탄소원에 대한 이용패턴을 조사하였으며 균체의 성상을 전자현미경으로 관찰하였다. 본 발명에서 분리한 미생물의 균종을 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열을 분석하여 상동성을 분석하였다. 즉, 미생물의 16S rDNA 염기서열을 결정하기 위해 통상적인 방법에 따라 정제된 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA단편을 Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems, USA)로 정제한 다음, DNA sequencer(Applied Biosystems model 3730XL, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 EzTaxon server 2.1을 이용하여 상동성을 분석하였다. 그리고 본 발명에서 수득한 미생물이 난소화성 탄수화물을 분해하는지를 알아보기 위한 실험을 실시하였다. 영양배지에 스타치오스와 라피노스를 첨가하고 미생물을 접종하여 50℃의 진탕항온수조에서 48시간 동안 배양한 다음 고속액체크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography)를 이용하여 스타치오스와 라피노스의 함량을 Scalabrini 등(1998)의 방법으로 측정하였다.

나아가, 본 발명자들은 본 발명의 미생물을 이용한 대두박의 적정발효조건을 규명하였으며 발효대두박에 대한 품질을 평가하기 위해 일반성분, KOH 용해도, 펩신 소화율, 요소활성도 및 난소화성 탄수화물의 함량을 분석하였다. 어분대체 효과를 검증하기 위해 발효대두박의 함량이 다른 4종의 부상 건조사료(EP)를 제조하여 넙치를 대상으로 생물 사육실험을 실시하였다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 다만 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시되는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 멸치로부터 미생물의 분리

부산시 기장군 연안에서 어획한 생멸치 10 g을 멸균수 40 mL와 함께 균질기(blender)로 파쇄하여 5분간 방치한 뒤 상층액 10 mL을 채취하여 100 mL의 영양배지(nutrient broth, 쇠고기 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L)에 접종하고 50℃의 진탕항온수조에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL을 보통한천배지(nutrient agar medium, 쇠고기 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L, 한천 15 g/L)에 도말하여 50℃의 배양기(incubator)에서 배양하면서 발생한 독립적인 집락(colony)을 백금이(platinum pool)를 이용하여 채취하여 각각 영양배지에 다시 접종하여 50℃에서 48시간 배양하였다. 각각의 배양액 1 mL를 채취하여 15분 동안 12000×g로 원심분리하고 맑은 상층액을 이용하여 알파-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 알파-갈락토시다제 활성의 측정은 기질인 p-니트로페닐-알파-D-갈락토피라노시드(pNPαGal)를 사용하여 실시하였다(Food Research International 42, pp 476-483, 2009년). 즉, 700 μL의 100 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 100 μL의 배양액과 200 μL의 9.9 mM pNPαGal을 혼합하여 5분간 50℃에서 반응시킨 후, 2 mL의 0.2 M 보레이트 버퍼(pH 9.8)를 첨가하여 반응을 중지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 알파-갈락토시다제 활성 정도를 측정하여 활성이 높은 균주를 선발하였다. 멸치로부터 분리한 미생물들의 알파-갈락토시다제 활성을 측정한 결과는 표 1과 같다.

실시예 2: KM-1 균주의 최적 발육조건 분석

알파-갈락토시다제 활성이 높은 KM-1 균주의 최적 발육조건을 규명하기 위한 실험을 실시하였다. 먼저 KM-1 균주의 최적 발육온도를 알아보기 위해 영양배지에서 30~70℃의 온도범위에서 각각 12시간 동안 배양한 후 균체의 농도를 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 온도에 따른 KM-1 균주의 발육도를 도 1에 나타내었다. KM-1 균주는 45~55℃의 범위에서 잘 자라며 가장 잘 자라는 온도는 50℃인 것으로 나타났다. KM-1 균주의 최적 발육pH를 알아보기 위해 영양배지의 pH를 4.0~8.0으로 각각 조정하여 50℃에서 12시간 동안 배양한 후 균체의 농도를 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. pH에 따른 KM-1 균주의 발육도를 도 2에 나타내었다. KM-1 균주는 pH 5.5~7.0의 범위에서 잘 자라며 가장 잘 자라는 pH는 6.0인 것으로 나타났다.

