CN115838659A - 一株粪肠球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌AT5及其应用。本发明所提供的粪肠球菌具体为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)AT5，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.24951。本发明的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)AT5CGMCCNo.24951能够有效提高黄姑鱼对红头病病原——哈维氏弧菌B0003的抗病力，增强感染哈维氏弧菌B0003后黄姑鱼的免疫功能，减少炎性因子产生，有效改善哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼肝脏损伤，降低哈维氏弧菌B0003攻毒后的发病率和死亡率。同时，本发明的枯草芽孢杆菌可制成菌剂用于预防或治疗黄姑鱼的红头病，是一种绿色、安全的水产饲料添加剂。

Description

一株粪肠球菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株粪肠球菌及其应用。

背景技术

黄姑鱼(Nibea albiflora)俗称黄姑子、黄婆鸡，在福建沿海地区俗称春子鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)，鲈亚目(Percoidei)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄姑鱼属(Nibea)，为近海中下层经济鱼类，主要分布于中国东海、日本南海，是我国主要的养殖经济鱼类之一。黄姑鱼年产量达6.7万吨以上，年养殖产量超过3万吨，具有较高的经济和养殖价值。近年来，随着东海渔业资源的枯竭，人工养殖黄姑鱼的规模不断扩大。与此同时，高密度的养殖环境加大了黄姑鱼疾病的风险。在黄姑鱼养殖中，红头病是黄姑鱼主要病害之一，患病鱼活性较弱、离群、游动缓慢，头部有明显红肿，感染后5～6天，死亡率可达50％以上，给养殖户造成巨大经济损失。实验室前期从患红头病的黄姑鱼病灶中分离出了哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和龙虾弧菌(V.panuliri)两种弧菌，经回归感染试验验证，哈维氏弧菌B0003(GenBank登录号：ON076875)是黄姑鱼红头病的主要病原菌。

虽然抗生素和化学药物的应用在一定时期内能够控制致病菌的侵害，但长期施用这些药物会造成细菌耐药性，同时会对养殖微生态环境造成破坏以及产生药物残留等严重的环境和食品安全问题。因此，寻求无残留无污染的抗生素及化学药物的有效替代品具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株粪肠球菌及其培养物、及其在制备菌剂或饲料添加剂中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用了以下技术方案：

一株粪肠球菌，该粪肠球菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称：CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCCNo.24951。

上述的粪肠球菌的培养物。

上述的粪肠球菌或粪肠球菌的培养物在制备菌剂或饲料添加剂中的应用。

一种菌剂，其包括上述的粪肠球菌或其培养物。

一种饲料添加剂，其包括上述的粪肠球菌或其培养物。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质，发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过比较易感和耐受哈维氏弧菌B0003黄姑鱼的肠道微生物，在耐受哈维氏弧菌的黄姑鱼肠道中筛选出了一株对哈维氏弧菌B0003具有较强拮抗作用的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)AT5 CGMCC No.24951，能能够有效提高黄姑鱼对红头病病原——哈维氏弧菌B0003的抗病力，增强感染哈维氏弧菌B0003后黄姑鱼的免疫功能，减少炎性因子产生，有效改善哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼肝脏损伤，降低哈维氏弧菌B0003攻毒后的发病率和死亡率。本发明将粪肠球菌干燥得到的粪肠球菌菌剂，可以作为添加剂用于制备黄姑鱼饲料。该饲料可有效提高黄姑鱼对哈维氏弧菌B0003的抗病力，降低哈维氏弧菌B0003攻毒后的发病率和死亡率。

保藏说明

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2022年05月23日

菌种名称：粪肠球菌

拉丁名：Enterococcus faecalis

菌株编号：AT5

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24951

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为黄姑鱼红头病症状图。

图2为哈维氏弧菌B0003的电镜图。

图3为粪肠球菌AT5对哈维氏弧菌B0003抑菌效果图。

图4哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼肝脏组织形态(HE染色)

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供粪肠球菌AT5的分离与鉴定

一、粪肠球菌AT5菌株来源

通过易感和耐受哈维氏弧菌B0003(黄姑鱼红头病症状如图1所示，哈维氏弧菌B0003的电镜图如图2所示)的黄姑鱼肠道差异微生物，发现粪肠球菌AT5(菌落形态：透明，圆形，极小菌落，表面光滑湿润)在易感哈维氏弧菌B0003的黄姑鱼肠道中大量存在，提示其可能有利于提高黄姑鱼对哈维氏弧菌B0003的抗病力。

