TWI425087B - 用於生產納豆菌和／或納豆激酶的方法以及由該方法所獲得的發酵產物 - Google Patents

Description

用於生產納豆菌和/或納豆激酶的方法以及由該方法所獲得的發酵產物

本發明是有關於一種用於生產納豆菌(Bacillus subtilis natto )和/或納豆激酶(nattokinase)的方法，其包括：在通氣攪拌(aerobic agitation)的條件下，將一納豆菌菌株(strain)培養於一添加有一螺旋藻(Spirulina )材料的第一液體培養基(first liquid medium)中。

納豆是大豆經過枯草桿菌(Bacillus subtilis )的類緣菌「納豆菌(Bacillus subtilis natto )」發酵轉化後所形成的一種外觀上具有獨特氣味和拉絲黏性物質的發酵產物，它做為日本的傳統食品距今已有2000多年的歷史，也一直是日本人日常生活中重要的膳食食品之一。

納豆菌經鑑定具有下列菌學特徵(bacteriological characteristics)：革蘭氏陽性、過氧化氫酶(catalase)陽性的好氧菌(aerobic bacteria)，外型為桿狀，並且具有形成一堅固、保護性的內生孢子(endospore)的能力。納豆菌最早是在1905年由東京大學的Shin Sawamura博士從納豆中純化分離出，並被命名為Bacillus natto Sawamura 。之後，於1946年經美國Smith等人的研究，認為納豆菌應屬於枯草桿菌(Bacillus subtilis )的類緣菌(亞種)。因此，從Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology笫6版起，納豆菌在分類上被歸屬於枯草桿菌(Bacillus subtilis )。但是，由於納豆菌的維生素要求性或以γ－聚麩胺酸(γ－polyglutamic acid,γ－PGA)為主要成分的黏質物生產特性以及噬菌體的感染特異性顯然與枯草桿菌(Bacillus subtilis )不同，故在日本還是使用納豆菌(Bacillus natto 或Bacillus subtilis natto )的名稱，俾以與枯草桿菌(Bacillus subtilis )區別。此外，納豆菌另有分類學名為Bacillus subtilis subsp.natto或Bacillus subtilis var.natto。

納豆菌不會產生毒素並且一般被認為是安全(generally recognized as safe,GRAS)的細菌。納豆菌會產生耐胃酸與膽鹼的內生孢子，因此可以在腸道發揮益生菌的功效，包括幫助排便、抑制壞菌生長以及改變菌叢的生態。

納豆含有許多有益人體的營養成分，包括：皂素(saponin)、卵磷脂(lecithin)、異黃酮(isoflavone)、豐富多樣的維生素、胺基酸以及微量元素等。此外，納豆中亦含有納豆菌在發酵大豆的過程中所產生的獨特成分，包括多種黏性物質[例如，γ－PGA與菌果聚醣(levan)]與酵素[例如，納豆激酶(nattokinase)、蛋白分解酵素(proteolytic enzyme)、脂肪分解酵素(lipolytic enzyme)、醣解酵素(glycolytic enzyme)以及纖維分解酵素(cellulolytic enzyme)等]。因此，納豆在醫學上被認為是高附加機能的營養食品，長期食用納豆可以達到補充營養、改善血液循環與心血管疾病、抗癌、抗老化、減肥以及幫助睡眠等益生效用。

納豆激酶[枯草桿菌素NAT(subtilisin NAT)]是納豆菌所產生的一種絲胺酸蛋白酶(serine protease)，它的成熟胜肽(mature peptide)具有275個胺基酸。納豆激酶具有很強的纖 維蛋白分解活性(fibrinolytic activity)，並具有彈性酶與尿激酶活性，而且可以增強(enhance)胞漿素原活化物(plasminogen activator)以及不活化(inactivate)胞漿素原活化物抑制劑(plasminogen activator inhibitor)。當被口服地投予時，納豆激酶在胃或腸中都不會失去活性。

納豆激酶在活體外(in vitro )與活體內(in vivo )的試驗中皆已被證實具有強效的溶解血栓(thrombus)的能力。另外，有許多報導亦指出：納豆激酶具有降低血液黏度、增加血液流速、刺激組織胞漿素原活化物(tissue plasminogen activator,t－PA)的分泌以及幫助人體分泌可溶解血栓的胞漿素(plasmin)等之功效。