실시예 3 : 미생물의 형태학적 및 생화학적 특성 분석

멸치로부터 분리한 20종의 미생물 중 알파-갈락토시다제 활성이 높게 나타난 KM-1 균주에 대한 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다. 형태학적 특성을 분석하기 위해 KM-1 균주를 최적 조건에서 배양하여 그람염색(Gram staining)과 포자염색(Spore staining)를 실시한 결과, 포자를 형성하는 그람양성균으로 나타났다. KM-1 균주의 전자현미경 관찰결과(×7,500)는 도 3과 같다. 도 3에서 보는바와 같이 세균의 지름과 길이는 각각 0.5~0.7 ㎛, 3.3~4.4 ㎛로 길이가 지름의 2배 이상 되는 장간균(long rod)인 것으로 관찰되었으며 카탈라제(catalase) 실험결과 양성반응을 보여 바실러스속(Bacillus sp.)의 형태적 특징과 일치하였다. KM-1균주의 생화학적 특성을 분석하기 위해 API-ZYM(bio Merieux SA사, 프랑스)을 이용하여 19종의 효소활성을 조사한 결과는 표 2와 같다.

KM-1 균주는 포스파타제 알칼린, 에스테라제(C4), 에스테라제 리파제(C8), 루신 아릴아미다제, 시스틴 아릴아미다제, 포스파타제 산, 나프톨-ASBI-포스포하이드롤라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제 및 알파-글루코시다제에 대한 양성반응을 나타내었다. 알파-갈락토시다제 활성이 높게 나타난 KM-1 균주를 대상으로 API-50CH(bio Merieux SA사, 프랑스)을 사용하여 탄소원의 이용패턴을 조사한 결과는 표 3과 같다. KM-1 균주는 글리세롤, 리보스, D-자일로스, 갈락토스, D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스, N-아세틸 글루코사민, 말토스, 멜리비오스, 트레할로스, 스타치, D-아라비톨 및 5-케토-글루코네이트를 이용하는 것으로 나타났다.

실시예 4 : 미생물 균주의 동정

KM-1 균주의 동정은 16S rDNA 염기서열을 분석하여 상동성을 분석하였다. 즉, 16S rDNA 염기서열을 결정하기 위해 일반적인 방법에 따라 정제된 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA단편을 Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems, USA)로 정제한 다음, DNA sequencer(Applied Biosystems model 3730XL, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 EzTaxon server 2.1을 이용하여 상동성을 분석하였다. KM-1 균주의 16S rDNA 염기서열 분석 결과는 도 4와 같았으며 상동성을 분석한 결과 Bacillus coagulans 99.797%(3/1478), Bacillus acidiproducens 97.171%(40/1414), Bacillus shackletonii 95.831%(62/1487)인 것으로 나타났다(표 4). 따라서 본 발명에서 신규로 분리한 KM-1 균주를 바실러스 코아귤란스 KM-1로 명명하고 그 유전자는 미국 국립생물정보센터(NCBI)에 등록(JX569800, 2012. 9. 4)하였으며 특허출원을 위해 균주를 한국미생물종보존센터(KCCM 11298P, 2012. 9. 6)에 기탁하였다.

실시예 5 : 미생물 균주의 난소화성 탄수화물 분해능

본 발명에서 수득한 바실러스 코아귤란스 KM-1이 난소화성 탄수화물을 분해하는지를 알아보기 위한 실험을 실시하였다. 영양배지에 스타치오스와 라피노스를 첨가하고 바실러스 코아귤란스 KM-1을 접종하여 50℃의 진탕항온수조에서 48시간동안 배양한 다음 고속액체크로마토그래피를 이용하여 스타치오스와 라피노스의 함량을 Scalabrini 등(1998)의 방법으로 측정하였다. 즉, 스타치오스와 라피노스를 각각 10 g/L씩 첨가한 영양배지(쇠고기 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L)에 바실러스 코아귤란스 KM-1을 접종하여 50℃, 진탕항온수조에서 48시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL을 15분 동안 12,000×g로 원심분리하여 얻은 상층액 250 μL에 아세토니트릴 750 μL를 첨가하여 15분 동안 12,000×g로 원심분리하여 침전물을 제거하고 맑은 상층액을 0.2 μm 막 여과기(membrane filter)로 여과한 것을 최종 분석시료로 사용하였다. 스타치오스와 라피노스의 정량은 APS-2 hypersil 칼럼(thermo scientific; 250 × 4.6 mm, 5 μm, 120 A)이 장착된 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분석(칼럼 오븐 온도 40 ℃, 75% 아세토니트릴 수용액 유속 1.5 mL/min)하였으며 검출기는 RI 검출기(refractive index detector, Dionex)를 사용하였다.

