CN103403146B - 用于针对弧菌的生物控制的益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于针对弧菌的生物控制的益生菌，具体而言，本发明涉及能降解致病性弧菌的群体感应信号分子并抑制生物膜形成的新分离的芽孢杆菌菌株；通过培养所述菌株获得的发酵液，发酵液的浓缩物或干燥品；包含所述菌株、发酵液、浓缩物或干燥品的益生菌组合物、饲料添加剂、抗菌剂或用于提升水质的制剂；通过使用所述菌株、发酵液、浓缩物或干燥品来养殖鱼类或甲壳类动物的方法，降解哈氏弧菌的群体感应信号分子并抑制生物膜形成的方法，预防动物中细菌感染的方法和提升水质的方法。

Description

用于针对弧菌的生物控制的益生菌
技术领域
本发明涉及用于针对弧菌(Vibriosp.)的生物控制的益生菌，具体而言，本发明涉及能降解致病性弧菌的群体感应信号分子并抑制生物膜形成的新分离的芽孢杆菌菌株；通过培养所述菌株获得的发酵液，所述发酵液的浓缩物或干燥品；包含所述菌株、发酵液、浓缩物或干燥品的益生菌组合物、饲料添加剂、抗菌剂或用于提升水质的制剂；通过使用所述菌株、发酵液、浓缩物或干燥品来养殖鱼类或甲壳类动物的方法；通过向水产养殖场添加所述菌株、发酵液、浓缩物或干燥品来降解哈氏弧菌(Vibrioharveyi)的群体感应信号分子并抑制生物膜形成的方法，通过添加所述菌株、发酵液、浓缩物或干燥品来预防动物中细菌感染的方法和通过所述菌株、发酵液、浓缩物或干燥品的处理来提升水质的方法。
背景技术
随着世界人口的增加和人们生活标准的提高，在美国、欧洲和日本等发达国家中，投入了大量的精力来改善饮食生活以预防成人疾病。因此，对于水产品的需求持续增加，导致水产养殖产量的快速增长。水产养殖行业已经成为许多国家经济的重要支柱，养殖鱼中疾病的暴发会造成重大的经济损失(JoseLuisBalcazaretal.Veter.Microbio.2006.114:173-186;Laurentvenrschuereetal.Microbio.Mot.Biol.Rev.Dec.2000.655-671)。
弧菌是一种能造成鱼类和虾类养殖场中细菌感染的致病菌，它的主要问题是产生毒性，次要危害是形成生物膜。也就是说，弧菌能产生并释放称为自诱导物（或AI）或者信息素的低分子量的信号分子。对信号分子的最低阈值刺激浓度的检测能识别周围弧菌的细胞密度，从而导致基因表达和多种生理活性的改变，包括共生、毒力、感受态、结合、抗生素产生、运动性、孢子形成和生物膜形成(Miller,M.B.etal.Annu.Rev.Microbiol.2001.55:165-199)。因此，监测微生物的群体密度及调控相关基因表达的过程称为群体感应。群体感应性质存在于革兰氏阴性和阳性细菌中。当细菌达到足够高的群体密度时，它们就能改变感染所需的基因表达以诱导大量的细胞合作进行宿主感染，它们也能躲避宿主的免疫反应，从而成功建立感染(Dangl.J.L.etal.,Nature.2001.411:826-833)。
群体感应的一个典型行为是生物膜形成。当低密度的微生物形成达到一定的群体的菌落时，群体感应信号分子的基因表达会产生黏液多糖，导致结构性生物膜的形成，所述生物膜参与65%的细菌感染(Kjelleberg,S.etal.CurrOpinMicrobiol.5(3),2002,254-258)。生物膜在宿主表面形成，造成感染性疾病。具体地说，在鱼类中，生物膜有利于致病性微生物的营养物质和氧气供给，阻止抗生素渗透，阻断免疫防御系统并降低消毒剂和益生菌的作用，还能引起抗生素抗性(Hall-Stoodley,L.etal.,NatRevMicrobiol.2(2),2004,95-108)。
自诱导物-1(AI-1)和自诱导物-2(AI-2)已知是在生物膜形成早期中由微生物分泌的化学信号分子。自诱导物-1为一种由LUX-1家族的AHL合成酶产生的AHL化合物，含有固定的高丝氨酸内酯部分和具有不同链长、饱和度及氧化态的酰基，例如，在革兰氏阴性细菌中作为信号分子的自诱导物-1为N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)。自诱导物-1也被报道为由多于70种革兰氏阴性菌所分泌的一种菌株特异性物质，所述革兰氏阴性菌包括假单胞菌(Pseudomonas)、伯克氏菌(Burkholderia)、耶尔森菌(Yersinia)、气单胞菌(Aeromonas)、农杆菌(Agrobacterium)、沙雷氏菌(Serratia)、欧文氏菌(Erwinia)、枸橼酸杆菌(Citrobacter)、肠杆菌(Enterobacter)、变形杆菌(Proteus)、色素杆菌(Chromobacterium)和根瘤菌(Rhizobiumsp.)(Taga,M.E.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003))。此外，据报道，自诱导物-2为一种由luxS基因表达的蛋白所产生的化合物，具有呋喃硼酸二酯结构，且为革兰氏阳性和阴性细菌中都存在的一种通用信号(Bassler,B.L.etal.Mol.Microbiol.9(1993)773-786)。