KR101190790B1 - 신규 바실러스 속 ｃｊｂ－０１ 균주 및 사료 첨가제 - Google Patents

신규 바실러스 속 ｃｊｂ－０１ 균주 및 사료 첨가제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 바실러스 속 ＣＪＢ－０１ 균주 및 이를 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명은 두토막눈썹참갯지렁이(Pernereis aibuhitensis)의 체액에서 분리한 높은 활성의 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 CJB-01 균주를 제공한다. 본 발명의 단백질 분해효소는 광범위한 pH 에서 안정성을 유지하며, 비이온성 및 음이온성 계면활성제에 매우 안정한 효소로서, 대두박 함유 단백질의 분해 활성이 높을 뿐만 아니라 대두박에 존재하는 트립신 저해제를 불활성화 하여 대두박의 단백질성 영양분을 효율적으로 분해한다. 본 발명의 단백질 분해효소를 첨가한 사료는 가축의 성장 촉진 및 사료 효율 개선에 우수한 효과가 있어 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 바실러스 속 ＣＪＢ－０１ 균주 및 사료 첨가제{Novel Bacillus sp. CJB-01 Strain and Feed Additives}
본 발명은 신규 바실러스 속 CJB-01 균주 및 사료 첨가제에 관한 것이다.
단백질은 동물 및 인간에게 필수 영양분으로 대부분의 가축들은 단백질 공급원으로 식물성 단백질을 함유하는 사료를 섭취함으로써 필수 단백질을 얻는다. 단백질 분해효소는 높은 촉매활성으로 단백질을 분해하여 소화, 흡수를 원활하게 해주는 기능뿐만 아니라 다양한 기질에 대하여 특이성을 보이며, 여러 생리학적 측면과 함께 그 경제적 유용성으로 인해 최근 몇 년 동안 산업적 분야에서도 널리 응용되고 있다(Bioresource Technol. 1998, 64, 175-183). 이러한 이유로, 대부분의 중요한 산업용 효소 중에서 단백질 분해효소는 전체 효소 시장의 약 60%를 차지하고 있으며(Chem . Eng . News , 1986, 64, 11-14), 세제공업과 식품가공 및 사료 첨가제에 활용하고 있고(Mciobiol . Mol . Biol . Rev. 1999, 63, 735-750; Process Biochem. 2004, 39, 1441-1447), 이밖에도 의약분야까지도 그 활용범위가 넓어지고 있다. 이렇게 이용분야가 다양한 단백질 분해효소는 자연계에서 식물, 동물은 물론 미생물과 같은 생물자원으로부터 얻을 수 있으며, 단백질 분해효소의 수요가 급증하고 있는 요즈음은 특히 생화학적인 다양성의 범위가 넓으면서 유전적인 기술을 도입하여 조작이 가능한 미생물이 효소원으로 대두되고 있다(Biotechnol . Lett., 1992, 14, 301-304; Biotechnol . Adv. 1999, 17, 561-594; Process Biochem. 2004, 39, 1441-1447).
단백질 분해효소는 사료의 성분에 포함되어 있는 단백질을 분해함으로써 사료의 소화율을 높이고 사료 이용 효율성을 증가시킬 수 있는 효소로서 현재 사료 첨가제로 많이 사용되고 있는 효소 중의 하나이다. 일반적으로, 가축 사료에서는 단백질 공급원으로서 대두박, 옥수수 등 여러 가지 식물성 박류를 사용하고 있다. 그러나, 상기 사료 성분들은 불용성의 고형분 단백질을 다량으로 포함하고 있어 가축이 소화시키기에는 어려움이 있어, 단백질성 영양분을 원활하게 공급하여 주기 위하여 어분 가루 등과 같은 용해율이 좋은 성분으로 대체하려는 시도가 증가되고 있지만 가격이 비싸다는 문제점을 가지고 있다. 따라서, 기존의 식물성 박류를 이용하여 소화 흡수율을 증진시키려는 시도가 꾸준하게 이루어지고 있다.
식물성 박류들 중에서 대두박은 단백질 함량이 풍부하고(최대 약 40%), 아미노산 조성이 우수하여 가축 사료용 단백질 공급원으로 널리 사용되고 있다. 그러나 대두박은 높은 단백질 함량에도 불구하고 난분해성 고형분 단백질을 다량으로 포함하고 있어 돼지와 닭 같은 소화 시간이 짧은 가축에서는 효율적으로 분해되지 못하므로, 소화 흡수율이 낮은 문제점을 가지고 있어 대두박을 사료로 공급할 경우에는 가축이 충분히 소화할 수 있도록 고형분 단백질을 분해시켜 공급하는 것이 필요하다. 따라서, 축산 업계에서 단백질성 영양분의 소화 흡수율을 개선하는 것이 중요한 화두가 되고 있어, 대두박 단백질을 효율적으로 가수분해할 수 있는 단백질 분해 효소의 탐색이 필수적이다. 또한 대두박에는 항영양인자 중의 하나인 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor, SBTI) 가 존재함으로써, 트립신 저해제를 불활성화 시키는 기능을 갖는 효소가 중요한 사료 첨가제가 될 수 있다. 사료 첨가제로 사용하는 단백질 분해효소의 경우 생체 내 항상적 환경 조건 하에서 효소가 활성을 유지해야 한다. 따라서, 높은 활성 및 안정성을 갖는 단백질 분해효소를 개발하고, 그 생산성을 높이는 것이 필요하다.
한편, 바실러스(Bacillus)는 환경에 대한 적응력이 매우 뛰어나며 세대가 짧고 배양이 용이한 특징으로 인해 그 이용이 매우 증가하고 있으며, 경제성을 지니는 단백질 분해효소를 생산하며 또한, 안정성이 높은 미생물인 것으로 알려져 있다(Gene 1995, 152, 67-74; Mciobiol. Mol. Biol. Rev. 1999, 63, 735-750; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 59, 15-32; Can. J. Microbiol. 2004, 50, 1-17). 이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 인식하여 두토막눈썹참갯지렁이(Pernereis aibuhitensis)의 체액에서 여러 가지 균주를 탐색하고, 광범위한 pH에 노출되어도 효소 활성을 유지하며 계면활성제에 높은 안정성을 가지며, 강력한 대두박 단백질 분해 활성 및 대두박에 존재하는 항 영양인자 중의 하나인 트립신 저해제를 불활성화시키는 작용을 하는 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 분리 동정하고, 상기 균주로부터 단백질 분해효소를 대량 생산하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 사료 첨가제로 널리 이용되는 단백질 분해효소를 생산하는 다양한 균주를 스크리닝함으로써, 가축의 단백질성 영양분의 소화 흡수율을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 두토막눈썹참갯지렁이(Pernereis aibuhitensis)으로부터 높은 활성과 안정성을 갖는 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 CJB-01 균주 분리하였다. 또한, 이를 이용하여 가축의 단백질 소화흡수를 향상시켜 성장률을 증진시키는 사료첨가제를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 속 CJB-01 (Bacillus sp. CJB-01) 균주(기탁번호: KCTC18212P)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주에서 생산되는 단백질 분해효소를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 생산 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분해효소를 포함하는 가축 성장용 사료 첨가제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 사료 첨가제를 포함하는 가축 성장용 사료를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 속 CJB-01(Bacillus sp. CJB-01) 균주(기탁번호: KCTC18212P)를 제공한다.