日本健康營養食品協會(Japan Health food & Nutrition food Association,JHNFA)在2003年公布「納豆菌發酵液食品」的標準，其中規定每天食用納豆激酶的量需超過2000 FU才具有保健的功效。在依照傳統方法所製得的固態納豆菌發酵食品中，納豆菌的數量約為1x10⁹ 至1x10¹⁰ CFU/g，而納豆激酶的活性約為20至40 FU/g，因此，若要達到每天2000 FU的納豆激酶食用量，則每天必須要吃50至100克的納豆。

為了有效地提高納豆菌的數量和/或納豆激酶以及維生素K₂ 等生理活性物質(physiologically active substance)的含量，有關於如何改善納豆的製備方法已被廣泛地研究。例如，US 6,669,971 B1揭示一種藉由下面步驟而被製得的納豆：將被蒸熟的大豆、煮過的大麥以及山藥(yam)混合以 形成一混合物，接著將納豆菌接種至該混合物中，以及在一發酵室中發酵該混合物。由此方法所得到的納豆幾乎是無臭、軟的、具有良好的味道以及黏性，並且所含有的功能性物質(functional substance)[例如維生素K₂ 以及酵素(諸如納豆激酶與蛋白酶)]被顯著地增加。

JP2006166812揭示一種用以增加納豆中的納豆激酶[已知為血栓分解酵素(thrombolytic enzyme)]含量的納豆製造方法，它包括：將濃度分別為0.1－1.5%(w/w)的酵母菌萃取物(yeast extract)以及海藻糖(trehalose)添加至經蒸熟的大豆中並予以發酵。藉由該方法所產生的納豆除了黏稠度增加之外，與傳統的納豆在風味以及味覺上大致相同，因而可供作為普通的納豆以及功能性食品(functional food)。

JP4084871揭示在一短時間內製備一具有良好品質(諸如味道、風味以及營養價值)的納豆的方法，該方法是由下面步驟所構成：將大豆浸泡在含有昆布萃取物(tangle extract)的水中、將該經浸泡的大豆蒸熟、將納豆菌接種至該被蒸熟的大豆中、發酵該大豆以及熟化(age)該經發酵的大豆。依據此件日本專利案，當一藉由在一特殊的酸性範圍(pH 2.0~6.5)下萃取昆布所產生的萃取物被用來作為昆布萃取物時，納豆菌的增殖(proliferation)被提高並且納豆的外觀與品質可被進一步改善，因為相較於以一不同於上述pH值範圍的液體所萃取出的其他昆布萃取物，該萃取物富含有納豆菌增生因子(Bacillus natto proliferation factor)。

JP2001352975揭示一種大量生產衍生自納豆的生理活 性物質[納豆激酶以及甲基萘醌－7(menaquinone－7)]的方法，它包括：將納豆菌接種至一藉由在製造燒酒(Sho－chu)[一種日本白酒(Japanese white liguor)]以及類似之物所產生的蒸餾酒粕中添加甘油(glycerol)而製成的培養基中以獲得一發酵產物，接著以一萃取劑(extractant)(諸如水或一有機溶劑)從該發酵產物中萃取出納豆激酶以及甲基萘醌－7。

近年來，因考量到回收純化以及操作條件的限制，供用於量產納豆激酶的製程大都涉及下面步驟：將納豆菌培育在液態發酵槽中，接著於適當時間點收集發酵液並予以離心過濾、管柱過濾或沈降濃縮以得到含有高量的納豆激酶的液體，之後，再將所得到的液體進行噴霧乾燥(spray drying)或冷凍乾燥(freeze drying)以得到納豆激酶。

為了因應市場上對於納豆菌和/或納豆激酶的廣大需求，當今產業界仍有需要去發展新的液態發酵培養技術以提高納豆菌和/或納豆激酶的產量。

螺旋藻(Spirulina )是一種呈螺旋狀的多細胞水生藻類，又有別名為藍藻(blue algae)或藍綠藻(blue－green algae)，藻體寬度只有數微米(micrometer,μm)，而藻絲長度可達300－500微米(μm)。它主要生長在鹼性鹽湖裡，原產地為非洲以及墨西哥等熱帶高溫的地方。