luxS基因存在于大肠杆菌(E.coli)及多种菌体中，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、流感嗜血杆菌(Hemophilusinfluenza)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdoferi)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfrengens)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)。另外也有报导luxS基因能诱发哈氏弧菌中的荧光，并影响毒力、运动性、生物膜形成和抗生素产生所需的基因表达(Miller,M.B.etal.Annu.Rev.Microbiol.55(2001),165-199)。
同时，在一些情况下，在感染鱼致病性微生物鳗弧菌(Vibrioanguillarum)的虹鳟鱼(Rainbowtrout)群体中的致死率是80%-100%。然而，利用控制群体感应信号分子AHL的群体感应抑制剂呋喃酮的处理能控制群体感应，从而使得死亡率减少到4%-40%(Rasch,M.etal.Syst.Appl.Microbiol.27(2004),350-359)。因此，许多研究专注于群体感应信号分子以减少微生物感染的破坏。
例如，美国专利第641685号公开了一种抗菌剂，该抗菌剂含有用于光疗的光敏剂，该光敏剂连接于一段对自诱导物-2（AI-2）具有结合亲和力的多肽，其中所述多肽能杀灭细菌。美国专利第6936453号公开了一种筛选能调控自诱导物活性化合物的方法，其通过使自诱导物和化合物的混合物与能与自诱导物反应而发光的细菌细胞接触，然后将该荧光与仅与自诱导物接触的细菌发出的荧光比较。美国专利公开第2004-0009160号公开了一种群体感应抑制剂呋喃酮，该抑制剂受到致病菌信号分子HSL和AHL的调控。韩国专利公开第2008-0060777号公开了一种用作群体感应拮抗剂的抗菌性酰胺衍生物和使用其预防生物膜形成的方法。韩国专利第832565号公开了一种能用作群体感应拮抗剂的抗菌呋喃酮衍生物和使用其来预防生物膜形成的方法。韩国专利第841289、841294和841333号公开了一种具有抗菌活性同时能用作群体感应拮抗剂的抗菌高丝氨酸内酯衍生物、使用该衍生物去除戏细菌的方法和使用该衍生物预防生物膜形成的方法。
同时，随着环保式水产养殖需求的增加，使用益生菌作为免疫促进剂现在得到了广泛的认可。R.Fuller于1989年推广益生菌的应用，并将其制定为活的微生物饲料补充剂，它们通过提升宿主肠胃微生物平衡而对宿主产生有利影响。例如，诸如乳杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和芽孢杆菌(Bacillus)的细菌和诸如酵母(Saccharomyces)的酵母菌以及诸如曲霉菌(Aspergillus)的真菌都被用作益生菌。益生菌被归类为GRAS(一般认为安全(GenerallyRecognizedAsSafe))，不含有人类或动物有毒的基因，而且不产生致病性物质。益生菌是被批准能有效提升家畜的产量的微生物。益生菌的特征为非致病性、易于体外增殖、体内快速生长以及对酸和胆汁的抗性。另外，益生菌活性不应当受饲料成分的抑制，它们的作用应当能在室温下保持，而且它们应当能方便地与饲料混合。
益生菌能有效与能导致肠道疾病的致病菌竞争从而阻止它们对肠上皮的强力粘附，并能快速修复由于抗生素治疗而改变的肠道微生物菌群。此外，益生菌能阻止病原微生物的感染并抑制它们的增殖，通过提供最优条件来促进肠道微生物菌群的增殖，产生乳酸或乙酸来构成肠道有机酸，能降低肠道中pH值以阻止有害致病菌的增殖。因此，给予个体具有多重作用的益生菌能保持肠道微生物菌群并提高家畜生产力。在水产养殖中，益生菌也被添加到鱼类饲料或另外添加到水体中。最近的研究通过在鱼类或虾类的水产养殖中使用益生菌来提高对病原体的免疫力和改善水质(JiqiuLietal.Aquaculture291(2009)35-40)。
示例性的用于水产养殖中的生物控制的益生菌为诸如乳酸菌、肠球菌和芽孢杆菌的有益菌。芽孢杆菌为革兰氏阳性、杆状、形成内孢子细菌，而且在用作益生菌的菌株中具有独特的形态。诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的菌株被用作益生菌。芽孢杆菌的热抗性比不形成内孢子的乳酸菌更强。此外，芽孢杆菌能在胃屏障的低pH下生存，因此大多数摄食的芽孢杆菌能够完整到达小肠(Barbosa,T.M.etal.Appl.Environ.Microbiol.71(2005)968-978;Spinosa,M.R.etal.Res.Microbiol.151(2000):61-368)。已有报导利用芽孢杆菌作为人类膳食补充剂和动物增长促进剂，以及在水产养殖中利用芽孢杆菌来提高鱼类或虾类的生长和疾病抗性，提升水质和虾类生长速度，以及减少致病性弧菌(Dalmin,G.etal.IndianJ.Exp.Biol39(2001)939-942;Wang,Y.B.etal.Fish.Sci.71(2005)1034-1039)。
