CN112574901A

CN112574901A - 苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8及其应用

Info

Publication number: CN112574901A
Application number: CN201910939479.8A
Authority: CN
Inventors: 胡虓; 张晓明; 王晓辉; 霍瑞; 孙刚忠; 周波; 刘华梅; 李青; 王猛; 万俊
Original assignee: Wuhan Kernel Bio Tech Co ltd
Current assignee: Wuhan Kernel Bio Tech Co ltd
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2021-03-30

Abstract

本发明公开了一株苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)Btk‑KN‑R8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017699。该菌株含有杀虫基因cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab以及vip3Aa，杀虫晶体蛋白的表达量明显高于目前工业菌株，对农作物主要虫害尤其是草地贪夜蛾具有较强的防效，该菌对草地贪夜蛾的LC₅₀为0.3368μg/g，田间防效达73.83‑87.70％。

Description

苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8及其应用

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一株苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株。

背景技术

草地贪夜蛾原分布于中美洲和南美洲等西半球地区，属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是玉米和其它主要经济作物上重要的迁飞性害虫之一。草地贪夜蛾具有寄主广泛、暴食为害性、抗药性产生快，生态多型性、适生广泛性、迁飞扩散性等特点，对玉米产量影响较大，玉米苗期受害一般可导致减产10～25％，严重地块可造成毁种绝收。自从2019年发现该虫进入中国以来，截至目前草地贪夜蛾在我国24个省份的1431万亩耕地发生，防治面积达2065万亩，对华南、黄淮海及北方玉米主产区的粮食生产安全构成严重威胁，今后在我国有可能常态化发生。

化学农药是控制草地贪夜蛾为害最主要的防治策略，但容易产生农药残留、环境污染以及病虫害抗药性的发生。相比之下，苏云金杆芽孢菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)作为世界上应用最为广泛的农用微生物，具有专一性强、低毒、环保、不易产生抗药性、对环境无污染等特点，日益受到人们的青睐。

Bt是一种从土壤或死亡昆虫体内分离出来的革兰氏阳性昆虫病原细菌，此类菌在芽孢形成时期能产生一种或多种对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目、等翅目等多种害虫和植物病原线虫具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，简称ICPs)。这种杀虫晶体蛋白对目标害虫高效专一、对人畜无害、不污染环境，因而在害虫的生物防治中得到了广泛的应用。

由于不同Bt产品的菌株差异较大，所产生的杀虫蛋白种类、数量、表达量会有很大差异，其表现出不同的杀虫特性。目前Bt防治草地贪夜蛾存在用量大，防效不稳定，持效期短等问题。由于草地贪夜蛾入侵我国时间短，目前尚未对草地贪夜蛾高毒力的Bt菌株开展系统性研究，因此迫切需要筛选一株高毒力Bt菌株，以提供高效稳定的产品。

目前已报导的利用苏云金芽孢杆菌防治草地贪夜蛾的研究相对较少，且防效较低，例如，赵胜园等筛选到的苏云金芽孢杆菌SC对2龄幼虫室内的校正死亡率为60～71.62％，田间防效仅为60.78～64.01％。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一株苏云金芽孢杆菌，分类为库斯塔克亚种，命名为Btk-KN-R8，该菌具有很高的杀虫晶体蛋白表达量，对草地贪夜蛾具有很高的杀虫活性。

实现本发明的技术方案如下：

申请人从山东大棚采集的小菜蛾病死虫中分离筛选，经形态学、生理生化、16s-rDNA序列鉴定，获得一株苏云金芽孢杆菌，将其分类命名为苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)Btk-KN-R8，该菌株已于2017年11月17日保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017699。

Btk-KN-R8菌中含有的杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab以及vip3Aa，其发酵液中杀虫晶体蛋白含量可达0.75％，明显高于现有菌株；对草地贪夜蛾幼虫的室内生测试验结果表明，Btk-KN-R8对草地贪夜蛾幼虫有很高的杀虫活性，其LC₅₀仅为0.3368μg/g，晶体蛋白浓度与杀虫效果存在量效关系。田间药效试验结果表明，当杀虫晶体蛋白浓度为50-200μg/ml时，Btk-KN-R8菌剂对草地贪夜蛾的田间防效明显优于现有商品化制剂，用药7天的防效与化学药剂相当且起效速度更快。