螺旋藻的種類繁多，包含有：Spirulina corakiana 、Spirulina crispum 、Spirulina labyrinthiformis 、Spirulina laxa 、Spirulina laxissima 、巨型螺旋藻(Spirulina major )、 極大螺旋藻(Spirulina maxima )、Spirulina meneghiniana 、Spirulina nordstedtii 、為首螺旋藻(Spirulina princeps )、鹽澤螺旋藻(Spirulina subsalsa )、纖細螺旋藻(Spirulina subtilissima )、鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis )、Spirulina tenerrima 、Spirulina weissii 等等。

螺旋藻含有豐富的蛋白質、人體無法自行合成的胺基酸、β－胡蘿蔔素(beta－carotene)、γ－亞麻油酸(gamma－linoleic acid)、維生素以及礦物質(例如鐵、鉀、鈉、鎂以及鈣等)等，因此自1970年代以來便廣受注意並被用作為營養食品。另外，螺旋藻經微生物發酵分解後的產物也被證實具有降血壓、增加免疫活性、促進細胞生長與膠原蛋白增生以及殺死癌細胞等功效。

一般常被培養作為營養食品的螺旋藻物種是鈍頂螺旋藻以及極大螺旋藻，它們的主要產地為美國、大陸、泰國以及南非等國家。鈍頂螺旋藻與極大螺旋藻的外觀形態以及營養成分大致相同，都含有相當高量的蛋白質，且胺基酸比例與人體所需的比例相近，是相當優質的蛋白質來源。

CN 1923996 A揭示一種含有螺旋藻活性肽、螺旋藻蛋白酶的螺旋藻產品及其製備方法和應用。此件大陸專利公開案是利用枯草芽孢桿菌對螺旋藻進行發酵處理，進而製備出含有螺旋藻活性肽、螺旋藻蛋白酶的螺旋藻產品。而依據此件大陸專利公開案所製得的螺旋藻產品具有溶解血栓的作用，對高黏血症(hyperviscosity syndrome)具有防治作用，可應用於人體高血壓病的防治。

在改善納豆菌和/或納豆激酶的液態發酵培養過程中，申請人意外發現：在液體培養基中添加螺旋藻，可以有效地提高納豆菌和/或納豆激酶的產量。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於生產納豆菌(Bacillus subtilis natto )和/或納豆激酶(nattokinase)的方法，其包括：在通氣攪拌的條件下，將一納豆菌菌株培養於一添加有一螺旋藻(Spirulina )材料的第一液體培養基中。

在第二個方面，本發明提供一種發酵產物，它是藉由在通氣攪拌的條件下，將一納豆菌菌株培養於一添加有一螺旋藻材料的液體培養基中而被製得。

在第三個方面，本發明提供一種食品產品(food product)，它包含有一如上所述的發酵產物。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。

在本文中，術語“納豆菌”意欲涵蓋可被用於納豆生產的所有細菌菌株(bacterial strains)，包括那些學名為Bacillus natto 、Bacillus subtilis natto、Bacillus subtilis subsp.natto或Bacillus subtilis var.natto的細菌菌株。

為了能夠在產業上大規模地生產納豆菌和/或納豆激酶，申請人經多方研究後發現：在納豆菌的液態發酵培養過程中添加螺旋藻，可以有效地提高納豆菌和/或納豆激酶的產量。於是，本發明提供一種用於生產納豆菌和/或納豆激酶的方法，其包括：在通氣攪拌的條件下，將一納豆菌菌株培養於一添加有一螺旋藻材料的第一液體培養基中。

適用於本發明的螺旋藻是選自於下列所構成的群組：Spirulina corakiana 、Spirulina crispum 、Spirulina labyrinthiformis 、Spirulina laxa 、Spirulina laxissima 、巨型螺旋藻(Spirulina major )、極大螺旋藻(Spirulina maxima )、Spirulina meneghiniana 、Spirulina nordstedtii 、為首螺旋藻(Spirulina princeps )、鹽澤螺旋藻(Spirulina subsalsa )、纖細螺旋藻(Spirulina subtilissima )、鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis )、Spirulina tenerrima 、Spirulina weissii ，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該螺旋藻是選自於下列所構成的群組：鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻，以及它們的組合。在本發明的一個更佳具體例中，該螺旋藻是 鈍頂螺旋藻。