本申请的发明人从对鱼类和虾类水产养殖中的致病性细菌具有良好抗菌活性并具有良好消化酶产生的自然资源中分离出了益生菌，并对益生菌的形态学、生物化学和遗传学特征进行了检测。结果发现分离出的益生菌为具有良好热抗性的芽孢杆菌。特别是，此芽孢杆菌能控制水产养殖中的哈氏弧菌并降解群体感应信号分子自诱导物-2，从而抑制群体感应中的生理活性（共生、毒力、感受态、生物膜形成等）。
发明内容
技术问题
因此，本申请的发明人发现新分离的芽孢杆菌能抑制哈氏弧菌的生长，并控制群体感应来抑制生物膜的形成，因此能作为用于鱼类和甲壳类动物的水产养殖的益生菌组合物，从而完成本发明。
解决方案
本发明的一个目的是提供新分离的芽孢杆菌菌株，该菌株能降解致病性弧菌的群体感应信号分子并抑制生物膜的形成。
本发明的另一目的是提供通过培养该菌株获得的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品。
本发明的另一目的是提供益生菌组合物，该组合物含有上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品。
本发明的另一目的是提供饲料添加剂，该添加剂含有上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品。
本发明的另一目的是提供利用上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品养殖鱼类或甲壳类动物的方法。
本发明的另一目的是提供抗菌剂，该抗菌剂包含上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品。
本发明的另一目的是提供通过添加上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品来降解哈氏弧菌群体感应信号分子及抑制生物膜形成的方法。
本发明的另一目的是提供通过添加上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品来预防动物中由病原体引起的疾病的方法。
本发明的另一目的是提供水质改善制剂，该制剂包含上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品。
本发明的另一目的是提供通过利用上述菌株、发酵液、浓缩物或者干燥品的处理来提升水质的方法。
发明的有利效果
本发明新分离的芽孢杆菌CJS-26能控制水产养殖中哈氏弧菌的群体感应，从而抑制通过群体感应发生的生理活性（共生、毒力、感受态、生物膜形成等），并有效阻止致病性。因此，此菌株可以广泛用于能控制包括哈氏弧菌在内的细菌引起的疾病的多种产品中，例如水产养殖用的饲料添加剂、益生菌组合物和水质提升制剂。
附图简要说明
图1显示了本发明的芽孢杆菌CJS-26对哈氏弧菌群体感应信号分子自诱导物-2的降解作用；
图2显示了在培养30小时时，芽孢杆菌CJS-26抑制哈氏弧菌的生物膜形成；
图3显示了本发明的芽孢杆菌CJS-26的溶血现象的存在；
图4显示了本发明的芽孢杆菌CJS-26的氨利用。
本发明的最佳实施方式
在一个实施方案中，本发明提供了新分离的芽孢杆菌CJS-26（KCCM11144P）。该菌株能降解哈氏弧菌的群体感应信号分子并能抑制生物膜的形成。
具体而言，从江华岛(GanghwaIsland)附近的虾类养殖场收集海水来源样品，并在补充有3%氯化钠的BHI固体培养基中进行培养。接下来，对菌落进行观察以进行分组，分离菌株。在所分离的菌株中，通过初步筛选来选择对攻击感染养殖鱼类的代表性致病菌具有优良抗菌活性的菌株，所述致病菌包括杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)、海豚链球菌(Streptococcusiniae)和溶血性弧菌(Vibriohaemolyticus)。在初步筛选的具有优良抗菌活性的菌株中，通过二次筛选择出6种具有优良的消化酶活性的菌株，所述酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶。在二次筛选的菌株中，最终选择了能降解哈氏弧菌群体感应信号分子并抑制生物膜形成的芽孢杆菌CJS-26。
芽孢杆菌CJS-26形态学上为革兰氏阳性、杆状菌，通过16SrDNA碱基序列分析发现其与芽孢杆菌具有99%的同源性。因此，本申请的发明人于2010年12月14日将新分离的芽孢杆菌CJS-26在韩国培养物保藏联合会(KoreanFederationofCultureCollection，位于韩国微生物培养中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)，361-221，YurimB/D3F，Hongje-1-dong,西大门区，首尔)保藏为“芽孢杆菌CJS-26”（KCCM11144P）。