본 발명자들은 사료 첨가제로 널리 이용되는 단백질 분해효소를 생산하는 다양한 균주를 스크리닝함으로써, 가축의 단백질성 영양분의 소화 흡수율을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 두토막눈썹참갯지렁이(Pernereis aibuhitensis)으로부터 높은 활성과 안정성을 갖는 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 CJB-01 균주 분리하였다. 또한, 이를 이용하여 가축의 단백질 소화흡수를 향상시켜 성장률을 증진시키는 사료첨가제를 제조하였다.
본 발명의 신규한 균주는 바실러스 속(Bacillus sp.)이다. 일반적으로 바실러스 속은 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성혐기성 간균으로서 탈질, 철환원, 망간산화 등에 관여한다. 또한, 환경조건에 따라 균체 내에 구조적 변화가 생겨 포자를 형성하는 특징이 있다.
본 발명의 상기 바실러스 속 CJB-01 균주는 서열목록 1로 기재되는 16S 리보소말 RNA 서열을 가진다. 또한, 그람 양성이며, 포자를 형성하고, 카탈라제 (catalase), 옥시다제(oxidase) 및 질소의 환원(nitrogen reduction)활성을 가지고 있으며, 단백질 분해효소를 생산한다. 또한, 글루코스, 프럭토스, 리보스, 만노스, 설탕, 만니톨 및 솔비톨과 같은 당으로부터 산 및 가스를 생성한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 속 CJB-01(Bacillus sp. CJB-01)에서 생산되는 단백질 분해효소를 제공한다.
일반적으로 단백질 분해효소는 단백질과 펩티드의 펩티드결합을 가수분해하는 효소로서 프로테아제라고도 한다. 단백질 분해효소는 단백질을 펩티드사슬 내부에서 절단하는 소위 엔도펩티다아제(endopeptidase)와 단백질의 말단에서 절단하는 엑소펩티다아제(exopeptidase)를 포함한다. 또한, 동식물의 조직, 세포 및 미생물 등에 널리 있으나 주로 미생물 기원의 것이 사용되며 각각 다양한 단백질을 분해함으로써 소화효소로서도 중요한 구실을 한다. 이러한 소화효소로서의 역할을 이용하여 단백질 분해효소는 의약분야, 식품가공 및 사료 첨가제로도 널리 개발되고 있다. 이 중 사료 첨가제로 이용되는 경우에는 사료의 주요 단백질 공급원인 옥수수, 대두박, 임자박, 채종박, 아마박 및 면실박 등 식물성 박류로부터의 난분해성 고형분 단백질에 대한 분해능이 요구된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 분해효소는 대두박 함유 단백질을 분해한다.
본 발명에서 이용되는 대두박은 콩을 분쇄하여 헥세인(hexane)으로 기름을 추출하고 남은 부산물로서, 평균 단백질 함량은 44％이고 껍질을 벗기고 제조한 탈피대두박의 단백질 함량은 48%이다. 아미노산 조성이 좋고 양적으로도 많이 생산되기 때문에 가장 중요한 식물성 단백질 공급원으로 이용된다. 한편, 대두박의 단백질은 난분해성이며 항 영양인자 중의 하나인 트립신 저해제가 존재함으로써, 가축의 장에서 사료로 섭취한 단백질성 영양분을 소화하는 데 관여하는 트립신의 활성을 저해하여 단백질의 소화, 흡수를 감소시켜 사료 효율을 낮춘다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 분해효소는 대두박 함유 트립신 활성 저해제를 불활성화한다.
트립신 활성 저해제는 가공하지 않은 성숙된 대두에서 발견되는 주요한 항 영양학적(antinutritional) 인자 중의 하나로서 제안되어져 왔다(J. Nutr. 1948, 35, 379-389). 적절한 가열 공정은 단백질 분해효소 저해제를 파괴하기 위하여 필요하지만, 과도한 열처리는 아미노산의 이용가능성을 저하시키며, 동물 체중 획득을 감소시킨다. 감소된 단백질 분해효소 저해제를 갖는 대두는 값비싼 가열 처리의 필요를 감소시키거나 제한시킬 수도 있으며, 낮아진 아미노산 이용가능성을 높일 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 생산 방법을 제공한다.
균주 배양은 인공적인 외적 조건을 제어하여 인공적으로 생활, 발육, 증식시키는 것으로서, 미생물에 대한 외적 조건은 온도, 빛 및 삼투압 등의 물리적 환경조건과 산소, 이산화탄소, 영양물질, 수소이온 및 산화환원전위 등의 화학적 환경조건을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 분해효소의 생산 방법에서 균주를 배양하는 경우에는 (a) 대두박, 면실박, 펩톤 및 트립톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 유기 질소원, 및 (b) 과당, 말토스, 포도당, 구연산 및 글루탐산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 탄소원을 포함하는 배지를 이용하여 실시하고, pH 7.0-12.0, 25-45℃ 배양온도, 0.1-5 vvm 통기조건, 200-900 rpm 및 20-96 배양 시간의 조건으로 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 이용되는 유기 질소원으로는 대두박, 면실박, 펩톤, 트립톤, 효모추출물, 탈지분유 및 카제인 등으로 구성되는 유기 질소 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 대두박, 면실박, 펩톤 및 트립톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 유기 질소원이 보다 바람직하며, 대두박, 면실박 또는 펩톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 유기 질소원이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명에 이용되는 탄소원으로 포도당, 과당, 갈락토스, 말토스, 설탕, 유당, 당밀, 구연산 및 글루탐산 등으로 구성되는 탄소군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 과당, 말토스, 포도당, 구연산 및 글루탐산으로 구성되는 탄소군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 보다 바람직하며, 과당, 말토스, 구연산 및 글루탐산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 균주를 배양하는 경우에 바람직한 pH는 pH 7.0-pH 12.0이며, 보다 바람직하게는 pH 8.0-pH 11.0 이다.
