CN115678813B - 一株对叶螨具有高毒杀活性的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物农药领域，公开了一株对叶螨具有高毒杀活性的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株NBIF‑016已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 20221469。实验室生测和田间试验数据表明，贝莱斯芽孢杆菌NBIF‑016对二斑叶螨、柑橘全爪螨、棉红蜘蛛等主要农业害螨均具有高毒杀活性，对柑橘树上的叶螨田间防效为67.1%~95.8%，对棉花上的叶螨田间防效为71.1%~87.5%，且该菌株的杀螨活性具有高温、紫外耐受性，施用后可以在叶面有效定植，在农业生产中具有广阔的应用前景。

Description

一株对叶螨具有高毒杀活性的贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物农药领域，涉及一株对叶螨具有高毒杀活性的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其应用。

背景技术

叶螨，又称蜘蛛螨，其危害几乎遍及世界范围内所有的农作物和地区，能通过直接取食或传播植物病原菌和病毒可造成每公顷4500美元的经济损失。我国是世界上最大的农业生产国之一，每年因螨害造成的农业经济损失高达100多亿元，呈逐年加剧态势。因此防治农业螨害具有重要意义。

目前防治农业害螨主要采用化学杀螨剂，据中国农药信息网记录(http://www.chinapesticide.org.cn/)，目前登记在册的杀螨剂有1121种，占比排名前三的为炔螨特(占比13.7％)，哒螨灵(10.7％)和三唑锡(9.8％)。生物来源的阿维菌素紧排其后，占比5.4％。然而，叶螨体型较小、繁殖周期短，对化学杀螨剂具有快速产生抗药性的能力。随着我国日益严格的农药管理措施，农业害虫管理也开始关注使用非化学或生物解决方案。微生物杀螨剂具有靶标专一、对环境友好、不易产生抗性等独特优势，具有很大的开发应用前景。然而，目前我国农药登记的微生物杀螨剂为0项，亟待发掘绿色高效的应用产品。

芽孢杆菌制剂具有成熟的商业化历史，广泛用于杀虫剂、杀菌剂及植物促生领域。在杀虫剂领域，芽孢杆菌生物农药的主要防治对象为鳞翅目、双翅目和鞘翅目害虫，以及线虫。由于刺吸式害虫特殊的摄食模式，传统芽孢杆菌细胞及杀虫因子往往难以被摄食并毒杀螨类。然而一些苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)同样被报道发现具有杀根结线虫活性；也有部分解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)被发现具有较好的杀螨活性。上述研究说明芽孢杆菌还是具有作为刺吸式害虫生物防治微生物农药的应用潜力。但是，芽孢杆菌制剂的应用也存在一定的局限性，例如易受环境高温、光照强烈等因素的影响，无法稳定地定植于植物施药部位，从而导致防效不稳定。

针对叶螨危害，申请人前期也筛选到一株具有良好防效的死亡谷芽孢杆菌NBIF-001，但在后期施用过程中发现其在植物施药部位的定植能力较弱，也产生了芽孢杆菌制剂易出现的局限性问题，例如易受高温影响导致产品货架期较短，施药过程中易受环境天气的影响导致防效不稳定。

针对上述问题，本发明从爆发过叶螨虫害后自然减退的柑橘叶片上分离筛选了一株贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016，该菌株对二斑叶螨、柑橘全爪螨、棉红蜘蛛等主要农业害螨具有高毒杀活性，对柑橘全爪螨的田间防效为67.1％～95.8％，对棉红蜘蛛的田间防效为71.1％～87.5％，且该菌株的杀螨活性具有高温、紫外耐受性，施用后可以在叶面有效定植，一定程度上克服了芽孢杆菌制剂的局限性问题，在农业生产中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，本发明提供了一株对叶螨具有高毒杀活性的贝莱斯芽孢杆菌，所述的贝莱斯芽孢杆菌命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NBIF-016，保藏编号为：CCTCC NO:M 20221469。