因此，本发明所筛选的Btk-KN-R8是一种高毒力菌株，可以作为生物菌剂的活性成分用于作物虫害尤其是草地贪夜蛾的防治。

当菌剂中的晶体蛋白浓度为100μg/ml时，田间防效可达73.83-87.7％。

所述Btk-KN-R8菌株以及含有Btk-KN-R8的菌剂不仅可用于草地贪夜蛾的防治，同时还对小菜蛾、玉米粘虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫、二化螟等作物主要害虫均具有活性。

本发明还进一步提供了一种发酵苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8的方法：按照发酵培养基体积的0.5-5％接入苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8的活化种子液，溶氧控制发酵，在接种至12h之间通气量为0.3-1v/v，罐压0.03-0.08Mpa，搅拌速度100-300rpm，12h后提高搅拌速度至400-500rpm，当芽孢形成率达到95％以上时结束发酵，即得发酵液。

优选地，所述发酵培养基为：玉米淀粉25g/L，黄豆饼粉30g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙2g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH 7-7.2。

进一步优选地，所述通气量为0.6v/v，罐压0.05Mpa，在接种至12h之间搅拌速度300rpm，在12h后提高搅拌速度500rpm。

采用以上发酵条件有利于提高芽孢产量以及晶体蛋白的含量。

本发明提供的是一株生防潜力极强的苏云金芽孢杆菌，具有很好的实用性，可替代部分化学农药的使用，减少了环境污染，具有良好的经济和生态效益以及很好的应用推广前景。

附图说明

图1为Btk-KN-R8的16s rRNA基因系统发育树。

图2为Btk-KN-R8的杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE检测结果。图中，泳道M为蛋白质marker，1为Btk-KN-R8的杀虫晶体蛋白。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：Btk-KN-R8的分离及鉴定

申请人从全国10个省市各地当地分离出50株苏云金芽孢杆菌(Bt)，通过菌株对草地贪夜蛾幼虫的室内毒力初步筛选，获得一株高毒力的Btk-KN-R8菌株，以下试验仅涉及筛选出的高毒菌株KN-R8。

1、菌株分离：将从山东大棚采集的小菜蛾病死虫浸泡于75％的酒精中表面消毒，5min后转移到灭菌的生理盐水中，洗涤2～3次，于灭菌的培养皿中将虫体研磨成浆，放入装有20ml醋酸钠LB液体培养基(按1L培养基计算：蛋白胨10g；酵母粉5g；氯化钠10g；醋酸钠34.02g，补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(210r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于75℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养；36h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片，碱性复红染色后在普通光学显微镜下镜检观察，发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株。

2、菌株形态观察：将分离到的菌株接种在LB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1L，pH7.2)上在30℃条件下培养，不同时间取样镜检观察菌落形态特征、晶体特征：该菌营养体呈杆状，大小为(1.0-1.8)μm×(3.0-5.5)μm具周生鞭毛或无鞭毛，两端钝圆，通常单个或两个以上呈链状存在，芽孢为椭圆形，在芽孢成熟后产生菱形伴胞晶体。在LB培养基上30℃培养，镜检观察，菌落呈乳白色，蜡状，近似圆形，边缘不整齐。最适生长温度为28℃，pH6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。

3、生理生化鉴定：

表1 菌株Btk-KN-R8的生理生化特性–酶活、碳源氧化

+：阳性反应；-：阴性反应

表2 菌株Btk-KN-R8的生理生化特性–利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应

4、16S rDNA扩增及其分子鉴定：

采用基因组DNA纯化试剂盒(Sigma-Aldrich公司)，提取菌株的基因组DNA。根据真细菌16S rDNA保守区通用引物27F和1492R并进行PCR扩增，通用引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR反应体系为：10×buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl，10μmol/L通用引物各0.4μl，Taq酶1U，拮抗细菌总DNA 1μl，补加灭菌去离子H₂O至20μl。PCR扩增反应程序为：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min，第3步55℃复性1min，第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72℃延伸5min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，进行琼脂糖凝胶检测后，将PCR产物送天一辉远生物科技有限公司检测测序。通过两个测序反应获得PCR扩增产物的全长1453bp，测序结果输入NCBI，用Blast程序交送GenBank数据库进行比较分析，表明该序列与GenBank数据库中的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种的16S rDNA同源性较高，相似性达到100％。