依據本發明，該螺旋藻材料可以是天然的材料(natural material)或經加工處理的產物(processed material)(例如，經冷凍乾燥或噴霧乾燥的產物)。在本發明的一個較佳具體例中，該螺旋藻材料是經加工處理的螺旋藻粉。

在本發明的一個較佳具體例中，該螺旋藻材料在被添加至該第一液體培養基之前有先經過一加工處理(processing treatment)。該加工處理包括，但不限於：酵素水解處理(enzymatic hydrolysis treatment)、熱處理(heat treatment)、高溫高壓處理、高壓均質處理(high pressure homogenization treatment)、酸處理、鹼處理以及冷凍解凍處理(freezing－thawing treatment)。

有關螺旋藻材料的加工處理可以採用熟習此項技藝者所知且慣用的技術來進行。例如，有關酵素水解處理可以參考TW200615002，而有關熱處理可以參考TW200700019。

在本發明的一個較佳具體例中，該第一液體培養基被添加以呈一濃度範圍落在0.1至4%(w/v)內的該螺旋藻材料。在本發明的一個更佳具體例中，該第一液體培養基被添加以呈一濃度範圍落在0.5至2%(w/v)內的該螺旋藻材料。在本發明的一個更佳具體例中，該第一液體培養基被添加以呈一濃度為0.5%(w/v)的該螺旋藻材料。

依據本發明，適用於培養納豆菌的液體培養基是熟習此項技藝者所熟知的。例如，該液體培養基可以是一合成培養基(synthetic medium)或一含有一天然物質的半合成培 養基(semi－synthetic medium)。

當該液體培養基是一合成培養基時，它的組成可以包含有一適於納豆菌生長的碳源(carbon source)以及一適於納豆菌生長的氮源(nitrogen source)。

依據本發明，適用於配製該合成培養基的碳源包括，但不限於：葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、澱粉、甘露糖、海藻糖、糖蜜、玉米澱粉以及麥芽萃取物等等。在本發明的一個較佳具體例中，該碳源是選自於葡萄糖、糖蜜以及它們的組合。

依據本發明，適用於配製該合成培養基的氮源包括，但不限於：(NH₄ )₂ SO₄ 、(NH₄ )₃ PO₄ 、NH₄ NO₃ 、NH₄ Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、尿素(urea)、蛋白腖(peptone)、胰化腖(tryptone)、肉類萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)以及酵母粉(yeast powder)等等。

依據本發明，該合成培養基可進一步包含有一選自於下列群組中的無機鹽(inorganic salts)：K₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、MgSO₄ 、CaCl₂ 、NaCl、MnSO₄ 、FeCl₃ 、NaHCO₃ 、MgCl₂ 、FeSO₄ ，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該合成培養基包含有K₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、MgSO₄ 以及CaCl₂ 。

當該液體培養基是一含有一天然物質的半合成培養基時，適用於本發明的該天然物質包括，但不限於：大豆粉(soybean flour)、豆餅(bean cake)、豆粕(bean meal)、大豆蛋白萃取物、花生餅(peanut cake)、玉米粉(maize flour)、米糠(rice bran)、酒糟(vinasse)、大麥、山藥、蠶蛹粉(silkworm pupa meal)以及魚粉(fish meal)等等。在本發明的一個較佳具體例中，該天然物質是大豆粉。

依據本發明，該半合成培養基可進一步包含有一選自於下列群組中的碳源：葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、澱粉、甘露糖、海藻糖、糖蜜、玉米澱粉、麥芽萃取物以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該碳源是選自於葡萄糖、糖蜜以及它們的組合。

依據本發明，該半合成培養基可進一步包含有一選自於下列群組中的無機鹽：K₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、MgSO₄ 、CaCl₂ 、NaCl、MnSO₄ 、FeCl₃ 、NaHCO₃ 、MgCl₂ 、FeSO₄ ，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該半合成培養基進一步包含有K₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、MgSO₄ 以及CaCl₂ 。