本发明的另一个目的是上述贝莱斯芽孢杆菌在制备杀螨剂中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人从湖北省武汉市东西湖区的一个爆发过红蜘蛛病害后自然减退的柑橘园中采摘柑橘叶片样品，采用高温筛选法进行芽孢杆菌菌株的分离，并通过二斑叶螨生测从分离到的菌株中筛选到一株对叶螨具有高毒杀活性的菌株，将其命名为NBIF-016。

NBIF-016菌株在Lauria-Bertani琼脂平板上生长的单菌落为乳白色圆型，边缘有褶状突起(图1)，镜检观察细胞形态呈杆状。通过基因组平均核苷酸一致性(ANI)比对分析发现该菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的模式菌株(CR-502)的ANI相似性为98.29％。结合ANI分析和生理生化鉴定明确NBIF-016为贝莱斯芽孢杆菌，该菌株已于2022年9月21日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NBIF-016；保藏编号为：CCTCC NO:M 20221469；地点：中国，武汉，武汉大学。

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016在防治植物螨害中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016包括含有贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的的微生物菌剂、贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵上清液或是贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵液，所述的的微生物菌剂的剂型包括但不限于粉剂、悬浮剂、微囊剂型。

以上所述的应用过程，是将含有贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的的微生物菌剂、贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵上清液或是贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵液触杀螨虫。

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016在制备植物杀螨剂中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016包括含有贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的的微生物菌剂、贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵上清液或是贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵液，所述的微生物菌剂的剂型包括但不限于粉剂、悬浮剂、微囊剂型。

以上所述的应用中，优选的，所述的螨为叶螨，包括二斑叶螨(Tetranychusurticae)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)或棉红蜘蛛(Tetranychus cinnabarinus)中的一种或几种。

以上所述的应用中，优选的，所述的植物为感染了叶螨的植株。

以上所述的应用中，优选的，所述的植物为柑橘。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.目前在国内暂无针对植物叶螨的正式登记的微生物杀螨剂，本发明从柑橘叶片中分离筛选获得了一株对叶螨具有高毒杀活力的菌株NBIF-016。通过生理生化及基因组平均核苷酸一致性分析，菌株NBIF-016鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。通过我国农业行业标准(NY/T1154.12-2008)规定的叶螨玻片浸渍法进行生测发现菌株NBIF-016发酵液对二斑叶螨、柑橘全爪螨、棉红蜘蛛均具有较高的毒杀活性，在田间防效试验中，菌株NBIF-016发酵液对柑橘上的叶螨田间防效为67.1％～95.8％，对棉花上的叶螨田间防效为71.1％～87.5％％，表明该菌株是一株对目前主要植物害螨均有高毒杀活性的菌株，具有很大的应用潜力。此外，通过与发明人保藏的其他几株贝莱斯芽孢杆菌进行生测比较发现，菌株NBIF-016的杀螨活性最高，表明该菌株对叶螨的高毒力具有特殊性。

2.由于环境温度和光照等因素，导致了微生物农药的田间应用会出现防效不稳定的情况。本发明通过高温和紫外处理菌株NBIF-016发酵液发现其杀螨活性并没有发生变化，并且检测了菌株NBIF-016在柑橘叶面的定植能力，发现叶面喷施30天后，菌株NBIF-016在柑橘叶面上的定植密度可以保持在10⁵cfu/g的水平，表明该菌株可以在柑橘叶面定植。上述结果表明相比于其他生防菌，菌株NBIF-016的防效可能更稳定，可以为植物叶螨的防治提供提供绿色高效的防治手段，特别适用于有机农产品的生产，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为菌株NBIF-016在Lauria-Bertani琼脂平板上的菌落形态示意图。

图2为菌株NBIF-016毒杀二斑叶螨效果示意图。

其中图2中A为本发明的菌株NBIF-016发酵液处理二斑叶螨24h后螨虫出现虫体皱缩的表型，图2中B为对照发酵培养基处理二斑叶螨24h后螨虫仍存活的表型。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的分离筛选及鉴定