또한, 본 발명의 균주를 배양하는 경우에 바람직한 배양온도는 25-45℃이고, 보다 바람직하게는 30-40℃이다.
본 발명의 균주를 배양하는 경우에 바람직한 통기조건은 0.1-5 vvm이며, 보다 바람직하게는 0.5-1.5 vvm이다.
본 발명의 균주를 배양하는 경우에 바람직한 교반속도는 200-900 rpm이다.
본 발명의 균주를 배양하는 경우에 바람직한 배양시간은 20-96시간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 단백질 분해효소를 포함하는 가축 성장용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제를 제조하기 위하여, 배양액의 상등액을 직접 제제화하거나 밀분, 녹말, 텍스트린 등의 희석제 및 곡류, 왕겨 및 탈지 쌀겨와 같은 겨, 오일 및 지방분이 풍부한 종자 케이크와 같은 사료용 원료와 함께 제제화될 수 있다. 수득된 바실러스 속 CJB-01 균주에 포함된 단백질 분해효소는 그를 함유한 사료 첨가제 형태로 또는 사료 형태로 적당량 동물에 투여되어 체중 증가 및 촉진 성장을 시킨다.
또한, 본 발명의 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가되는 효소 제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며, 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 사료 첨가제를 포함하는 가축 성장용 사료를 제공한다.
본 발명의 사료는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료를 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 적절히 사용할 수 있다. 가공 과정은 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 압출 성형은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고, 항효소 인자를 파괴시키며, 단백질 분해효소의 활성을 분자적 구조변화에 의한 새로운 부위로의 효소적 노출에 의해 증가시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해제 중 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며, 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 사료가 사용될 수 있는 동물의 대표적인 예는 다음과 같다: 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축; 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은 새 등과 같은 가금류.
또한, 투여량은 투여될 동물의 종류, 나이 및 기타 사료 성분의 종류에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 두토막눈썹참갯지렁이 (Pernereis aibuhitensis)의 체액에서 분리한 높은 활성의 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 속 CJB-01 균주를 제공한다.
(b) 본 발명의 단백질 분해효소는 광범위한 pH 에서 안정성을 유지하며, 비이온성 및 음이온성 계면활성제에 매우 안정한 효소로서, 대두박 함유 단백질의 분해 활성이 높을 뿐만 아니라 대두박에 존재하는 트립신 저해제를 불활성화 하여 대두박의 단백질성 영양분을 효율적으로 분해한다.
(c) 본 발명의 단백질 분해효소를 첨가한 사료는 가축의 성장 촉진 및 사료 효율 개선에 우수한 효과가 있어 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pH 변화에 따른 본 발명의 단백질 분해효소 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 온도 변화에 따른 본 발명의 단백질 분해효소 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 pH 처리에 따른 본 발명의 단백질 분해효소 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 비이온성 및 음이온성 계면 활성제의 농도에 따른 본 발명의 단백질 분해효소의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 단백질 분해효소 처리에 의한 대두박 단백질 분해 활성을 SDS-PAGE를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
1, 처리전; 2, 1000 U/ 로 2시간 동안 처리; 3, 1000 U/㎖로 4시간 동안 처리; 4, 1000 U/㎖로 8시간 동안 처리; 5, 1000 U/㎖로 16시간 동안 처리; 6, 2500 U/㎖로 2시간 동안 처리; 7, 2500 U/㎖로 4시간 동안 처리; 8, 2500 U/㎖ 로 8시간 동안 처리; 9, 2500 U/㎖로 16시간 동안 처리
도 6은 본 발명의 단백질 분해효소 처리에 의한 대두박에 존재하는 트립신 저해제(SBTI) 불활성화능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 단백질 분해효소를 첨가한 사료에 의한 닭 성장에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1 : 단백질 분해효소 활성 측정
단백질 분해효소 활성을 분석하기 위하여, 세포 배양 상등액을 회수하여 활성을 측정하였다. 구체적으로, 0.1 M 글리신 완충용액(pH 10.5)에 카제인을 녹여 최종 농도가 0.5%가 되도록 한 기질 용액 0.5 ㎖에 증류수로 적당하게(10~500 배) 희석한 효소 용액 0.01 ㎖을 가하여 잘 섞어준 후 60℃에서 10분간 반응시키고 반응 중지용액(6% 트리클로르 아세트산; 10% 아세트산나트륨; 6% 아세트산) 0.5㎖ 을 가하여 반응을 중단시켰다. 이 용액을 냉장실에서 10분간 방치하여 침전물이 잘 형성되게 한 후 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 회수한 후 275 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 티로신 양을 정량하였다. 단백질 분해효소 1 유니트(Unit, U)는 최적 활성 측정 조건(pH 10.5, 온도 60℃, 완충용액 0.1 M 글리신-NaOH)에서 1분 동안에 1 마이크로 몰(μmole)의 티로신 생성에 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 이 때, 275 nm에서 티로신의 흡광도를 측정하여 티로신농도의 표준 곡선을 얻어 단백질 효소의 활성 유니트 계산에 사용하였다.
실시예 2 : 두토막눈썹참갯지렁이 체액으로부터 단백질 분해효소를 생산하는 균주의 분리
본 발명자들은 두토막눈썹참갯지렁이(Pernereis aibuhitensis)의 체액으로부터 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 다음과 같이 분리하였다. 먼저, 두토막눈썹참갯지렁이 성체를 멸균한 가위로 몸통 부분을 자른 후, 붉은 색의 체액을 채취하였다. 참갯지렁이 체액을 멸균 증류수로 10 내지 100배 희석하여 단백질 분해효소의 기질인 카제인(casein)을 포함하는 트리틱 소이 배지(tryptic soy broth, TSB) 한천 평판 배지에 100 ㎕씩 균일하게 잘 도포하여 주고, 37℃에서 24 내지 48시간 동안 배양한 후, 생성된 군락 주위에 카제인 분해에 의해 생성된 투명환의 생성을 관찰하였다. 군락 주변에 생성된 투명환의 크기가 2 ㎜ 이상 되는 균을 선택한 후, 선택된 균들을 트립틱 소이 배지에 접종하고 37℃에서 24 내지 72시간 동안 250 rpm으로 진탕배양하여 원심분리하여 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1의 방법으로 단백질 분해효소 활성을 측정하여 단백질 분해효소 활성이 뛰어난 균을 선별하였다.