二、粪肠球菌AT5的鉴定

S1.形态学鉴定

一方面，将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并筛选得到的菌株AT5进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。另一方面，对处于对数生长期的所述菌株AT5，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

分离并筛选得到的单菌落为：透明，圆形，极小菌落，表面光滑湿润。

分离并筛选得到的菌株AT5的培养基为MRS琼脂培养基。

S2.16S rDNA序列同源性分析

挑取平板上的单菌落进行16S rDNA测序鉴定，所得序列与GenBank数据库中已知序列进行比对，发现其16S序列与数据库中已知粪肠球菌序列相识度达99％(如SEQ ID NO:1所示)：

ACTGCAGTCGAACGCTTCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAAGAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAGTTTATGCCGCATGGCATAAGAGTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGACGGTATCTAACCAGAAAGcCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAtTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAAcCCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGaACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTACTAGAGATAGAGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCTAGACCGCGAGGTCATGCAAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAA

上述形态特征和16srDNA序列同源性分析结果表明该菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。该菌株已于2022年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.24951，其分类命名为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)AT5。

实施例2

本实施例提供粪肠球菌AT5的体外抑菌实验

将指示菌哈维氏弧菌B0003和粪肠球菌AT5分别在营养肉汤培养基中33℃、180r/min条件下培养24h。将培养好的B0003用生理盐水稀释1000倍，取100uL涂布于营养琼脂平板上，用内径为5mm的琼脂打孔器在营养琼脂平板上均匀打3个孔，每个孔加入B0E9菌液150uL。将平板置于33℃恒温培养箱中正置培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，判断试验菌对指示菌的抑制效果。

结果如图3所示，打孔周围出现明显抑菌圈，抑菌圈直径为8.71±0.41mm。表明粪肠球菌AT5对哈维氏弧菌B0003具有良好的抑菌效果。

实施例3

本实施例提供粪肠球菌AT5菌剂的制备

S1.用接种环挑取适量斜面保存的粪肠球菌AT5菌体接种到6-10个装有50mL培养基1的250mL三角瓶中进行培养。其中，培养基1的组成为：蛋白胨8-12g，牛肉膏4-6g，葡萄糖16-25g，氯化钠4-6g，蒸馏水1000mL；培养条件为：培养温度28-30℃；初始pH值6.9-7.2；摇床转速200-260rpm；培养时间为20-24h；得到300-500mL的一级种子培养液。

S2.按照2-4％的比例将一级种子培养液接种到20-30个装有400mL培养基2的2000mL三角瓶中。其中，培养基2的组成为：蛋白胨8-12g，牛肉膏4-6g，葡萄糖16-25g，氯化钠4-6g，蒸馏水1000mL；培养条件为：培养温度28-30℃；初始pH值6.9-7.2；摇床转速200-260rpm；培养时间为18-24h；得到8-12L的二级种子培养液。

S3.液体发酵具体为：按照3％-5％的比例将二级种子培养液接种到培养基3中，其中培养基3的组分为玉米粉10-16g，豆粕粉8-12g，玉米浆4-8g，硫酸铵5-8g，七水硫酸镁0.8-1.2g，三水合磷酸氢二钾2-4g，硫酸锰0.04-0.06g，自来水1000mL；在500L发酵罐进行液体发酵，发酵条件为：发酵温度28-30℃；初始pH值6.9-7.2；搅拌转速200-260rpm；装液系数0.5；发酵时间为20-28h。

S4.制备益生菌粉。按照S3发酵后，离心收集菌体(转速为4000-5000rpm；离心时间为10min-20min)，在菌体中加入玉米淀粉作为载体(质量比为1:2-1:4)，经振动流化床干燥(干燥条件为：进风温度60℃-100℃，出风温度40℃-60℃)、粉碎、过80目筛、真空包装，获得可常温保存的益生菌粉，每克益生菌粉中粪肠球菌AT5活菌含量1.0×10¹⁰CFU；