1)芽孢杆菌菌株的分离：申请人从湖北省武汉市东西湖区的一个爆发过红蜘蛛病害后自然减退的柑橘园中采摘柑橘叶片样品，采用高温筛选法进行芽孢杆菌的分离。具体过程为：称取叶片样品0.1g，放入装有10mL醋酸钠培养基的三角瓶中，振荡混匀后在70℃处理30min，再取1mL悬液进行梯度稀释，各稀释梯度取2mL涂布Lauria-Bertani琼脂(配方：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，2％琼脂粉)平板，30℃培养过夜。之后分别挑取单菌落，转接到5mL Lauria-Bertani液体培养基中，30℃，220rpm培养10h后，加入等体积的50％甘油后保存于-80℃。共分离到13种芽孢杆菌。

2)对叶螨具有高毒杀活性的菌株筛选：将分离到的芽孢杆菌分别接种到5mLLauria-Bertani液体培养基中，30℃，220rpm过夜活化后再分别转接到发酵培养基(3％豆粕，1.5％玉米浆，1.5％玉米淀粉，pH 7.0-7.5)中，30℃，220rpm培养24h，通过稀释计数法计算各发酵液中的芽孢浓度，并利用新鲜的发酵培养基调整各发酵液中的芽孢浓度到10⁶CFU/mL。之后通过我国农业行业标准(NY/T 1154.12-2008)中记载的叶螨玻片浸渍法检测了这些菌株发酵液对二斑叶螨(Tetranychus urticae)的毒杀活性。

具体生测方法为：①将双面胶剪成2cm²左右的大小，贴于载玻片上，再选取健康雌成螨，将其背部粘于双面胶上，每片载玻片上粘30头；②将玻片浸于发酵液中轻轻振荡5s后取出，用吸水纸吸去多余发酵液，将载玻片置于垫有湿海绵的白磁盘中，施用透光性好的塑料薄膜覆盖，每个处理4次重复，并以新鲜发酵培养基处理的螨虫作为空白对照；③将盛有处理试虫的容器置于25℃、光周期为L:D＝(16h:8h)条件下静置24h，之后统计各处理组中二斑叶螨的死亡率，若对照组中的死亡率<5％，无需校正死亡率；若对照死亡率在5％～20％之间，则按公式校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)*100对处理组死亡率进行校正；若对照死亡率>20％，试验需重做。通过二斑叶螨生测，将分离到的芽孢杆菌中活性最高的一株菌株命名为NBIF-016，发酵液芽孢浓度为10⁶CFU/mL时对二斑叶螨的校正死亡率为99.2％(±1.4％)。

3)菌株NBIF-016的鉴定：菌株NBIF-016在Lauria-Bertani琼脂平板上生长的单菌落形态特征为乳白色圆型，边缘有褶状突起(图1)，镜检观察细胞形态呈杆状，革兰氏染色为阳性。通过BIOLOG检测了其生理生化特性(表1、表2)。通过菌株NBIF-016的形态特征和生理生化特性将该菌株初步鉴定为芽孢杆菌。随后利用Qiagen基因组提取试剂盒提取高质量的菌株NBIF-016基因组DNA，利用二代高通量测序技术结合Oxford Nanopore三代测序技术对菌株NBIF-016的基因组进行了测序，在细菌鉴定平台EzBioCloud(https:// www.ezbiocloud.net/)上通过基因组平均核苷酸一致性比对工具ANI Calculator对菌株NBIF-016的基因组进行了分析比对，结果显示菌株NBIF-016与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)模式菌株CR-502的ANI相似度为98.29％，在分类学中，当两个菌株的ANI相似度大于95％时认为这两个菌株为同一种(Species)，因此将菌株NBIF-016鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

表1：菌株NBIF-016生理生化特性-酶活、碳源氧化

+：阳性反应；-：阴性反应；

表2：菌株NBIF-016生理生化特性–利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；

上述菌株已于2022年9月21日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NBIF-016；保藏编号为：CCTCC NO:M 20221469；地点：中国，武汉，武汉大学。