較佳地，適用於本發明的該第一液體培養基具有一落在5至8的範圍內之初始pH值。更佳地，該第一液體培養基具有一落在5.5至7.5的範圍內之初始pH值。在本發明的一個較佳具體例中，該第一液體培養基具有一為7.5的初始pH值。

適用於本發明之通氣攪拌的條件是熟習此藝者可以根據本身的專業素養來決定的。較佳地，適用於本發明之通氣攪拌的條件是會使得發酵培養物內的溶氧量不低於70%。在本發明的一個較佳具體例中，該通氣攪拌的條件包括一為0.5－1.5 VVM/min的通氣量。較佳地，該通氣攪拌的條件包括一為1 VVM/min的通氣量。在本發明的另一個較佳具體例中，該通氣攪拌的條件包括一為100－800 rpm的 攪拌速率。較佳地，該通氣攪拌的條件包括一為200－500 rpm的攪拌速率。

依據本發明，在培養該納豆菌菌株的期間當中，可以將一添加有一螺旋藻材料的第二液體培養基進料給該納豆菌菌株。上面有關於該第一液體培養基的技術描述亦適用於該第二液體培養基。在本發明的一個較佳具體例中，該第一液體培養基與該第二液體培養基被添加以不同濃度的該螺旋藻材料。在本發明的一個更佳具體例中，該第二液體培養基被添加以一濃度較該第一液體培養基所具者為高的該螺旋藻材料。

本發明亦提供一種發酵產物，它是藉由在通氣攪拌的條件下，將一納豆菌菌株培養於一添加有一螺旋藻材料的液體培養基中而被製得。

該發酵產物藉由納豆菌內生孢子的定量與納豆激酶的活性分析而被證實含有高量的納豆菌和/或納豆激酶。因此，本發明亦預期該發酵產物在製備用以抗老化、抗癌、減肥、健胃整腸、促進血栓溶解以及預防糖尿病等的保健食品與非處方醫藥品上的應用。

於是，本發明亦提供一種食品產品，其包含有一如上所述的發酵產物。該發酵產物可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時被添加，或是被配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，該食品產品的種類包括，但不限於：奶粉(milk powder)、飲料(beverages)、甜點(confectionery)、 糖果(candies)、發酵食品(fermented food)、動物飼料(animal feeds)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

較佳實施例之詳細說明

本發明將藉由下面的實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明之用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 A、實驗材料：

1.製備納豆菌接種源(Preparation of an inoculum ofBacillus subtilis natto )：在下面實驗中所使用的納豆菌菌株是從購買自日本傳統市場的納豆食品中分離出，且經鑑定確認是屬於納豆菌(Bacillus subtilis natto )。

將上述所得到的納豆菌菌株接種於一營養肉湯培養基(nutrient broth)(Merck,1.05443)中，並於一恆溫振盪培養箱(37℃、150 rpm)內進行培養歷時12小時。所形成的培養物被使用作為下面實施例中的納豆菌接種源。

2.在下面的液體培養基以及進料培養基(feed medium)中所使用的螺旋藻粉是購自於南寶國際生物科技股份有限公司，螺旋藻的種類是鈍頂螺旋藻。

3.在下面的實施例中，用於培養納豆菌的液體培養基具有下面表1所示的配方。

4.下面實施例中所使用的進料培養基具有下面表2所示的配方。

B、一般實驗方法：

1.納豆菌內生孢子的定量： 在一玻璃試管中加入1 mL之下面實施例中所獲得的發酵培養物(fermented culture)以及9 mL的無菌水並予以震盪均勻，然後於70℃水浴下作用歷時30分鐘以殺死非呈內生孢子型態的納豆菌。之後，於無菌操作台上將所形成的樣品溶液進行10倍連續稀釋(10－fold serial dilution)而配製成具有不同濃度的樣品溶液。分別取出0.1 mL之經10³ －、10⁵ － 以及10⁷ －倍稀釋的樣品溶液，並將之均勻塗抹於營養瓊脂培養基(nutrient agar)(Difco,213000)上，於37℃下靜置培養(不照光)歷時36小時後，觀察計算菌落數並依據稀釋倍數換算出發酵培養物中所含有的納豆菌內生孢子的數量。