그 결과, 본 발명의 대두박 단백질 분해 활성 및 트립신 저해제 불활성화 작용을 가지고 있는 단백질 분해효소를 생산하는 바실러스 속 CJB-01 균주는 서열목록 1로 기재되는 16S 리보소말 RNA 서열을 가지고 있다. 또한, 본 발명에서 분리한 바실러스 속 CJB-01은 그람 양성이며, 포자를 형성하고, 카탈라제 (catalase), 옥시다제(oxidase) 및 질소의 환원(nitrogen reduction) 활성을 나타낸다. 또한, 글루코스, 프럭토스, 리보스, 만노스, 설탕, 만니톨 및 소비톨과 같은 당으로부터 산 및 가스 생성이 있고, 기타 형태학적 및 생화학적 특성은 표 1에 기재된 바와 같다.
특성 바실러스 속 CJB-01 특성 바실러스 속 CJB-01
그람염색 +, Rod Amygdalin -
포자형성 + Arbutin -
카탈라제(Catalase) + Esculin +
옥시다제(Oxidase) + Salicin -
질소의 환원 + Cellobiose -
Glycerol - Maltose -
Erythritol - Lactose -
D-Arabinose - Melibiose -
L-Arabinose + Sucrose +
Ribose + Trehalose +
D-Xylose - Inulin -
L-Xylose - Melezitose -
Adonitol - Raffinose -
β-Methyl-D-Xyloside - Starch -
Galactose - Glycogen -
Glucose + Xylitol -
Fructose + Gentiobiose -
Mannose + D-Turanose -
Sorbose - D-lyxose -
Rhamnose - D-Tagatose +
Dulcitol + D-Fucose -
Inositol - L-Fucose -
Manitol + D-Arabitol -
Sorbitol + L-Arabitol -
α-Methyl-D-Mannoside - Gluconate -
α-Methyl-D-Glucoside - 2-keto-Gluconate -
N-Acethyl-Glucosamine + 5-keto-Gluconate -
본 발명자들은 상기에서 선별한 균주를 "바실러스 속 CJB-01(Bacillus sp. CJB-01)"으로 명명하고, 이를 2011년 6월 10일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC18212P).
실시예 3 : 바실러스 속 CJB -01 균주의 단백질 분해효소의 생산
3-1 유기 질소원이 단백질 분해효소의 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 바실러스 속 CJB-01의 배양에서 유기 질소원이 단백질 분해효소 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 기본 배양배지는 하기 표 2와 같은 조성이 되도록 제조하였다.
성분명 농도
포도당
인산제일칼륨
인산제이칼륨
염화칼슘
탄산나트륨		 1.0%
0.3%
0.3%
0.5 mM
0.4%
기본 배양배지에 각 질소원이 1% 농도로 포함된 배지를 제조한 후, 트립틱 소이 배지에 24시간 동안 진탕 배양한 바실러스 속 CJB-01 종균을 1%가 되게 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리한 후, 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 유기 질소원이 첨가된 경우 전체적으로 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 증가하였으며, 특히 대두박, 면실박 및 펩톤을 유기 질소원으로 사용하였을 때 단백질 분해효소의 생산이 크게 증가함을 확인하였으며, 유기 질소원을 첨가하지 않은 대조군에 비해 단백질 분해효소의 생산은 각각 132, 58 및 40 배 씩 증가하였다(표 3). 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 대두박, 면실박, 펩톤, 트립톤, 효모추출물, 탈지분유 및 카제인 등으로 구성되는 유기 질소 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 효과적이며, 특히 대두박, 면실박 또는 펩톤을 사용하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
유기질소원 (1%) 효소 활성 (U/㎖) 증가율 (배)
무첨가
대두박
카제인
탈지분유
효모추출물
트립톤
펩톤
면실박
젤라틴		 78
10,325
688
408
1,074
811
3,113
4,513
691 		1.0
132.4
8.8
5.2
13.8
10.4
39.9
57.9
8.9
3-2 대두박 및 면실박 농도가 단백질 분해효소의 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 바실러스 속 CJB-01의 배양에서 대두박 및 면실박의 농도가 단백질 분해효소 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 기본 배양배지에 대두박 및 면실박의 농도를 0.5 내지 2.5%로 되게 배지에 첨가한 후, 트립틱 소이 배지에 24시간 동안 진탕 배양한 바실러스 속 CJB-01 종균을 1%가 되게 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리한 후, 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 유기 질소원으로서 대두박 및 면실박이 첨가된 경우 전체적으로 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 급격하게 증가하였으며, 특히 대두박을 유기 질소원으로 사용하였을 때 배양 배지에 첨가한 대두박의 농도에 따라 단백질 분해효소의 생산이 크게 증가함을 확인하였다. 대두박을 1, 1.5, 2 및 2.5% 로 첨가하였을 때, 유기 질소원을 첨가하지 않은 대조군에 비해 단백질 분해효소의 생산은 각각 149, 190, 179 및 165배씩 증가하였다(표 4). 면실박의 첨가는 단백질 분해효소 생산은 증가하였지만 대두박에 비하여 단백질 분해효소의 생산 효율은 낮았다. 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 1% 이상의 대두박을 첨가하는 것이 효과적이며, 1.5 내지 2% 의 대두박을 첨가하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
유기질소원 효소 활성 (U/㎖) 증가율 (배)
무첨가
대두박 0.5%
1.0%
1.5%
2.0%
2.5%
면실박 0.5%
1.0%
1.5%
2.0%
2.5%		 93
7,618
13,858
17,628
16,636
15,348
1,102
4,981
4,357
3,374
1,952 		1.0
81.9
149.0
189.5
178.9
165.0
11.8
53.6
46.8
36.3
21.0
3-3 탄소원이 단백질 분해효소의 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 바실러스 속 CJB-01의 균주에서 단백질 분해효소 활성에 미치는 탄소원의 영향을 조사하였다. 구체적으로, 대두박(1.5%)을 첨가한 기본 배지에 이당류인 말토즈, 설탕, 유당과 단당류인 포도당, 과당, 갈락토즈를 0.5% 되게 가하여 배지를 제조하였다. 이 때, 각 탄소원은 각각 멸균한 후 종균을 접종하기 직전에 배지에 첨가한 후, 트립틱 소이 배지에 24시간 동안 진탕 배양한 바실러스 속 CJB-01 종균을 1%가 되게 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리한 후, 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 단당류인 과당, 포도당 과 이당류인 말토스르 첨가하였을 때 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 증가함을 확인하였으며, 탄소원을 첨가하지 않은 대조군에 비해 단백질 분해효소의 생산은 각각 1.34, 1,08 및 1.30 배 씩 증가하였다(표 5). 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 과당, 포도당 및 말토즈 등으로 구성되는 탄소원으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하는 것이 효과적이며, 특히 과당 또는 말토즈를 사용하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