바실러스 코아귤란스 KM-1에 의한 난소화성 탄수화물 분해시험 결과는 표 5와 같다. 발효 전에는 라피노스 및 스타치오스가 각각 0.75%, 0.49%이 던 것이 24시간 발효 후에 0.56%, 0.25%로 감소하였으며 48시간 후에도 0.39%, 0.16%로 더욱 감소하였다. 그리고 라피노스 및 스타치오스의 분해산물로 수크로스 및 갈락토스가 생산되어 바실러스 코아귤란스 KM-1이 생산하는 알파-갈락토시다제에 의해 난소화성 탄수화물인 라피노스와 스타치오스가 잘 분해되는 것이 입증되었다.

실시예 6 : 미생물 균주가 생산하는 알파-갈락토시다제의 최적 반응온도

본 발명에서 수득한 바실러스 코아귤란스 KM-1이 생산하는 알파-갈락토시다제의 최적 반응온도를 알아보기 위한 실험을 실시하였다. 바실러스 코아귤란스 KM-1을 50℃의 영양배지에서 48시간 진탕배양한 다음 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였다. 배양액은 암모늄설페이트[(NH₄)₂SO₄]를 35~85%로 포화되게 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 방치하였다. 침전된 단백질은 13,000×g에서 20분간 원심분리하여 50 mM Tris-HCl(pH 7.0)에 용해시킨 후 동일 완충액으로 4℃에서 12시간 동안 투석하여 조효소액을 획득하였다. 알파-갈락토시다제 활성측정은 기질인 p-니트로페닐-알파-D-갈락토피라노시드(pNPαGal)를 사용하여 실시하였다(Sigma, St. Louis, MO, USA). 700 μL의 100 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 200 μL의 9.9 mM pNPαGal과 100 μL의 조효소액을 혼합하여 5분간 30~70℃ 범위에서 각각 반응시킨 후, 2 mL의 200 mM 보레이트 버퍼(pH 9.8)를 첨가하여 반응을 중지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 알파-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 효소활성 1 unit는 1분에 1 μmole의 p-니트로페놀이 효소에 의해 생성되는 양으로 나타내었으며, 고유 활성도(specific activity)는 단백질 1 mg 당 효소 1 유닛으로 나타내었다.

바실러스 코아귤란스 KM-1이 생산하는 알파-갈락토시다제의 반응온도별 효소활성을 도 5에 나타내었다. 바실러스 코아귤란스 KM-1이 생산하는 알파-갈락토시다제의 활성은 55℃~65℃의 범위에서 높은 활성을 보였으며 60℃에서 가장 높은 것으로 나타나 바실러스 코아귤란스 KM-1의 최적 발육온도인 50℃와는 차이를 보였다. 따라서 바실러스 코아귤란스 KM-1를 이용한 난소화성 탄수화물의 제거를 효율적으로 실행하기 위해서는 50℃에서 충분히 미생물을 발육시킨 다음 60℃에서 효소반응을 유도하여야할 것으로 판단된다.