在另一实施方案中，本发明提供了该菌株的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品。具体来说，本发明的发酵液是指培养芽孢杆菌菌株CJS-26的培养基，优选为包含该菌株的培养基。
本发明所用的培养基是指包含培养动物细胞、植物细胞或者细菌所需的营养物的培养基，发酵液是指接种并培养菌株的液体培养基。发酵液可以为包含菌株的培养基，或者为通过将菌株从接种和培养菌株的发酵液中移除的培养滤液。发酵液的浓缩物是指通过浓缩发酵液得到的浓缩物，发酵液的干燥品是指通过移除发酵液中的水而得到的干燥品。干燥方法可以包括空气干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，但不限于这些方法。
在另一实施方案中，本发明提供了益生菌组合物，其包含作为活性成分的新分离的芽孢杆菌、所述芽孢杆菌的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品和药学可接受载体。
本发明中所用的术语“药学可接受载体”是指不会对生物产生显著刺激作用并不会消除所给予的化合物的生物活性和性能的载体或者稀释剂。为了将组合物配制为液体制剂，可以使用无菌的并且生物可相容的药学可接受载体，如盐水、无菌水、缓冲盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油以及上述一种或多种的混合物。如果需要，可以添加其他常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、细菌抑制剂等。此外，还可以将稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂添加到组合物来制备诸如水溶液、悬液和乳液的注射用制剂或者丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
益生菌在胃肠道中存活来抑制有害细菌和致病菌的增殖。此外，益生菌产生的有益消化酶促进营养物质的吸收和利用，从而提高饲料转化率。
本发明的组合物包含5×104至5×1010CFU/ml，优选1×106至1×109CFU/ml的芽孢杆菌CJS-26。
包含作为活性成分的本发明的组合物的口服剂型的实例可以包括片剂、糖锭、锭剂、水性悬液或乳化悬液、粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或者酏剂。对于诸如片剂和胶囊的制剂，可使用诸如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶的粘合剂，诸如磷酸氢钙的赋形剂，诸如玉米淀粉或甘薯淀粉的崩解剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二酯蜡的润滑剂。对于胶囊，除了上述化合物外，还可以使用诸如脂质的液体载体。
在另一实施方案中，本发明提供了饲料添加剂，其包含新分离的芽孢杆菌菌株、或该菌株的发酵液或者所述发酵液的浓缩物或干燥品。
一般说来，所有芽孢杆菌都能形成高度抗热的内孢子。因此，新分离的芽孢杆菌CJS-26可以制成饲料添加剂的形式，然后添加到饲料中。或者，可以在饲料制造过程中直接加入新分离的芽孢杆菌CJS-26。本发明的饲料中的芽孢杆菌CJS-26可以以液体或者干燥形式，优选为干燥粉末形式。干燥方法可以包括空气干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，但不限于此。本发明的芽孢杆菌CJS-26可以以粉末形式、基于饲料的重量按以重量计0.05到10%，优选以重量计0.1%到1%的比例进行混合。此外，对于水产养殖的饲料，除了本发明的芽孢杆菌CJS-26外，还可以包含常用的添加剂以提高贮藏性。
包含本发明的芽孢杆菌CJS-26的饲料可以包括基于植物的饲料，如谷类、坚果、食品加工副产品、藻、纤维、油、淀粉、粕和谷类副产品，以及基于动物的饲料，如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物质、脂肪、单细胞蛋白、浮游动物和鱼粉，但不限于此。
在本发明中，包含芽孢杆菌CJS-26的益生菌组合物还包含用于防止品质劣变的添加剂，例如粘合剂、乳化剂和防腐剂，以及用于提高饲料利用的添加剂，例如氨基酸、维生素、酶、调味剂、非蛋白氮、硅酸盐、缓冲剂、提取物和低聚糖，但不限于以上。此外，包含芽孢杆菌CJS-26的益生菌组合物还可以包含饲料预混料，但不限于此。
在另一实施方案中，本发明提供了养殖鱼类或者甲壳类动物的方法，包括以下步骤：使用新分离的芽孢杆菌、所述芽孢杆菌的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品对鱼类或甲壳类动物的水产养殖场进行处理。