탄소원 (0.5%) 효소 활성 (U/㎖) 증가율 (배)
무첨가
과당
갈라토즈
포도당
유당
설탕
말토스		 18,291
24,315
5,751
19,782
9,701
16,635
20,803 		1.00
1.34
0.31
1.08
0.53
0.91
1.30
3-4 탄소원 농도가 단백질 분해효소의 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 바실러스 속 CJB-01의 배양에서 과당 및 말토스의 농도가 단백질 분해효소 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 대두박(1.5%)을 첨가한 기본 배양배지에 과당 또는 말토스의 농도를 0.5 내지 2.5% 로 되게 배지에 첨가한 후, 트립틱 소이 배지에 24시간 동안 진탕 배양한 바실러스 속 CJB-01 종균을 1%가 되게 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리한 후, 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 탄소원으로서 과당 및 말토스가 첨가된 경우 전체적으로 바실러스 속 CJB-01 의 단백질 분해효소 생산이 급격하게 증가하였으며, 특히 과당을 첨가하였을 때 배양 배지에 첨가한 과당의 농도에 따라 단백질 분해효소의 생산이 크게 증가함을 확인하였다. 과당을 0.5, 1, 1.5, 2 및 2.5%로 첨가하였을 때, 탄소원을 첨가하지 않은 대조군에 비해 단백질 분해효소의 생산은 각각 1.14, 1.31, 1.81, 1.56 및 1.43배 씩 증가하였으며, 과당을 1.5% 이상 첨가하면 단백질 분해효소의 생산이 점차 감소하였다(표 6). 말토스의 첨가는 단백질 분해효소의 생산은 증가하였지만 과당에 비하여 단백질 분해효소의 생산 효율은 낮았다. 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 1% 이상의 과당을 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 1.5 내지 2% 의 과당을 배양배지에 첨가하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
탄소원 효소 활성 (U/㎖) 증가율 (배)
무첨가
과당 0.5%
1.0%
1.5%
2.0%
2.5%
말토스 0.5%
1.0%
1.5%
2.0%
2.5%		 19,095
21,717
25,004
34,580
29,811
27,379
25,384
29,374
28,557
23,389
20,995 		1.00
1.14
1.31
1.81
1.56
1.43
1.33
1.54
1.50
1.22
1.10
3-5 저분자량의 탄소원이 단백질 분해효소의 활성에 미치는 영향
본 발명자들은 바실러스 속 CJB-01의 배양에서 구연산 나트륨 및 초산 나트륨 등과 같은 크렙스 회로에서 빠르게 이용될 수 있는 저분자량의 탄소원의 첨가가 단백질 분해효소 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 대두박(1.5%) 및 과당(1.5%)을 첨가한 기본 배양배지에 저분자량의 탄소원 농도를 0.5 내지 2.5% 로 되게 배지에 첨가한 후, 트립틱 소이 배지에 24시간 동안 진탕 배양한 바실러스 속 CJB-01 종균을 1%가 되게 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리한 후, 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 크렙스 회로에서 빠르게 이용될 수 있는 저분자량의 탄소원으로서 글리세린, 글루탐산나트륨 및 구연산나트륨이 첨가된 경우 전체적으로 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 증가하였으며, 특히 구연산나트륨을 첨가하였을 때 배양 배지에 첨가한 구연산나트륨의 농도에 따라 단백질 분해효소의 생산이 크게 증가함을 확인하였다. 구연산나트륨을 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 및 1.5% 로 첨가하였을 때, 탄소원을 첨가하지 않은 대조군에 비해 단백질 분해효소의 생산은 각각 1.21, 1.35, 1.54, 1.65, 1.24 및 1.08배 씩 증가하였으며, 구연산나트륨을 1.25% 이상 첨가하면 단백질 분해효소의 생산이 점차 감소하였다(표 7). 글루탐산나트륨의 첨가는 단백질 분해효소의 생산은 증가하였지만 구연산나트륨에 비하여 단백질 분해효소의 생산 효율은 낮았다. 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 0.25% 이상의 구연산나트륨을 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 0.5 내지 1%의 구연산나트륨을 배양배지에 첨가하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
그 결과, 크렙스 회로에서 빠르게 이용될 수 있는 저분자량의 탄소원으로서 글리세린, 글루탐산나트륨 및 구연산나트륨이 첨가된 경우 전체적으로 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 증가하였으며, 특히 구연산나트륨을 첨가하였을 때 배양 배지에 첨가한 구연산나트륨의 농도에 따라 단백질 분해효소의 생산이 크게 증가함을 확인하였다. 구연산나트륨을 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 및 1.5% 로 첨가하였을 때, 탄소원을 첨가하지 않은 대조군에 비해 단백질 분해효소의 생산은 각각 1.21, 1.35, 1.54, 1.65, 1.24 및 1.08배 씩 증가하였으며, 구연산나트륨을 1.25% 이상 첨가하면 단백질 분해효소의 생산이 점차 감소하였다(표 7). 글루탐산나트륨의 첨가는 단백질 분해효소의 생산은 증가하였지만 구연산나트륨에 비하여 단백질 분해효소의 생산 효율은 낮았다. 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 0.25% 이상의 구연산나트륨을 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 0.5 내지 1%의 구연산나트륨을 배양배지에 첨가하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
저분자량 탄소원 효소 활성 (U/㎖) 증가율 (배)
무첨가
초산나트륨 0.5%
숙신산나트륨 0.5%
프로피온산나트륨 0.5%
글리세린 0.5%
글루탐산나트륨 0.1%
0.25%
0.5%
0.75%
1.0%
구연산나트륨 0.25%
0.5%
0.75%
1.0%
1.25%
1.5%		 33,495
16,950
30,675
1,815
35,940
30,630
41,445
36,105
31,650
27,210
40,455
45,240
51,420
55,410
41,460
36,210 		1.00
0.51
0.92
0.05
1.07
0.91
1.24
1.08
0.94
0.81
1.21
1.35
1.54
1.65
1.24
1.08
3-6 탄산나트륨이 단백질 분해효소의 생산에 미치는 영향
본 발명자들은 바실러스 속 CJB-01의 배양에서 탄산나트륨이 단백질 분해효소 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 대두박(1.5%), 과당(1.5%) 및 구연산나트륨(1%) 을 첨가한 기본 배양배지에 탄산나트륨의 최종 농도를 0 내지 1% 되게 배지에 첨가한 후, 트립틱 소이 배지에 24시간 동안 진탕 배양한 바실러스 속 CJB-01 종균을 1%가 되게 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리한 후, 배양 상등액을 회수하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 0.1% 이상 농도의 탄산나트륨, 즉 약 알칼리성 pH 배지 조성에서 단백질 분해효소의 생산이 증가되었으며, 0.6% 탄산나트륨을 첨가하였을 때 단백질 분해효소의 생산이 가장 높은 것을 확인하여, 전형적인 호염기성 미생물임을 확인하였다(표 8).