最终鉴定该菌株为苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki)，申请人将其命名为Btk-KN-R8，该菌株已于2017年11月17日保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017699。

图1为基于16SrRNA基因序列比对结果以Marinococcus halophilus DSM 20408(X90835.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。

实施例2：高通量测序技术对Btk-KN-R8杀虫基因分析

分析方法：提取菌株的基因组DNA，质检合格后由北京赛默百合生物科技有限公司利用TruSeq DNA无PCR文库制备试剂盒构建测序文库，并用IlluminaHiSeq 2500测序平台测序。对测序获得的原始reads，进一步用Trimmomatic(版本0.36)软件去除原始数据中含有残留的接头以及低质量碱基的reads，获得高质量的数据。对获得高质量的数据，利用基因组拼接软件IDBA_UD进行组装，获得每个菌株基因组的Contig。利用Prodigal软件对各菌株的Contig进行Coding sequence(CDS)预测，获得的CDS用于菌株杀虫基因分析。菌株杀虫基因分析采用Blast软件，在中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室自建的Bt杀虫基因数据库中进行比对。

通过IlluminaHiSeq 2500测序与质量控制，菌株Btk-KN-R8测序结果中高质量的数据超过了98％，可以用于进一步分析。经过低质量reads的去除，测序菌株Btk-KN-R8获得了超过1Gb的高质量数据，测序数据的统计见表3。进一步基因组拼接结果显示，Bt菌株Btk-KN-R8组装获得Contig数量在432至632之间，基因组大小接近6.5Mb之间。进一步分析菌株的编码序列，Btk-KN-R8中含有的杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab以及vip3Aa。

表3.菌株Btk-KN-R8测序数据以及组装与编码蛋白预测结果统计

实施例3：Btk-KN-R8发酵液制备以及杀虫晶体蛋白的检测

1、发酵液制备：

(1)菌种制备：首先，将保存的Btk-KN-R8菌株接种至LB培养基斜面(按1L培养基计算：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)，30℃培养3-4天(形成有力的芽孢)；

(2)种子液制备：用接种环刮取活化的菌株接种到经过湿热灭菌的200ml LB液体培养基(按1L培养基计算：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g；补充蒸馏水至1L；调pH至7.0)中，在30℃、摇床转速为220rpm的条件下培养10h，得种子液；

(3)发酵液制备：在15L发酵罐中装有10L经过湿热灭菌的活菌发酵培养基(按1L培养基计算：玉米淀粉25g，黄豆饼粉30g，蛋白胨10g，玉米浆5g，硫酸镁0.3g，氯化钙2.0g，磷酸二氢钾1g；补足蒸馏水至1L；调pH至7.0-7.2)和占培养基体积的0.1％消泡剂。再按照培养基体积比为1％的比例将制备的种子液接入，溶氧控制发酵，在接种至12h之间通气量为0.6(v/v，指每分钟通入空气的体积与发酵培养基体积之比)，罐压0.05Mpa，搅拌速度为300rpm，12h后提高搅拌速度为500rpm。在接种后36h，芽孢形成率达到95％以上时结束发酵，得到Btk-KN-R8发酵液，将发酵液酸化至pH5.0备用，并用于以下实施例。

将工业化苏云金芽孢杆菌KN-11和HD-1分别按照以上(1)、(2)、(3)步，得到KN-11和HD-1发酵液。

2、Btk-KN-R8发酵液杀虫晶体蛋白的检测：

将Btk-KN-R8发酵液参照中华人民共和国国家标准GB/T 19567.2-2004进行样品处理，SDS-PAGE电泳，电泳后的聚丙烯酰胺凝胶经过考马斯亮蓝染色后再脱色处理。用可见光对凝胶进行扫描，运用Image Masterl D软件处理图像，根据晶体蛋白吸收峰的积分值对蛋白质进行定量分析，参照标准品计算被测样品的晶体蛋白含量。