실시예 7 : 대두박의 수분첨가량에 따른 미생물 발육도

고상발효(solid state fermentation)는 액상발효(liquid state fermentation)에 비해 다양한 대사산물을 얻을 수 있고 생산비용도 저렴하다는 장점이 있다. 일반적으로 바실러스계 세균은 수분활성(water activity)이 0.95 이상의 조건에서 잘 번식하는 것으로 알려져 있으나 시중에 유통되는 대두박의 수분함량은 약 7%에 지나지 않아 효율적인 고상발효를 위해서는 수분을 첨가하는 단계가 필수적이다. 따라서 적정 수분첨가량을 규명하기 위해 대두박 10 kg에 세균수가 1.0×10⁷ CFU/mL인 바실러스 코아귤란스 KM-1이 접종된 정제수 4리터, 6리터, 8리터, 10리터, 12리터를 각각 분무하여 1시간동안 흡수시킨 다음, 50℃의 교반식고체발효기(HAEMA 50L-2)에서 24시간동안 발효한 발효대두박의 세균수와 pH를 측정한 결과는 표 6과 같다.

상기 결과를 살펴보면 수분첨가량 4리터인 발효대두박의 세균수는 3.2×10⁵ CFU/g로 초기세균수 1.0×10⁷ CFU/mL보다 감소하였고 6리터는 세균수가 7.0×10⁸ CFU/g로 약간 증가하였으며 8~12리터 범위에서는 세균수가 2.5×10⁹ ~ 4.5×10⁹ CFU/g로 큰 변화가 없는 정상기(stationary phase)의 특징을 나타내었다. 이상과 같은 결과로 볼 때 적정 수분첨가량 범위는 대두박 10 kg에 정제수 8~12리터를 첨가하는 것이 적당하며 가장 바람직하게는 10리터인 것으로 판단된다.

실시예 8 : 발효대두박의 제조 및 이화학적 특성

본 발명이 공시한 미생물인 바실러스 코아귤란스 KM-1을 이용하여 대두박을 발효시켰다. 즉, 상업적으로 유통되는 통상의 대두박 10 kg에 바실러스 코아귤란스의 세균수가 1.0×10⁷ CFU/mL이 접종된 정제수 10리터를 분무하여 1시간동안 흡수시킨 다음, 50℃의 교반식고체발효기(HAEMA 50L-2)에서 24시간동안 발효시킨 후 온도를 60℃로 조절하여 24시간 동안 효소반응을 유도하였다. 효소반응이 완료된 대두박을 80℃의 열풍건조기에서 12시간동안 건조 시킨 다음 분쇄하는 방법으로 발효대두박을 제조하였다. 발효대두박의 이화학적 특성을 분석하기 위해 일반성분, KOH 용해도, 펩신 소화율, 요소활성도, 라피노스, 스타치오스의 함량을 분석하여 일반 대두박과 비교하였다. 일반성분은 고온발효로 인하여 대두박의 탄수화물이 38.1±1.2%이던 것이 34.6±1.3%로 감소하였으며 단백질이 52.7±2.6%이던 것이 56.6±2.8%로 증가하였다. 이는 대두박의 탄수화물을 바실러스 코아귤란스 KM-1이 이용하여 균체가 증식함에 따라 탄수화물은 감소하고 단백질은 증가한 것으로 추정되며 이러한 결과는 사료의 품질 향상에 도움이 될 것으로 분석된다.

발효에 따른 대두박의 소화율 변화를 시험관내(in vitro)에서 분석한 결과, 소화율을 향상시키는 KOH 용해도 및 펩신 소화율은 증가하였으며 소화를 저해하는 요소활성도는 감소하여 발효가 대두박의 소화율 향상에 기여할 것으로 판단된다.

발효에 따른 대두박의 라피노스 및 스타치오스 함량을 측정한 결과, 일반 대두박이 각각 0.95±0.18%, 3.08±0.45%인 반면 발효대두박은 각각 0.13±0.02%, 0.55±0.05%로 낮게 나타났다. 이는 바실러스 코아귤란스 KM-1이 생산하는 알파-갈락토시다제에 의해 라피노스와 스타치오스가 분해된 것으로 판단된다.