탄산나트륨 농도 효소 활성 (U/㎖) 증가율 (배) 배지 pH
0.0%
0.2%
0.4%
0.6%
0.8%
1.0%		 22,782
37,502
53,268
64,423
46,460
36,179 		1.00
4.81
6.83
8.26
5.96
4.64 		6.96
8.47
9.61
9.99
10.35
10.85
실시예 4 : 단백질 분해효소의 생산
4-1 단백질 분해효소의 생산(공기 공급 속도의 영향)
본 발명자들은 실시예 2에서 선별한 바실러스 속 CJB-01 균주로부터 단백질 분해효소를 생산하였으며 단백질 분해효소 최적 생산용 배지로는 실시예 3에서 선별한 배지조성을 사용하였다. 구체적으로, 바실러스 속 CJB-01 균주를 배양하기 위한 배지는 하기 표 9와 같다.
성분명 농도
인산제일칼륨
인산제이칼륨
염화칼슘
탄산나트륨
대두박
과당
구연산나트륨		 0.3%
0.3%
0.5 mM
0.6%
1.5%
1.5%
1%
상기의 배지 조성을 함유하는 액체 배지 3 ℓ와 30% 탄산나트륨 용액을 각각 121℃에서 20분간 고압 멸균하여 제조하였다. 상기 배지를 배양 직전에 탄산나트륨의 농도가 0.6% 되게 가한 후 동일한 배지 조성으로 미리 37℃에서 24시간 동안 플라스크에서 배양한 배양액을 100 ㎖을 접종하여 37℃에서 48시간 동안 5 ℓ 발효배양기(코바이오텍 사)를 사용하여 배양하였다. 이때 통기량 0.5 내지 1.5 vvm이었고, 교반속도는 500 rpm이었다. 12,000g 로 20분간 원심 분리하여 배양 상층액을 회수하였으며, 단백질 분해효소의 활성을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 상기와 같이 배양한 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소는 통기량이 증가할수록 전체적으로 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 증가하였다(표 10). 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 1 vvm 이상으로 공기를 공급하는 것이 효과적이며, 특히 1 내지 1.25 vvm으로 통기량을 조절하여 배양하는 것이 더욱 효과적임을 알 수 있다.
통기량 (vvm) 효소 활성 (U/㎖)
0.5
0.75
1.0
1.25
1.5		 37,050
55,950
80,550
97,380
93,300
4-2 단백질 분해효소의 생산( 교반 속도 영향)
상기의 실시예 4-1과 동일한 배지의 조성 및 발효 조건으로 바실러스 속 CJB-01 균주를 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이때 공기의 공급 속도는 1 vvm이었고, 교반 속도는 300 내지 800 rpm이었다. 배양 상층액을 회수하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
그 결과, 상기와 같이 배양한 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소는 통기량을 1 vvm으로 고정하여 발효 배양할 때 교반 속도가 증가할수록 전체적으로 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 증가하였다(표 11). 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 400 rpm 이상으로 교반하는 것이 효과적이며, 특히 600 내지 800 rpm으로 교반하여 배양하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
교반 속도 (rpm) 효소 활성 (U/㎖)
300
400
500
600
700
800		 45,390
64,370
83,560
97,420
110,550
123,300
4-3 단백질 분해효소의 생산(배양 온도의 영향)
상기의 실시예 4-1과 동일한 배지 조성 및 발효 조건으로 바실러스 속 CJB-01 균주를 48시간 동안 배양하였다. 이때 공기의 공급 속도는 1 vvm, 교반 속도는 800 rpm으로 하고 30 내지 40 ℃에서 균을 배양하였다. 배양 상층액을 회수하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
그 결과, 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소는 배양온도를 35 내지 40℃ 에서 배양할 때 전체적으로 바실러스 속 CJB-01의 단백질 분해효소 생산이 증가하였다(표 12). 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 단백질 분해효소의 최적 생산에는 30 내지 40℃에서 배양하는 것이 효과적이며, 특히 35 내지 40℃에서 배양하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.
온도 (℃) 효소 활성 (U/㎖)
30
35
37
40		 74,070
115,420
118,370
96,020
실시예 5 : 단백질 분해효소 활성 분석
5-1 단백질 분해효소 활성의 최적 pH
본 발명자들은 상기 실시예 4 에서 회수한 단백질 분해효소의 최적 활성 pH 를 알아보고자 하였다. 구체적으로, 기질 카제인을 다양한 pH 의 완충제를 사용하여 제조하였으며, pH 5 내지 6 범위에서는 0.1 M 초산나트륨 완충액용을, pH 6.5 내지 7.5 범위에서는 0.1 M 인산나트륨 완충액을, pH 8 내지 9 범위에서는 0.1 M 트리스-염산 완충액을, pH 9.5 내지 11 범위에서는 0.1 M 글리신-NaOH 완충액을, pH 11.5 내지 12 범위에서는 0.1 M 탄산나트륨 완충액을사용하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
그 결과, 단백질 분해효소는 pH 7.5 내지 11.5 범위의 넓은 pH 영역에서 높은 활성을 나타냈으며, pH 9 내지 11.5에서 더 높은 효소 활성을 나타내었으며, pH 10 내지 11 에서 최적의 효소 활성을 갖는 광범위한 활성 pH 를 가지므로 전형적인 알카리성 단백질 분해효소임을 확인하였다(도 1).