结果如图2所示，可以看出Btk-KN-R8主要产生约130kDa、65kDa左右的蛋白。表4可知，Btk-KN-R8发酵液中的杀虫晶体蛋白含量达到0.75％，杀虫蛋白的表达量明显高于目前工业菌株KN11和HD-1。

表4 Btk-KN-R8发酵液晶体含量

菌株	晶体蛋白含量(％)
		Btk-KN-R8发酵液	0.75
KN-11发酵液	0.50
		HD-1发酵液	0.35

实施例4：Btk-KN-R8对草地贪夜蛾幼虫室内生测试验

试验方法：在预备试验的基础上，测定Btk-KN-R8发酵液中的晶体蛋白含量，用0.1％Triton X-100溶液稀释，按等比级数稀释法配制成0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/g质量浓度的待测样品溶液。将配制好的人工饲料置55℃水浴锅中保温备用，取9g人工饲料置于灭菌培养皿中，加入1mL待测样品溶液，充分搅拌均匀，静置，待冷却凝固后，将全部饲料分装于已消毒的24孔细胞培养板中；用毛笔拉线将初孵幼虫接于24孔板中，每孔一头草地贪夜蛾2龄幼虫，接好后使用内置泡沫纸板的顶盖盖好，再用橡皮筋固定扎紧，每处理4次重复，96头虫。以国内某商品化8000IU/μl苏云金芽孢杆菌悬浮剂(晶体蛋白含量测定为0.8％)为药剂对照，以0.1％Triton X-100溶液或蒸馏水为空白对照。将其置于温度(27±1)℃，RH(65±5)％，光照周期16L:8D的培养箱中，每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。3d后调查分别调查死、活虫数，采用DPS7.05软件计算死亡率、LC₅₀值及其95％置信区间。

表5 Btk-KN-R8对草地贪夜蛾2龄幼虫的室内毒力测定结果

由表5可知，Btk-KN-R8对草地贪夜蛾2龄幼虫3天后，其幼虫表现为食量小排粪小死虫多，未死亡的幼虫的生命活性非常低，不进食不蠕动，用毛笔拨弄无反应。当晶体蛋白浓度在2μg/g时，校正死亡率达到96.84％，其LC₅₀为0.3368μg/g，表明Btk-KN-R8对草地贪夜蛾幼虫有很高的杀虫活性，且具有量效关系。而商品化苏云金芽孢杆菌SC对草地贪夜蛾的LC₅₀为9.6141μg/g，其杀虫活性远低于Btk-KN-R8，在浓度为25-50μg/g时对2龄幼虫致死率仅为71.58-78.95％，与已知文献报道的结果接近。

实施例5：Btk-KN-R8对草地贪夜蛾田间药效试验

试验基本情况：试验地点为云南江城县宝藏乡水城村，试验每个处理四个重复，小区随机排列，每个小区面积为40-50m²，于2019年5月25日施药，试验地草地贪夜蛾为1-2龄幼虫期，并用采用台州市绿野科技有限公司3WBD-20型电动喷雾器，兑水喷雾叶面喷施1次，重点对准心叶片喷施，杀虫晶体蛋白使用浓度分别为50、75、100μg/ml，用水量60kg/667m²。

防效调查及计算：每小区按照5点取样法，每点计数10株并进行标记，施药前调查药前基数，分别记录每株全部幼虫数量，药后1、3、7d各调查1次，标记植株上草地贪夜蛾幼虫存活的数量，计算虫口减退率和防效。虫口减退率(％)＝(药前活虫数－药后活虫数)/药前活虫数×100；防治效果(％)＝(处理区虫口减退率-对照区虫口减退率)/(100-对照区虫口减退率)×100。

同时以晶体蛋白浓度100μg/ml的国内某商品化8000IU/μl苏云金芽孢杆菌悬浮剂为药剂对照，以浓度66.67μg/ml的啶虫脒乳油为化学药剂对照，以清水为空白对照。