2.納豆激酶活性分析(nattokinase activity assay)： (1)稀釋液的製備： 將0.344 g CaSO₄ ．2 H₂ O以及0.585 g NaCl溶解在蒸餾水(distilled water)中，接著加入2 mL的醋酸緩衝液(pH 6.0)以及0.5 mL的Triton X－100溶液，最後加入蒸餾水至總體積為1 L。

(2)樣品溶液的製備： 將下面實施例中所獲得的發酵培養物或經過噴霧乾燥的發酵培養物粉末(fermented culture powder)以依據上面第(1)項所製備的稀釋液來進行稀釋，並以在波長275 nm下具有一介於0.04至0.08之間的吸光值的稀釋溶液來作為進行納豆激酶活性分析的樣品溶液。

(3)納豆激酶活性分析的操作程序： 納豆激酶活性分析是參考A.Takanoet al .(2006),Investigative Ophthalmology & Visual Science ,47：2075－2079中所描述的方法來進行。首先，將0.4 mL的0.72%纖維蛋白原(fibrinogen)(fibrinogen fraction I，type I－S，產品編號F－8630；Sigma)與1.4 mL的硼酸緩衝液(borate buffer)(含有50 mM Na₂ B₄ O₇ ．10 H₂ O以及0.9% NaCl,pH 8.5)置於一試管中，然後於37±0.3℃水浴下作用歷時5分鐘。接著，加入 0.1 mL的凝血酶溶液(thrombin solution)(20 U/mL，產品編號T－6634；Sigma)並予以混合均勻，由此所形成的溶液持續於37±0.3℃水浴下作用直至歷時正好10分鐘。之後，加入0.1 mL的樣品溶液並予以混合歷時5秒。

接著，於37±0.3℃水浴下作用，在作用起始後的第20與第40分鐘再分別予以混合歷時5秒。在作用起始後的第60分鐘，加入2 mL的200 mM三氯乙酸(trichloroacetic acid)並予以混合均勻，然後於37±0.3℃水浴下作用歷時20分鐘。之後，將所形成的溶液置於一微量離心管(microcentrifuge tube)中，並以15,000 g來進行離心歷時5分鐘。接著，取1 mL的上清液並以分光光度計(Metertech,UV/VIS SP8001)來測量波長275 nm下的吸光值。

另外，空白對照組的納豆激酶活性分析是參照上述方法來進行，不同之處在於：在加入0.1 mL的凝血酶溶液並於37±0.3℃水浴下作用直至歷時正好10分鐘之後，先加入2 mL的200 mM三氯乙酸(trichloroacetic acid)並予以混合歷時5秒，接著再加入0.1 mL的樣品溶液並予以混合歷時5秒，然後於37±0.3℃水浴下作用歷時20分鐘。

在本分析方法中，1單位[纖維蛋白降解單位(fibrin degradation unit,FU)]的酵素活性被定義為：離心後的反應溶液(排除酸不可溶的物質)在波長275 nm下的吸光值每分鐘增加了0.01。發酵培養物的納豆激酶活性(FU/ml)或經噴霧乾燥的發酵培養物粉末的納豆激酶活性(FU/g)是藉由下列公式而被計算出：A＝[(B－C)/0.01]×(1/60)×(1/0.1)×D A＝納豆激酶活性 B＝實驗組的吸光值 C＝空白對照組的吸光值 D＝樣品溶液的稀釋倍數

實施例1. 螺旋藻(Spirulina )的濃度對於納豆菌(Bacillus subtilis natto )的實驗室規模批次發酵(laboratory scale batch fermentation)之影響

將200 mL之含有不同濃度[包括0、1、2以及3%(w/v)]的螺旋藻粉的液體培養基(參見上面“A、實驗材料”中的表1)分別加入至一為500 mL的三角燒瓶中，然後於121℃、1.2大氣壓力下進行滅菌歷時20分鐘。接著，當三角燒瓶的溫度降低至37℃時，將納豆菌接種源分別以一為約5%(v/v)的接種量接種至各個三角燒瓶中，然後使該等三角燒瓶在一為37℃的溫度以及一為200 rpm的振盪速率下進行發酵歷時72小時。之後，收集發酵培養物並且依照上面“B、實驗方法”的第1項「納豆菌內生孢子的定量」與第2項「納豆激酶活性分析」中所述的方法來進行分析。