实施例2：

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016杀叶螨活性的测定

按照实施例1中的发酵培养方法制备贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液，并通过加入新鲜发酵液配制梯度芽孢浓度的发酵液，按上述叶螨玻片浸渍法检测了这些发酵液对二斑叶螨(Tetranychus urticae)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)和棉红蜘蛛(Tetranychus cinnabarinus)的毒杀活性，结果如表3-表5所示，贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液对二斑叶螨的LC50值为8.4μL/mL，对柑橘全爪螨的LC50值为10.9μL/mL，对棉红蜘蛛的LC50值为18.1μL/mL。根据不同浓度所对应的叶螨死亡率，利用SPSS软件中的probit线性模型计算LC50。

室内生测数据表明，贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016对数种主要农业害螨均具有高毒杀活性，贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016处理后的叶螨呈现出一种皱缩的状态(图2)，暗示着其作用机制可能是破坏叶螨体壁，造成虫体内容物外流引起叶螨死亡。

表3：贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液对二斑叶螨的毒杀活性

表4：贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液对柑橘全爪螨的毒杀活性

表5：贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液对棉红蜘蛛的毒杀活性

实施例3：

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016同其他贝莱斯芽孢杆菌的杀螨活性比较

发明人所在单位作为国家植保微生物种质资源库，前期已收集了部分初步测定具有杀螨活性的贝莱斯芽孢杆菌资源(完全不具备杀螨活性的贝莱斯芽胞杆菌不在本次实验对照要求内)，本发明将菌株NBIF-016与另外7种贝莱斯芽孢杆菌分别活化转接到发酵培养基中，30℃，220rpm培养24h后调整各发酵液中的芽孢浓度到10⁶CFU/mL，通过叶螨玻片浸渍法比较了各贝莱斯芽孢杆菌对二斑叶螨的生测活性，结果如表6所示，贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016处理组中的二斑叶螨死亡率显著高于其他贝莱斯芽孢杆菌处理组，表明相对于其他贝莱斯芽孢杆菌，菌株NBIF-016的杀螨活性更高。

死亡率的计算方式为实施例1中已描述的叶螨玻片浸渍法中所述的死亡率计算方法，即：统计各处理组中二斑叶螨的死亡率，若对照组中的死亡率<5％，无需校正死亡率；若对照死亡率在5％～20％之间，则按公式校正死亡率＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)*100对处理组死亡率进行校正；若对照死亡率>20％，试验需重做。

表6：不同贝莱斯芽孢杆菌发酵液对二斑叶螨的毒杀活性

同列数据后不同小写字母表示在5％水平下差异显著

实施例4：

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016在防治植物螨害中的应用

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016对叶螨的田间防效试验地点分别位于湖北省黄石市阳新县的柑橘园和新疆维吾尔自治区阿拉尔市的棉花田，这两个地方均爆发了严重的叶螨病害，且叶螨已对部分化学杀螨剂具有抗药性。遵循国家标准——农药田间药效试验准则(一)杀螨剂防治桔全爪螨所列细则(GB/T 17980.11-2000)中所述的方法，按照实施例1中的发酵培养方法制备NBIF-016发酵液，100倍稀释后(芽孢浓度10⁸CFU/mL)进行叶螨田间防效检测。阳性对照为2000倍稀释的30％乙唑螨腈悬浮剂(用量为说明书推荐用量)，阴性对照为清水。选择植物长势相近的区域设置小区，每个处理组设置3个小区，每个小区中选取3-5株植株，每株随机挑选5-10片叶，作好标记，在施药前统计各处理小区中标记叶片上的叶螨虫口基数。用电动喷雾器对每个小区的全部植物进行全株喷施NBIF-016发酵液，注意所有叶子的正反面均喷上药。喷施后1、3、7、14d分别统计标记叶片上的叶螨虫口数。并计算防治效果，结果如表7-表8所示。结果显示用药14天内，NBIF-016发酵液对柑橘全爪螨的田间防效为67.1％～95.8％，对棉红蜘蛛的田间防效为71.1％～87.5％，与化学杀螨剂的防效相当。