5-2 단백질 분해효소 활성의 최적 온도
본 발명자들은 단백질 분해효소가 활성을 나타내는 최적 온도를 알아보았다. 구체적으로, 카제인(0.5%)을 0.1 M 글리신-NaOH 완충용액(pH 10.5)을 사용하여 제조하였으며, 온도 30 내지 80℃ 범위에서 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 단백질 분해효소 활성은 50 내지 70℃에서 활성이 높았으며, 55 내지 65℃에서 더 높은 효소 활성을 나타내었으며, 60 내지 65℃에서 최적의 효소 활성을 갖는 비교적 높은 최적 활성 온도를 갖는 단백질 분해효소임을 확인하였다 (도 2).
실시예 6 : 단백질 분해효소의 안정성 분석
6-1 단백질 분해효소의 pH 에 대한 안정성
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 회수한 단백질 분해효소의 가축 사료첨가제로 사용하기 위하여 가축의 위 및 장의 pH 에서도 활성을 유지하는 지에 대한 pH 안정성을 알아보기 위하여 광범위한 pH 에서 24 내지 72시간 동안 노출한 후 효소의 활성을 측정하여 바실러스 속 CJB-01가 생산한 단백질 분해효소의 pH 안정성을 측정하였다. 구체적으로, 회수한 단백질 분해효소를 다양한 pH 의 완충제를 사용하여 20 배 희석하여 시료를 4℃에서 24 내지 72시간 동안 방치한 한 후, 잔존 효소활성을 실시예 1의 방법으로 측정하였다. 이 때, pH 3 내지 3.5 범위에서는 0.1 M 구연산나트륨 완충액용을, pH 4 내지 6 범위에서는 0.1 M 초산나트륨 완충액용을, pH 6.5 내지 7.5 범위에서는 0.1 M 인산나트륨 완충액을, pH 8 내지 9 범위에서는 0.1 M 트리스-염산 완충액을, pH 9.5 내지 11 범위에서는 0.1 M 글리신-NaOH 완충액을, pH 11.5 내지 12 범위에서는 0.1 M 탄산나트륨 완충액을사용하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
그 결과, 단백질 분해효소 활성은 pH 5 내지 12에서 단백질 분해 활성을 높게 유지하고 있었으며, pH 7 내지 12에서 효소 활성을 거의 잃지 않는 광범위한 pH 에 매우 안정성을 갖는 단백질 분해효소임을 확인하였다(도 3).
6-2 단백질 분해효소의 계면활성제에 대한 안정성
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 회수한 단백질 분해효소의 계면활성제에 대한 안정성을 알아보기 위해 여러 가지 계면활성제로 처리한 후 효소의 활성을 측정하였다. 구체적으로 트윈 및 트리톤 계열의 비온성 계면활성제와 강력한 음이온성 계면활성제인 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 2.5 내지 5%로 처리하였을 때의 단백질 분해효소의 활성을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 단백질 분해효소는 비이온성 계면활성제에 의해서 효소의 활성이 증가할 뿐만 아니라, 5%의 SDS로 24시간 동안 처리하여도 그 활성을 80% 이상 유지하므로 SDS에 매우 안정한 효소임을 확인하였다(도 4).
실시예 7 : 단백질 분해효소의 대두박 단백질 분해 활성
7-1 단백질 분해효소의 대두박 함유 단백질 분해 활성
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 회수한 단백질 분해효소의 가축 사료첨가제로 사용하기 위하여 대두박에 함유된 단백질의 가수 분해 능력을 측정하였다. 가축 사료에는 단백질 공급원으로서 대두박 등 여러 가지 식물성 박류를 일반적으로 사료 원료로 사용하고 있다. 대두박은 단백질 함량이 풍부하고(최대 약 40%), 아미노산 조성이 우수하여 가축 사료용 식물성 단백질 공급원으로 널리 사용되고 있다. 그러나, 대두박은 높은 단백질 함량에도 불구하고 난분해성 고형분 단백질을 다량으로 포함하고 있어 돼지와 닭 같은 소화 시간이 짧은 가축에서는 효율적으로 분해되지 못하므로, 소화 흡수율이 낮은 문제점을 가지고 있어 대두박을 사료로 공급할 경우에는 가축이 충분히 소화할 수 있도록 고형분 단백질을 분해시켜 공급하는 것이 필요하여 본 발명의 바실러스 속 CJB-01가 생산하는 단백질 분해효소에 의한 대두박 함유 단백질의 분해 능력을 측정하여 사료 첨가제로서의 응용성을 측정하였다. 구체적으로, 2.5 g의 탈지 대두박을 50 ㎖의 0.1 M 글리신-NaOH 완충용액(pH 10.5)에 잘 교반하여 현탁하고 상기 실시예 4에서 회수한 단백질 분해효소의 최종 활성이 용액 1 ㎖ 당 1,000 내지 2,500 U이 되도록 첨가한 후 50℃에서 2시간 내지 16시간 동안 잘 교반하여 주어 반응을 진행하였다. 상기와 같이 단백질 분해효소로 처리한 대두박 함유 단백질의 가수 분해 정도는 가수 분해에 의해 생성된 유리 아미노산 및 작게 분해된 펩티드의 티로신(tyrosin)의 양을 측정하여 계산하였다. 구체적으로, 단백질 분해효소를 처리한 대두박 시료를 각 시간 마다 1 ㎖씩 분취하여 14,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 회수하고, Laemmli의 방법으로 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 확인하였다(Nature 1970, 227, 680-685). 또한, 회수한 상층액 0.5 ㎖에 0.5 ㎖의 10% 트리클로로아세트산을 넣고 혼합하여 준 후 얼음에서 10 분간 방치하고 다시 14,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 반응하지 않은 단백질을 제거하고 상층액을 회수하여 Bradford 방법(Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254)으로 생성된 티로신의 양을 측정하였다.
그 결과, 바실러스 속 CJB-01가 생산하는 단백질 분해효소를 용액 1 ㎖ 당 1,000 U 내지 2,500 U의 단백질 분해효소로 처리하였을 때, 처리 시간이 길어짐에 따라 대두박 함유 단백질의 분해가 증가하였다. 특히 2,500 U의 단백질 분해효소로 2, 4, 8 및 16시간 동안 처리하였을 때, 티로신의 생성은 반응액 1 ㎖ 당 각각 2.54, 3.66, 4.28 및 6.78 ㎎으로 증가하여 대두박 함유 단백질을 효율적으로 분해하였다(표 13). 이러한 분해능은 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 확인하였을 때에도 처리 시간에 따라 대두박 함유 단백질의 분해가 증가함을 확인하였다(도 5). 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 생산한 단백질 분해효소는 대두박 함유 단백질을 효율적으로 분해하여 가축용 사료 첨가제로 유용함을 확인하였다.