如上文所述，本发明的新分离的芽孢杆菌CJS-26具有广泛的抗菌活性并能抑制共生、毒力、感受态、生物膜形成。因此，该菌株能用于预防水产养殖中由致病菌引起的疾病，从而实现鱼类或者甲壳类动物的安全养殖。
在另一实施方案中，本发明提供了抗菌剂，其包含新分离的芽孢杆菌菌株、该菌株的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品。此外，本发明提供了使用新分离的芽孢杆菌菌株、该菌株的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品来预防生物膜形成的方法，生物膜形成是鱼类或者甲壳类动物养殖场的污染来源，或者本发明提供了利用新分离的芽孢杆菌菌株、该菌株的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品预防非人的动物中由病原体引起的疾病的方法。
本发明中所用的术语“预防”意图包括通过给予组合物而抑制或延迟疾病进程的所有作用。
本发明的新分离的芽孢杆菌CJS-26对水产养殖中上述6种致病菌具有抗菌活性，而且能产生表现出良好的铁捕获能力的铁载体。因此，新分离的芽孢杆菌CJS-26能降解哈氏弧菌的群体感应信号分子自诱导物-2并抑制生物膜形成，从而控制哈氏弧菌的群体感应并抑制共生、毒力、感受态和生物膜形成。因此，能够预防由哈氏弧菌引起的疾病。此外，已经证明，新分离的芽孢杆菌CJS-26对水产养殖中6种代表性致病菌具有抗菌活性，而且在血琼脂平板中不会出现溶血现象。由此，新分离的芽孢杆菌可用于预防水产养殖中由上述致病菌引起的疾病。
致病菌是指能引起疾病的细菌，并且能被预防的具体致病菌包括：杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、哈氏弧菌、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)、海豚链球菌(Streptococcusiniae)和溶血性弧菌(Vibriohemolyticus)，最优选哈氏弧菌。
在另一实施方案中，本发明提供了水质改善制剂，其包含新分离的芽孢杆菌、该菌株的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品。
本发明的新分离的芽孢杆菌CJS-26抑制由哈氏弧菌形成的生物膜，并减少水产养殖环境中的氨含量。为了改善水质，可以将本发明的新分离的芽孢杆菌CJS-26单独制成水质改善制剂的形式，或者直接将该菌株或益生菌组合物进行喷洒。本发明的水质改善制剂中的芽孢杆菌CJS-26可以为液体形式或者干燥形式，优选干燥粉末形式。
对于水质改善制剂，可以使用无菌且生物可相容性载体，如盐水、无菌水、缓冲盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和上述一种或多种的混合物。如果需要，可以添加其它常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、细菌抑制剂等。此外，还可以向组合物添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以制备如水溶液、悬浮液、乳剂的注射用制剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或者片剂。
如果使用水质改善制剂，水产养殖场的水质可以得到改善。具体而言，可以在水产养殖之前或者养殖期间向水产养殖场加入水质改善制剂。优选的是在水产养殖之前将水质改善制剂加入水产养殖场，并保持预定时间。因此，本发明新分离的芽孢杆菌CJS-26可用来降解群体感应信号分子，从而抑制生物膜形成。此外，可以在水产养殖期间一次或者多次加入水质改善制剂，以防止另外的生物膜形成。
在另一实施方案中，本发明提供了提升水质的方法，包括以下步骤：利用新分离的芽孢杆菌、该菌株的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品对水进行处理。改善后的水可以用于水产养殖场，也可以用作家畜或者人类的饮用水。在此方面，在使用用新分离的芽孢杆菌、该菌株的发酵液、所述发酵液的浓缩物或者干燥品处理的水之前，优选对其进行纯化，按已知方法进行纯化水的步骤。
发明模式
在下文中，参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅仅是出于举例说明的目的，本发明不受这些实施例的限制。
实施例1：芽孢杆菌CJS-26的分离
实施例1-1：样品获得和菌株分离
考虑到具有高环境特异性和高宿主特异性的益生菌的特征，本申请的发明人在养殖疾病发生率低且生产力高的虾类养殖场收集了海水来源样品。将收集的样品连续稀释，涂布在补充有3%氯化钠的BHI琼脂(Difco,USA)上，随后在37℃培养24小时。通过菌落观察对从各个样品分离的菌株进行分组，并选择菌株。选择的菌落在新鲜培养基中培养3次以进行分离。将分离的菌株于-70℃或更低温度下保存在含20%甘油的培养基中。