表6 Btk-KN-R8对草地贪夜蛾田间药效试验

从表6可以看出，本发明Btk-KN-R8对草地贪夜蛾防治效果均明显优于现有商品化制剂，并且用药7天后的防效与化学药剂啶虫脒相当，但杀虫速度更快。

实施例6：Btk-KN-R8对常见农业害虫的室内毒力测定

生测方法：将Btk-KN-R8测定晶体蛋白含量，用0.1％Triton X-100溶液稀释药液，按等比级数稀释法配制成一定浓度。将配制好的以上不同试虫的人工饲料置55℃水浴锅中保温备用，取9g人工饲料置于灭菌培养皿中，加入1mL待测样品溶液，分别顺次配制成不同质量浓度，充分搅拌均匀，静置，待冷却凝固后，将全部饲料分装于已消毒的24孔细胞培养板中；用毛笔拉线将初孵幼虫接于24孔板中，每孔一头幼虫，接好后使用内置泡沫纸板的顶盖盖好，再用橡皮筋固定扎紧，每处理4次重复，96头虫。小菜蛾选用2龄幼虫，其它选用初孵幼虫。添加0.1％Triton X-100溶液或蒸馏水为空白对照。将其置于温度(27±1)℃，RH(65±5)％，光照周期16L:8D的培养箱中。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。3d后调查分别调查死、活虫数，采用DPS7.05软件计算LC₅₀值及其95％置信区间。

表7 Btk-KN-R8对常见农业害虫室内毒力测定

供试虫类	LC<sub>50</sub>(μg/g)	95％confidence intervalμg/g
			小菜蛾	0.5817	0.4181-0.6153
棉铃虫	6.3018	4.8542-8.5462
			甜菜夜蛾	2.5401	1.3321～3.5143
斜纹夜蛾	3.0055	1.6220-5.7391
			二化螟	5.3211	4.5553-6.7713
玉米粘虫	1.7513	0.4879～2.3631

结果如表7，结果表明，Btk-KN-R8对小菜蛾、玉米粘虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾具有较高杀虫活性，对棉铃虫和二化螟有一定的杀虫活性，因此本菌株对农业主要害虫均具有杀虫活性。

以上说明本发明的Btk-KN-R8对草地贪夜蛾杀虫活性很高，防治效果显著，在农业主要害虫防治上具有很强的应用价值和潜力，符合我国农药减量的政策和可持续发展要求。

<110> 武汉科诺生物科技股份有限公司

<120> 苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1453

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）

<400> 1

tctgcggcgt gctatacatg caagtcgagc gaatggatta agagcttgct cttatgaagt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt gaactgcatg gttcgaaatt gaaaggcggc 180

ttcggctgtc acttatggat ggacccgcgt cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa 420

gaacaagtgc tagttgaata agctggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540

cgtaaagcgc gcgcaggtgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600

agggtcattg gaaactggga gacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta 720

actgacactg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gaagttaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgaaaa ccctagagat agggcttctc cttcgggagc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccatcattaa gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacggta caaagagctg caagaccgcg aggtggagct aatctcataa 1260

aaccgttctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtggggtaac ctttttggag ccagccgcct 1440

aagggacaga agt 1453

Claims

1.一株苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)Btk-KN-R8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017699。

2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8，其特征在于：该菌株含有杀虫基因cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia、cry2Aa、cry2Ab以及vip3Aa。

3.含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8的菌剂。

4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于：该菌剂含有50-200μg/ml的杀虫晶体蛋白。

5.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8或权利要求3或4所述的菌剂在防治作物虫害中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述作物虫害为草地贪夜蛾、小菜蛾、玉米粘虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫、二化螟。

7.一种发酵权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8的方法，其特征在于：按照发酵培养基体积的0.5-5％接入苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8的活化种子液，溶氧控制发酵，在接种至12h之间通气量为0.3-1v/v，罐压0.03-0.08Mpa，搅拌速度100-300rpm，12h后提高搅拌速度至400-500rpm，当芽孢形成率达到95％以上时结束发酵，即得发酵液。

8.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基为：玉米淀粉25g/L，黄豆饼粉30g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙2g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH7-7.2。

9.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于：所述通气量为0.6v/v，罐压0.05Mpa，搅拌速度300rpm。