처리 조건 처리시간 (h) 티로신(㎎/㎖) 가수분해율(배)
처리 전
1,000 U/㎖ 단백질 분해효소


　
2,500 U/㎖ 단백질 분해효소


　		 -
2
4
8
16
2
4
8
16		 0.60
1.93
2.02
2.39
3.19
2.54
3.66
4.28
6.78 		1.00
3.22
3.37
3.98
5.32
4.23
6.10
7.13
11.30
7-2 단백질 분해효소의 대두박 유래 트립신 저해제 불활성화 능
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 회수한 단백질 분해효소의 가축 사료첨가제로 사용하기 위하여 대두박에 함유된 트립신 저해제의 불활성화 능력을 측정하였다. 가축 사료의 주요한 단백질 공급원으로 사용되는 대두박은 항 영양인자 중의 하나인 트립신 저해제가 존재함으로써, 가축의 장에서 사료로 섭취한 단백질성 영양분을 소화하는 데 관여하는 트립신의 활성을 저해하여 단백질의 소화, 흡수를 감소시켜 사료 효율을 낮추어 주는 대표적인 항 영양인자로 알려져 있어 얼마나 효율적으로 트립신 저해제를 불활성화 시키는 지가 사료 첨가용 효소로서의 중요한 척도가 된다. 따라서, 본 발명의 바실러스 속 CJB-01가 생산하는 단백질 분해효소가 이러한 부정적인 역할을 하는 트립신 저해제를 효과적으로 불활성화 시키는 지를 확인하였다. 구체적으로, 2.5 g의 탈지 대두박을 50 ㎖의 0.1 M 글리신-NaOH 완충용액(pH 10.5)에 잘 교반하여 현탁하고 상기 실시예 4에서 회수한 단백질 분해효소의 최종 활성이 용액 1 ㎖ 당 1,000 내지 2,500 U이 되도록 첨가한 후 50℃ 에서 2시간 내지 16시간 동안 잘 교반하여 주어 반응을 진행하였다. 상기와 같이 처리한 대두박 효소 가수 분해 용액을 이용하여 트립신 저해 활성을 측정하였다. 구체적으로, 트립신 활성 측정 완충 용액(1 mM CaCl2를 포함하는 0.1 M 트리스-염산 완충용액, pH 8.2) 190 ㎕에 트립신 용액(1 mM HCl에 1 ㎎/㎖의 농도로 녹임) 5 ㎕ 및 대두박 가수분해물 5 ㎕를 잘 혼합한 후 37℃에서 10분 동안 방치하고 기질용액(N-α-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide; 50 ㎎을 5 ㎖의 70% 에탄올에 녹임) 10 ㎕를 첨가하고 잘 혼합한 후 37℃에서 30분간 더 반응시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 트립신 저해 활성을 확인하였다.
그 결과, 바실러스 속 CJB-01가 생산하는 단백질 분해효소를 1 ㎖ 당 1,000 U 내지 2,500 U의 단백질 분해효소로 처리하였을 때, 처리 시간이 길어짐에 따라 대두박에 존재하는 트립신 저해제의 활성이 감소하였다. 특히 2,500 U의 단백질 분해효소로 4, 8 및 16시간 동안 처리하였을 때, 트립신 활성 저해제의 활성은 89.4, 99.1 및 100% 정도 감소하여 8시간 이상 처리하면 트립신 저해제를 효율적으로 분해함을 확인하였다(도 6). 상기의 결과로부터 바실러스 속 CJB-01 균주에서 생산한 단백질 분해효소는 대두박의 트립신 저해제를 완벽하게 불활성화 함으로써 대두박에 포함되어 있는 단백질이 효율적으로 분해하여 장에서 쉽게 흡수되어 사료 효율을 증가시키는 효능을 가져올 것으로 판단되며 바실러스 속 CJB-01가 생산하는 단백질 분해효소는 가축용 사료 첨가제로 유용함을 확인하였다.
실시예 8 : 단백질 분해효소의 닭 성장 효능
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 회수한 단백질 분해효소를 이용하여 닭의 성장에 미치는 효능을 측정하였다. 사료 1 ㎏ 당 10,000 U의 단백질 분해효소를 함유하도록 잘 혼합하여 닭 사료를 제조하였다. 닭은 비교적 체중이 균일한 개체를 22,000 및 28,500 수를 사용하여 각각 대조군과 시험군으로 하였으며, 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하여 약 30일 간 사육하였다. 또한, 사료의 급여량 및 체중을 측정하여, 사료 효율 및 증체량 등을 계산하였다. 바실러스 속 CJB-01이 생산하는 단백질 분해효소를 투여한 닭의 성장에 미치는 효능을 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 바실러스 속 CJB-01가 생산하는 단백질 분해효소를 사료 1 ㎏ 당 10,000 U로 첨가한 사료를 30일 동안 섭취한 사육 시험구의 육성율은 99.0%로 대조구(96.6%) 보다 높은 생존율이 나타남을 확인하였다. 또한, 닭은 평균 수당 체중(1.54 ㎏), 평균 체중 증가량(1.49 ㎏) 및 사료 효율(1.48)에서 대조군에 비해 10% 이상 씩의 높은 성장 개선 효율을 나타내어 닭를 이용한 생체 시험에서 단백질 분해효소의 첨가가 성장 촉진 및 사료 효율 개선에 효과가 있음을 알 수 있어 바실러스 속 CJB-01가 생산하는 단백질 분해효소는 가축용 사료 첨가제로 유용함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18212P 20110610
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 바실러스 속 CJB-01(Bacillus sp. CJB-01) 균주(기탁번호: KCTC18212P).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 상기 제 1 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 생산 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 배양은 (a) 대두박, 면실박, 펩톤 및 트립톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 유기 질소원, 및 (b) 과당, 말토스, 포도당, 구연산 및 글루탐산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 탄소원을 포함하는 배지를 이용하여 실시하고, pH 7.0-12.0, 25-45℃ 배양온도, 0.1-5 vvm 통기조건, 200-900 rpm 및 20-96 배양 시간의 조건으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 통기조건은 0.5-1.5 vvm인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
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