实施例1-2：具有高抗菌活性的菌株的选择
为了初步选择对水产养殖中的代表性致病菌具有抗菌活性的菌株，检测了对6种细菌的抗菌活性，包括杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、哈氏弧菌、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)和溶血性弧菌(Vibriohaemolyticus)。
通过空白区分析(clearzoneanalysis)评估对致病菌的抗菌活性。具体来说，将3ml的0.7%琼脂（W/V）和150μl的6种致病菌(OD600=2.0)中每一种的振荡发酵液混合，并覆盖在BHI培养基上制成顶层琼脂。将10μl选择菌株的发酵液滴在制好的顶层琼脂上，并在30℃下培养18小时。接着，观察滴落菌株周围是否存在空白区（表1）。
表1初步筛选的菌株的抗菌活性
-：无活性；+：有活性
AS：杀鲑气单胞菌；
SI：海豚链球菌；
ET：迟钝爱德华菌；
VH：哈氏弧菌；
VP：溶血性弧菌；
VA：鳗弧菌。
如表1所示，在所有53种菌株中，对鱼类水产养殖中6种致病菌中的任一种具有抗菌活性的菌株共有20种（菌株编号：1、3、6、7、9、11、12、13、14、15、23、26、27、29、32、34、35、38、52和53）。其中的6种（菌株编号：7、9、15、32、34和38）仅对一种致病菌具有抗菌活性，而余下的14种（菌株编号：1、3、6、11、12、13、14、23、26、27、29、35、52和53）表现出针对2种或者更多种致病菌的复合抗菌活性。因此，初步筛选出了14种具有复合抗菌活性的菌株。
实施例1-3：具有高酶活性的菌株的选择
实施例1-3-1：粗酶提取物的收集
在具有复合抗菌活性的14种菌株中，选择具有复合消化酶活性的菌株。
具体而言，将从实施例1-2中选择的14种具有复合抗菌活性的菌株在BHI培养基中培养8和24小时，然后将它们的发酵液在4℃、13000rpm下离心5分钟，得到每个上清液。每一上清液被用作粗酶提取物来进行酶活性分析，如下文所述测定上清液中的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。
实施例1-3-2：蛋白酶活性
配制YM(Difco,USA)培养基，其补充有2%脱脂牛奶(Sigma,USA)作为蛋白酶底物。将实施例1-3-1中得到的每种粗酶提取物加入到底物培养基，并在30℃下反应2小时。在反应完成后，通过测量空白区的面积来确定每种粗酶提取物的蛋白酶活性，所述空白区是由每种粗酶提取物中包含的蛋白酶降解培养基中的底物而形成的。
实施例1-3-3：纤维素酶活性
配制YM培养基，其补充有1%CMC(羧甲基纤维素)作为纤维素酶底物，并加入实施例1-3-1中得到的每种粗酶提取物，在30℃下反应2小时。在反应完成后，通过测量空白区的面积来确定每种粗酶提取物的纤维素酶活性，所述空白区是由每种粗酶提取物中包含的纤维素酶降解培养基中的底物而形成的。
实施例1-3-4：淀粉酶活性
配制YM培养基，其补充有1%可溶性淀粉作为淀粉酶底物，并向底物培养基加入实施例1-3-1中得到的每种粗酶提取物，在30℃下反应2小时。在反应完成后，通过测量空白区的面积确定每种粗酶提取物的淀粉酶活性，所述空白区是由每种粗酶提取物中包含的淀粉酶降解培养基中的底物而形成的。
实施例1-3-5：脂肪酶活性
配制YM培养基，其补充有1%三辛酸甘油酯作为脂肪酶底物，并加入实施例1-3-1中得到的每种粗酶提取物，在30℃下反应2小时。在反应完成后，通过测量空白区的面积确定每种粗酶提取物的脂肪酶活性，所述空白区是由每种粗酶提取物中包含的脂肪酶酶降解培养基中的底物而形成的。
实施例1-3-6：选定菌株的酶活性的比较
比较实施例1-3-2至实施例1-3-5中测定的每种酶活性，再次选择出具有这4种酶的良好活性的6种菌株（菌株编号：11、12、14、23、26和52）（表2）。6种菌株分别指定为CJS11、CJS12、CJS114、CJS26、CJS59和CJS83。
表2二次筛选菌株的酶生产力
-：没有活性；+：有活性；++：良好的活性；+++：非常好的活性。
实施例2：具有群体感应控制作用和生物膜抑制作用的菌株的选择
从实施例1选择出的具有良好抗菌活性和酶活性的6种菌株中，选择能降解群体感应(包括自诱导物)和抑制生物膜形成的菌株。
实施例2-1：具有群体感应控制作用的菌株的选择
哈氏弧菌BB120(ATCCBAA-1116,USA)是响应于自诱导物-1和自诱导物-2的标准群体感应菌株，哈氏弧菌BB170为仅响应于自诱导物-2的突变菌株，将这两种菌株用于从实施例1选择出的6种具有良好抗菌活性和酶活性的菌株中选择能抑制哈氏弧菌中自诱导物2诱导的群体感应的菌株。在此方面，进行选择能抑制自诱导物-2活性的菌株的方法是基于哈氏弧菌BB120和哈氏弧菌BB170在彼此接近时能通过群体感应反应而发光。
首先，按照表3的组成，制备可以用于两种哈氏弧菌培养的群体感应评估培养基（AB培养基）。
表3用于群体感应评估的培养基组成（AB培养基）