校正防效的计算公式为防效(％)＝[1-(处理组处理后叶面虫口数×对照组处理前叶面虫口数)/(处理组处理前叶面虫口数×对照组处理后叶面虫口数)]×100

表7：贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液对柑橘全爪螨的田间防效

同列数据后不同小写字母表示在5％水平下差异显著

表8：贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液对棉红蜘蛛的田间防效

同列数据后不同小写字母表示在5％水平下差异显著

实施例5：

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液杀螨活性对高温和紫外的耐受性检测

按照实施例1中的发酵培养方法制备贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液，并稀释发酵液中的芽孢浓度到10⁶CFU/mL，通过梯度温度分别处理发酵液30min后利用叶螨玻片浸渍法检测高温处理对贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液杀螨活性的影响，以表6中杀螨活性较好的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-192菌株作为对照(表9)；此外，利用30W的紫外线灯管(在1m处的辐射强度≥90μW/cm²)近距离处理贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液，按梯度处理时间进行取样，之后利用叶螨玻片浸渍法检测检测紫外处理对贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液杀螨活性的影响，同样以表6中杀螨活性较好的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-192菌株作为对照(表10)。结果显示，经过高温和紫外处理的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液的杀螨活性与处理前无显著变化，而同样是贝莱斯芽孢杆菌的NBIF-192发酵液的杀螨活性则随着温度升高和紫外处理时间延长而显著下降，表明贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016发酵液的杀螨活性具有高温和紫外耐受性。

表9：不同温度处理的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016和NBIF-192发酵液对二斑叶螨的毒杀活性

同列数据后不同小写字母表示在5％水平下差异显著

表10：不同紫外处理时间的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016和NBIF-192发酵液对二斑叶螨的毒杀活性

同列数据后不同小写字母表示在5％水平下差异显著

实施例6：

贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016在柑橘叶面的定植能力检测

将贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016接种到含有不同浓度利福平的Lauria-Bertani培养基中进行抗性筛选，获得具有利福平抗性的人工诱变菌株，经过二斑叶螨生测和生理生化检测显示抗性菌株的杀螨活性与生理生化特性并没有发生显著变化，该菌株可在含50μg/mL利福平的平板上正常生长。按照实施例1中的发酵培养方法制备贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016利福平抗性突变株的发酵液，调整发酵液中的芽孢浓度至10⁸CFU/mL，对柑橘叶面正反面进行均匀喷施。在30天内将喷施的叶片分批采下，通过梯度稀释涂平板法用含50μg/mL利福平的平板筛选定植于叶面上的抗性突变株并计数。结果显示，在30天内贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016在柑橘叶面上的丰度维持在10⁶-10⁵CFU/g之间，第30天NBIF-016在叶面上的定植量为8.23×10⁵CFU/g，表明贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016可以在柑橘叶面上稳定定植。

Claims (8)

1. 一株分离的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NBIF-016，所述贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的保藏编号为：CCTCC NO：M 20221469。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016、含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的微生物菌剂或含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵液在防治植物螨害中的应用，所述的螨为叶螨。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016、含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的微生物菌剂或含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵液在制备植物杀螨剂中的应用，所述的螨为叶螨。

4. 根据权利要求2或3所述的应用，所述的叶螨为二斑叶螨(Tetranychus urticae)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)或棉红蜘蛛(Tetranychus cinnabarinus)中的一种或几种。

5.根据权利要求2或3所述的应用，所述的微生物菌剂的剂型为粉剂、悬浮剂或微囊剂型。

6.根据权利要求2或3所述的应用，所述的植物为感染了叶螨的植物。

7.根据权利要求6所述的应用，所述的植物为柑橘。

8.根据权利要求2或3所述的应用，其应用过程是将含有贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的微生物菌剂、或含有贝莱斯芽孢杆菌NBIF-016的发酵液触杀螨虫。

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