실시예 9 : 발효대두박의 어분대체 효과

발효대두박의 어분대체 효과를 검증하기 위해 넙치를 대상으로 생물 사육실험을 실시하였다. 넙치(평균체중 123 g)를 2,000리터 들이 FRP 원형수조 12개에 4개 실험구, 3반복으로 각각 50마리씩 8주간 사육하였다. 사료의 공급은 매일 오전(09:00)과 오후(17:00)로 나누어 먹을 때까지 손으로 던져 주었다. 사육수는 여과해수로 유수량을 분당 18~20회전으로 조절하였으며 평균수온은 24.0±1.23℃(범위 21.5~27.0℃)이었다. 실험사료는 북양어분을 주 단백질원으로 하였으며 단백질원인 발효대두박을 어분대체원으로 사용하기 위해 어분에 대하여 0%, 10%, 20%, 30% 씩을 첨가하여 표 10과 같이 부상 건조사료(EP)를 제조하였다. 실험어의 체중은 실험 시작 및 종료 1일전에 절식시킨 후 100 ppm의 MS222(Tricaine methane sulfonate, Sigma, USA)에 마취시켜 수조별로 실험어의 전체 무게를 측정하였으며 실험사료 및 실험어의 성분분석은 AOAC(1990)의 방법으로 측정하였다.

발효대두박을 투여한 넙치의 사육실험 결과를 표 11에 나타내었다. 넙치의 증체율 및 사료효율은 발효대두박을 0%, 10%, 20%, 30% 첨가한 실험군이 모두 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(P>0.05). 일간성장률, 생존율 및 단백질 전환효율에 있어서도 모든 실험군에서 차이를 보이지 않았다(P>0.05). 이상과 같은 실험결과로 미루어 볼 때 발효대두박은 사료제조에 사용되는 어분을 30%까지 대체할 수 있을 것으로 판단된다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11298P

20120906

<110> Republic of Korea <120> Novel microorganism Bacillus coagulans KM-1, and manufacturing method of fermented soybean meal and fish feed using the same <130> PC12-0518-NFRD <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1538 <212> DNA <213> Bacillus coagulans <220> <221> rRNA <222> (1)..(1538) <223> 16S rRNA <400> 1 gattcgatta gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc 60 aagtcgtgcg gaccttttaa aagcttgctt ttaaaaggtt agcggcggac gggtgggtaa 120 cacgtgggca acctgcctgt aagactggga taacgccggg aaaccggggc taataccgga 180 tagttttttc ctccgcatgg aggaaaaagg aaaggcggct tcggctgcca cttacagatg 240 ggcccgcggc gcattagcta gttggcgggg taacggccca ccaaggcaac gatgcgtagc 300 cgacctgaga gggtgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 360 gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 420 aagaaggcct tcgggtcgta aaactctgtt gccggggaag aacaagtgcc gttcgaacag 480 ggcggcacct tgacggtacc cggccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540 gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggc 600 ttcttaagtc tgatgtgaaa tcttgcggct caaccgcaag cggtcattgg aaactgggag 660 gcttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 720 ggaggaacac cagtggcgaa aggcggctct ctggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 780 gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 840 agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 900 gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 960 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacct 1020 ccctggagac agggccttcc ccttcggggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1080 cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgaccttagt 1140 tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1200 gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg 1260 tacaaagggc tgcgagaccg cgaggttaag ccaatcccag aaaaccattc ccagttcgga 1320 ttgcaggctg caacccgcct gcatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1380 cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1440 cacccgaagt cggtgaggta acctttacgg agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt 1500 ggggtgaagt cgtaacaagg tttccgtaat cactagtg 1538

Claims

알파-갈락토시다제 효소활성을 가지며 난소화성 탄수화물 분해활성이 우수한 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans) KM-1 균주 KCCM 11298P.
제1항에 있어서, 최적 발육온도가 45℃~55℃이고 최적 발육pH범위가 5.5~7.0인 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 또는 제2항의 균주를 사용하여 대두박을 발효시키는 것을 포함하는 발효대두박의 제조방법.
제3항에 있어서, 균주가 접종된 정제수를 대두박에 분무하여 흡수시키는 단계;
정제수가 흡수된 대두박을 발효시키는 단계;
55℃~65℃의 고온에서 효소반응을 유도하는 단계; 및
효소반응이 완료된 대두박을 건조 후 분쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효대두박의 제조방법.
제3항에 있어서, 발효 온도가 60℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 발효시 대두박 10 kg 당 정제수 8~12 L를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항의 방법으로 제조된 발효대두박을 포함하는 양어용 사료.