所得到的實驗結果被顯示於下面的表3中。從表3可見，當納豆菌被接種在含有螺旋藻粉[1、2或3%(w/v)]的液體培養基中並經過72小時的發酵，所獲得的發酵培養物中被測得的納豆菌內生孢子的數量以及納豆激酶的活性相較於被接種在不含有螺旋藻粉的液體培養基所具者都有明顯的增加。特別地，在含有1或2%(w/v)螺旋藻粉的組別，所獲得 的發酵培養物中被測得的納豆激酶活性皆比不含有螺旋藻粉的組別增加了一倍以上。這個結果顯示：在納豆菌的批次發酵培養過程中添加螺旋藻，可以有效地提高納豆菌內生孢子的數量以及納豆激酶的活性，且螺旋藻的濃度會影響納豆菌內生孢子的數量以及納豆激酶的活性。

實施例2. 螺旋藻的添加對於納豆菌的大規模批次發酵(large scale batch fermentation)之影響

將6 L的液體培養基(參見上面“A、實驗材料”中的表1，添加有0.5%螺旋藻粉)加入至一為10 L的發酵槽(B.E.Marubishi MDL－6C)中，然後於121℃、1.2大氣壓力下進行滅菌歷時40分鐘。接著，當發酵槽的溫度降低至37℃時，將納豆菌接種源以一為約5%(v/v)的接種量接種至發酵槽中，然後使該發酵槽在一為37℃的溫度、一為1 VVM/min的通氣量以及一為300－500 rpm的攪拌速率(當反應混合物內的溶氧量低於70%時，將攪拌速率提高至500 rpm)下進行發酵歷時48小時。另外，不含有螺旋藻粉的液體培養基被用來作為對照組並進行相同的實驗。

之後，收集所獲得的發酵培養物並且依照上面“B、實 驗方法”的第1項「納豆菌內生孢子的定量」中所述的方法來進行分析。另外，取部分的發酵培養物來進行噴霧乾燥處理，藉此所得到的發酵培養物粉末依照上面“B、實驗方法”的第2項「納豆激酶活性分析」中所述的方法來進行分析。

由實驗結果發現，納豆菌內生孢子的數量以及納豆激酶的活性會因為液體培養基中是否含有螺旋藻粉而有所差異。當納豆菌被接種在不含有螺旋藻粉的液體培養基中並經過48小時的發酵，所獲得的發酵培養物中被測得的納豆菌內生孢子的數量為2.76×10⁹ CFU/mL，而經過噴霧乾燥的發酵培養物粉末中被測得的納豆激酶活性為1520 FU/g。

相對地，當納豆菌被接種在含有0.5%螺旋藻粉的液體培養基中並經過48小時的發酵，所獲得的發酵培養物中被測得的納豆菌內生孢子的數量為3.45×10⁹ CFU/mL，而經過噴霧乾燥的發酵培養物粉末中被測得的納豆激酶活性為1855 FU/g，與對照組相較之下分別增加了25%與22%。這個結果顯示：在納豆菌的批次發酵培養過程中添加螺旋藻，可以有效地提高納豆菌內生孢子的數量以及納豆激酶的活性。

實施例3. 螺旋藻的添加對於納豆菌的進料批次發酵(feed－batch fermentation)之影響

本實施例是參照上面實施例2當中所述的方式來進行，不同之處在於：使用4 L的液體培養基(參見上面“A、實驗材料”中的表1，添加有0.5%螺旋藻粉)來進行納豆菌接種源的培養，並且在納豆菌接種源被接種至發酵槽並培養 歷時8小時之後，以200 mL/hr的速率將進料培養基(參見上面“A、實驗材料”中的表2，添加有2.9%螺旋藻粉)進料(feeding into)至發酵槽中。另外，不含有螺旋藻粉的液體培養基與進料培養基被用來作為對照組並進行相同的實驗。

之後，收集所獲得的發酵培養物並且依照上面“B、實驗方法”的第1項「納豆菌內生孢子的定量」與第2項「納豆激酶活性分析」中所述的方法來進行分析。

由實驗結果發現，納豆菌內生孢子的數量以及納豆激酶的活性會因為液體培養基與進料培養基中是否含有螺旋藻粉而有所差異。當納豆菌被接種在不含有螺旋藻粉的液體培養基中並以不含有螺旋藻粉的進料培養基進行進料批次發酵歷時48小時，所獲得的發酵培養物中被測得的納豆菌內生孢子的數量為4.16×10⁹ CFU/mL，而納豆激酶活性為134 FU/mL。