随后，将0.5%（V/V）的哈氏弧菌BB120接种到AB培养基中，在30℃和200rpm下培养12小时，并将0.02%（V/V）的哈氏弧菌BB170接种到AB培养基中，在30℃和200rpm下培养3小时。将实施例1选择出的6种菌株中的每一种按0.1%（V/V）接种到BHI培养基中，培养8小时。
在培养完成后，于4℃和13000rpm下离心每种发酵液，并利用0.45μm滤器过滤得到上清液，从而得到各菌株的活性组分。
为了评测选择的6种益生菌菌株是否能降解哈氏弧菌群体感应信号分子自诱导物2(AHL)，将哈氏弧菌BB120培养上清液和每种选择的益生菌菌株的发酵液按1:1的比例进行混合，并反应3小时。接下来，将1%的反应液加入培养3小时的哈氏弧菌BB120中，并在30℃和200rpm下再培养4小时，用光度计来测量发光。
结果，6种选择的菌株能显著降解哈氏弧菌自诱导物-2(AHL)(p<0.001)。其中表现出最好的自诱导物-2(AHL)降解作用的3种菌株(CJS11、CJS26和CJS83)被选择出来（图1）。图1显示了本发明的芽孢杆菌CJS-26对哈氏弧菌群体感应信号分子自诱导物-2(AHL)的降解作用。
实施例2-2：对哈氏弧菌生物膜形成具有抑制作用的菌株的选择
为了选择能抑制哈氏弧菌生物膜形成的益生菌菌株，对上述能有效控制群体感应的菌株进行了评估。在哈氏弧菌培养后，采用生物膜形成组作为对照组，利用每种选择的益生菌菌株对处理组进行处理，按如下方法重复评估3次。
将200μl的哈氏弧菌接种到3ml补充有3%氯化钠的LB培养基中(Difco,USA)，并在30℃培养6小时。随后，加入200μl每种所选择的益生菌菌株，并再培养24小时。移除总共培养30小时的每种发酵液，用0.4%的结晶紫染色10分钟来检测生物膜的存在。
表430小时培养对生物膜形成的抑制作用的评估
如表4所示，哈氏弧菌形成了经结晶紫染色后的紫色生物膜带，而所有的益生菌菌株在30小时培养中都能抑制生物膜的形成（图2）。图2显示了培养30小时后，芽孢杆菌CJS-26抑制哈氏弧菌的生物膜形成。
实施例3：选择的菌株的鉴定及其生理学和生物化学表征
实施例3-1：菌株鉴定
在3种选择的菌株中，最终选择、鉴定和分析了能有效控制群体感应和抑制生物膜形成的CJS-26菌株。采用生理学、生物化学方法和分子系统学方法进行菌株鉴定。该菌株具有革兰氏阳性、杆状细菌的形态学特征。16SrDNA序列分析表明，该菌株与芽孢杆菌具有99%的同源性，表明是新的微生物。分离的菌株的16SrDNA的碱基序列如SEQIDNO.1所示。
通过利用PCR混合物(Bioneer,Korea)和通用引物27F和1492R扩增16SrDNA基因进行碱基序列分析，引物具有如下碱基序列：
27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(SEQIDNO.2)
1492R:5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQIDNO.3)
在20μl总反应体积中进行基因扩增以用于分析扩增的DNA的碱基序列，反应共进行30个循环，每个循环由以下组成：94℃持续1分钟，56℃持续1分钟，72℃持续1分钟。本发明的通过上述方法鉴定的新微生物于2010年12月14日在韩国培养物保藏联合会(KoreanFederationofCultureCollection，位于韩国微生物培养中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)，361-221，YurimB/D3F，Hongje-1-dong,西大门区，首尔)保藏为“芽孢杆菌CJS-26”（KCCM11144P）。
实施例3-2：生理学和生物化学表征
为了分析本发明的芽孢杆菌CJS-26的生物化学特征，利用API50CHB系统（韩国微生物培养中心，韩国）对该菌株的糖发酵模式进行了分析（表5）。
表5糖发酵模式结果
+：阳性；-：阴性
实施例4：安全性与利用性
实施例4-1：β-溶血
β-溶血为红细胞的完全溶解，这由产磷脂酶细菌对磷脂的水解引起的。
为了检测芽孢杆菌CJS-26的溶血作用，制备了含TSA（胰蛋白大豆琼脂）(Difco,USA)和5%绵羊血(KisanBiotech,Korea)的血琼脂平板。将本发明的芽孢杆菌菌株CJS-26划线涂布到制备好的血琼脂平板上，并于37℃培养24小时来检测溶血作用。在此方面，当培养的菌株周围的琼脂变成白色或者黄色时，确定为溶血作用。当培养的菌株周围未观察到颜色变化时，确定为无溶血作用（图3）。图3显示了本发明的芽孢杆菌CJS26的溶血作用。如图3所示，本发明的芽孢杆菌CJS-26未表现出溶血作用。
实施例4-2：氨利用
为了检测本发明的芽孢杆菌CJS-26的氨利用，制备了如下表6所示的含氨培养基。将0.1%的芽孢杆菌CJS-26接种到制备好的培养基中，并在30℃、200rpm下培养6小时、12小时和24小时。在每个培养时间收集发酵液样品。将收集的发酵液样品在4℃、13000rpm下离心5分钟，得到上清液，通过测量获得的上清液中的氨含量来定量消耗量（见图4）。