实施例4

本实施例提供粪肠球菌AT5菌剂的应用

将粪肠球菌AT5制备的益生菌粉按照0.1％-1％的比例添加到黄姑鱼基础饲料中，粪肠球菌AT5在每克基础饲料中含量达到1.0×10⁷-1.0×10⁸CFU。优选每克基础饲料中的AT5含量达到1.0×10⁸CFU，可降低哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼的累积死亡率(表2)，且能显著提高黄姑鱼血清溶菌酶活性(表3)和显著上调皮肤相关免疫基因的表达(表4)。

表1基础饲料组成

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实验结果(应用效果)：

(1)粪肠球菌对哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼5d内累积死亡率的影响

42d的养殖试验结束后，利用黄姑鱼红头病病原——哈维氏弧菌B0003进行攻毒实验，记录攻毒后5天的红头症状发生和死亡情况。从表2中可以看出，与对照组相比，饲料中添加1％益生菌粉组(每克基础饲料中的AT5含量为1.0×10⁸CFU)黄姑鱼的红头症状发生率降低了68.93％，累积死亡率降低了73.32％(P<0.05)，这提示饲料中添加1×10⁸CFU/g粪肠球菌AT5可显著提高黄姑鱼抗红头病能力。

表2哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼累积死亡率

	红头症状发生率(％)	累积死亡率(％)
			对照组	72.63±12.56<sup>a</sup>	53.57±15.15<sup>a</sup>
粪肠球菌AT5组	22.56±6.78<sup>a</sup>	14.29±14.29<sup>b</sup>

(2)粪肠球菌对哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼免疫功能的影响

从表3中可以看出，与对照组相比，饲料中添加0.1％益生菌粉组(每克基础饲料中的AT5含量为1.0×10⁸CFU)黄姑鱼血清中溶菌酶活性显著上升(P<0.05)，IL-1β含量明显下降，提示饲料中添加1×10⁸CFU/g粪肠球菌AT5可显著提高哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼的血清免疫功能，减少炎性因子产生。

表3哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼血清免疫指标

	溶菌酶(U/mL)	IL-1β(pg/mL)
			对照组	259.26±37.04<sup>b</sup>	32.18±7.11
粪肠球菌AT5组	493.83±85.53<sup>a</sup>	25.12±2.15

由表4可知，与对照组相比，饲料中添加1％益生菌粉组(每克基础饲料中的AT5含量为1.0×10⁸CFU)黄姑鱼头部皮肤抗菌肽基因(NK-lysin)、溶菌酶基因(Lysozyme)和白细胞介素10(IL-10)表达量均显著提高(P<0.05)，提示饲料中添加1×10⁸CFU/g粪肠球菌AT5可显著提高哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼皮肤免疫基因的表达，提高其免疫性能。

表4哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼皮肤免疫基因相对表达量

	NK-lysin	Lysozyme	IL-10
				对照组	1.00±0.16<sup>b</sup>	1.00±0.24<sup>b</sup>	1.00±0.18<sup>b</sup>
粪肠球菌AT5组	2.06±0.06<sup>a</sup>	2.82±0.28<sup>b</sup>	4.68±0.43<sup>a</sup>

哈维氏弧菌B0003攻毒后，对黄姑鱼肝脏组织HE染色后，观察肝脏组织形态，由图4可知，与对照组相比，粪肠球菌AT5组肝细胞排列更为紧密，且细胞空泡化明显减少，提示粪肠球菌AT5明显改善了哈维氏弧菌攻毒后黄姑鱼肝脏损伤。

综上，本发明从黄姑鱼肠道分离筛选到对黄姑鱼红头病病原——哈维氏弧菌B0003具有较强拮抗作用的功能微生物——粪肠球菌AT5。饲料中添加粪肠球菌AT5能降低哈维氏弧菌B0003攻毒后5d内的累积死亡率，显著提高血清中溶菌酶的活性，降低促炎因子，且能够显著上调皮肤相关免疫基因的表达，能有效改善哈维氏弧菌B0003攻毒后黄姑鱼肝脏损伤。因此，粪肠球菌AT5能有效增强黄姑鱼抗红头病能力，为黄姑鱼红头病的防治提供一种新的解决方案。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (5)

1.一株粪肠球菌，其特征在于，所述粪肠球菌为粪肠球菌AT5(EnterococcusfaecalisAT5)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24951。

2.如权利要求1所述的粪肠球菌的培养物。

3.如权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的粪肠球菌的培养物在制备菌剂或饲料添加剂中的应用。

4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的粪肠球菌的培养物。

5.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包括权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的粪肠球菌的培养物。

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