相對地，當納豆菌被接種在含有0.5%螺旋藻粉的液體培養基中並以含有2.9%螺旋藻粉的進料培養基進行進料批次發酵歷時48小時，所獲得的發酵培養物中被測得的納豆菌內生孢子的數量為7.28×10⁹ CFU/mL，而納豆激酶活性為159 FU/mL，與對照組相較之下分別增加了75%與18.6%。這個結果顯示：在納豆菌的進料批次發酵培養過程中添加螺旋藻，可以有效地提高納豆菌內生孢子的數量以及納豆激酶的活性。

於本案說明書中被引述之所有文獻資料以及專利文件以它們的整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時， 本案的詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims (17)

1. 一種用於生產納豆菌(Bacillus subtilis natto )的方法，其包括：在通氣攪拌的條件下，將一納豆菌菌株培養於一添加有一呈一濃度範圍落在0.5至3%(w/v)內的螺旋藻(Spirulina )材料的第一液體培養基中。
2. 一種用於生產納豆激酶(nattokinase)的方法，其包括：在通氣攪拌的條件下，將一納豆菌菌株培養於一添加有一呈一濃度範圍落在0.5至3%(w/v)內的螺旋藻材料的第一液體培養基中。
3. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該螺旋藻材料是來自一選自下列群組中的螺旋藻：Spirulina corakiana 、Spirulina crispum 、Spirulina labyrinthiformis 、Spirulina laxa 、Spirulina laxissima 、巨型螺旋藻(Spirulina major )、極大螺旋藻(Spirulina maxima )、Spirulina meneghiniana 、Spirulina nordstedtii 、為首螺旋藻(Spirulina princeps )、鹽澤螺旋藻(Spirulina subsalsa )、纖細螺旋藻(Spirulina subtilissima )、鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis )、Spirulina tenerrima 、Spirulina weissii ，以及它們的組合。
4. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該螺旋藻材料是天然的材料。
5. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該螺旋藻材料是經加工處理的產物。
6. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該螺旋藻材料在 被添加至該第一液體培養基之前有先經過一選自於由下列所構成之群組中的加工處理：酵素水解處理、熱處理、高溫高壓處理、高壓均質處理、酸處理、鹼處理以及冷凍解凍處理。
7. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該第一液體培養基是一合成培養基。
8. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該第一液體培養基是一含有一天然物質的半合成培養基。
9. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該天然物質是選自於由下列所構成的群組：大豆粉(soybean flour)、豆餅(bean cake)、豆粕(bean meal)、大豆蛋白萃取物、花生餅(peanut cake)、玉米粉(maize flour)、米糠(rice bran)、酒糟(vinasse)、大麥、山藥、蠶蛹粉(silkworm pupa meal)、魚粉(fish meal)，以及它們的組合。
10. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該半合成培養基進一步包含有一選自於下列群組中的碳源：葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、澱粉、甘露糖、海藻糖、糖蜜、玉米澱粉、麥芽萃取物，以及它們的組合。
11. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該半合成培養基進一步包含有一選自於下列群組中的的無機鹽：K₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、MgSO₄ 、CaCl₂ 、NaCl、MnSO₄ 、FeCl₃ 、NaHCO₃ 、MgCl₂ 、FeSO₄ ，以及它們的組合。
12. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該第一液體培養基具有一落在5至8的範圍內之初始pH值。
13. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其中該通氣攪拌的條件是會使得發酵培養物內的溶氧量不低於70%。
14. 如申請專利範圍第1或2項的方法，其進一步包括將一添加有一螺旋藻材料的第二液體培養基進料給該納豆菌菌株。
15. 如申請專利範圍第14項的方法，其中該第二液體培養基被添加以一濃度較該第一液體培養基所具者為高的該螺旋藻材料。
16. 一種發酵產物，它是藉由一如申請專利範圍第1或2項之方法而被製得。
17. 一種食品產品，其包含有一如申請專利範圍第16項的發酵產物。