表6用于评估氨利用的培养基组成
图4显示了本发明的芽孢杆菌CJS-26的氨利用。如图4所示，培养基中氨的初始浓度为约400ppm。随着芽孢杆菌CJS-26生长而利用氨，在培养30小时后未检测到氨（图4）。培养基中未检测到氨提示，本发明的芽孢杆菌CJS-26能防止氨造成的水污染，并减少氨对鱼类或甲壳类动物的应激，从而提高养殖的鱼类或甲壳类动物的质量。
上述结果表明，芽孢杆菌CJS-26控制包括哈氏弧菌在内的致病菌的群体感应，具有抗菌活性，并能产生复合消化酶来提高鱼类摄食率和增重率并减少排泄，从而改善水质。
实施例5：益生菌的功效
为了检测本发明的芽孢杆菌CJS-26在添加到饲料并将饲料喂食给鱼类时能否实际表现出益生菌功能，将本发明的芽孢杆菌CJS-26与饲料混合，用混合后的饲料喂食牙鲆幼鱼8周，以此来确定增重率、日生长率、饲料转化率、蛋白质效率比率和存活率。
具体来说，制备成的基础饲料（对照组）含有等同于30%粗蛋白的能量含量，如表7所示。将本发明的芽孢杆菌CJS-26添加到基础饲料中，制成含有5%芽孢杆菌CJS-26的混合饲料，为了等同的能量含量，将纤维素的量减少为益生菌的添加量。
表7基础饲料组成
实验所用的牙鲆幼鱼初始均重为25g，随机选取25条幼鱼放入到150L圆形PP罐中。使用沙滤海水作为培养用水，并将流速控制在2-3L/分钟。罐装备有气泡石以用于氧气供给和培养水循环。采用荧光灯，在12L:12D的条件下保持光周期。在整个实验期间，培养水温保持在21-29℃的自然温度条件下。每天喂鱼两次至饱食。每三周测一次生长率，在测量前所有的鱼都饥饿24小时（见表8）。
表8牙鲆的益生菌功效
如表8所示，与对照组相比，添加芽孢杆菌CJS-26使生长率增加了大约16%，并且与对照组相比，饲料转化率和蛋白质效率比率也增加。与对照组相比，存活率也增加了大约21%。因此，本发明的菌株能够有效提高鱼类的消化率和增重率。
布达佩斯条约下国际承认的用于专利程序的微生物保藏
国际表
原始保藏的情况下的收据
由本页底部说明的国际保藏单位
根据规则第7条第1款发布
1如果应用规则6.4(d)，此日期是指获得国际保藏单位保藏状态时的日期；如果保藏是在获得国际保藏单位保藏状态后不依据布达佩斯条约保藏，之后转换成依据布达佩斯条约保藏的，此日期是指国际保藏单位收到该微生物的日期。
表BP/4单页

Claims (12)

1.芽孢杆菌(Bacillussp.)CJS-26KCCM11144P。
2.包含权利要求1所述的芽孢杆菌CJS-26KCCM11144P的发酵液、所述发酵液的浓缩物或干燥品。
3.益生菌组合物，包含作为活性成分的权利要求1所述的菌株或者权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品。
4.饲料添加剂，包含作为活性成分的权利要求1所述的菌株或者权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品。
5.如权利要求4所述的饲料添加剂，其中所述饲料添加剂用于鱼类或者甲壳类动物的水产养殖。
6.权利要求1所述的菌株或者权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品在制备用于养殖鱼类或甲壳类动物的制剂中的用途。
7.抗菌剂，包含权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品。
8.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品在制备用于降解哈氏弧菌(Vibrioharveyi)的群体感应信号分子并抑制生物膜形成同时在水产养殖场中养殖鱼类或甲壳类动物的制剂中的用途。
9.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品在制备用于预防动物中由致病菌引起的疾病的药物中的用途，其中所述致病菌选自杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)、海豚链球菌(Streptococcusiniae)和弧菌(Vibriosp.)。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述弧菌(Vibriosp.)选自哈氏弧菌、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和溶血性弧菌(Vibriohemolyticus)。
11.用于提升水质的制剂，包含作为活性成分的权利要求1所述的菌株或者权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品。
12.提升水质的方法，包括以下步骤：用权利要求1所述的菌株或者权利要求2所述的发酵液、浓缩物或干燥品来处理水。
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