CN117965392A - 一种用于防治草地贪夜蛾和玉米螟的苏云金芽孢杆菌 - Google Patents
一种用于防治草地贪夜蛾和玉米螟的苏云金芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于防治草地贪夜蛾和玉米螟的苏云金芽孢杆菌，所述苏云金芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29756，其对草地贪夜蛾和玉米螟均具有杀虫活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治领域，特别涉及对有害昆虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株。
背景技术
草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的幼虫及成虫均能对玉米等多种主要经济作物造成危害。
玉米螟（Pyrausta nubilalis, Hubern）可为害玉米植株的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量。
筛选高毒力苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）菌株资源可以为实现草地贪夜蛾或玉米螟的高效、绿色、持续防控提供一条有效的途径。
发明内容
本发明之一提供了一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29756。
对本发明的菌株遗传改良后得到的工程菌可以赋予其更优和/或更多的性能，例如可以结合菌株自身的特性，根据实际应用增加和/或拓宽其杀虫和/或抗虫的性能，或使其兼具抗菌的性能。即通过对本发明的菌株遗传改良，使其兼具如上性能中的至少一种。由于该工程菌株以本发明的苏云金芽孢杆菌为改造对象，即向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，遗传改良后的菌株仍然为苏云金芽孢杆菌。
因此，本发明之二提供了一种对本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。例如，所述遗传改良后的工程菌可以为转入携带有功能基因的质粒后所得到的工程菌株，也可以为将功能基因重组到野生菌株的基因组中得到的工程菌株。
因此，在一个具体实施方式中，所述工程菌通过向如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌转入功能基因得到。
在一个具体实施方式中，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述苏云金芽孢杆菌防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。
本发明之三提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌或如本发明之二所述的工程菌。
在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为悬浮剂、粉剂和颗粒剂中的一种。
在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为油悬剂或可湿性粉剂。
本发明之四提供了如本发明之一所述的苏云金芽孢杆菌、如本发明之二所述的工程菌和如本发明之三所述的组合物中的至少一种在用于防治草地贪夜蛾和/或玉米螟中的应用。
在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。
菌株保藏：本发明筛选的微生物BiotA93菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29756，保藏日期为2024年01月24日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。
附图说明
图1显示了BiotA93菌株16S的系统发育树。
图2显示了BiotA93菌株与G033A菌株的所有已知杀虫蛋白比对结果。
图3显示了BiotA93菌株及对照菌株对试虫的杀虫活性。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
液体LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，121°C灭菌20 min。
固体LB培养基：LB液体培养基加琼脂15 g/L，121°C灭菌20 min。
牛肉膏蛋白胨培养基：0.3wt%牛肉膏，0.5wt%蛋白胨，pH 7.2，121°C灭菌20 min。
实施例1：菌株的分离与形态学鉴定。
使用LB固体培养基对采集的土样进行芽孢杆菌筛选与分离。首先将土样在80°C下烘干5小时，将烘干的土样加入50 mL离心管，加入灭菌水15mL，放入粒径为3 mm玻璃珠10颗左右，斡旋震荡混匀，并进行梯度稀释，然后将系列稀释的样品置于80°C的水浴锅中20分钟，在无菌条件下取100微升的不同梯度下的稀释液涂布于LB固体平板上，并于30°C培养48小时，对菌落形态为无粘液、湿润、厚实且菌落外沿稍有扩散而不很整齐的菌落进行纯化，然后保藏纯化出的单菌落，以备用于后续的菌种鉴定和生物活性分析。
对纯化的单菌落在30°C条件下LB培养，不同时间取样镜检观察菌落形态特征、晶体特征等。在LB培养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.0×0.5 μm至1.5×0.5 μm；单个或两个以上呈链状存在。芽孢：椭圆形，大小约1.0×0.5μm至1.3×0.5 μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴胞晶体：球形、菱形和方形等。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著，科学出版社.2001年）中描述的芽孢杆菌形态特征基本一致，因此，将具有这种形态菌落的菌株初步鉴定为苏云金芽孢杆菌。
对分离的菌株进行编号。
实施例2：蛋白芽孢混合液制备及定量分析。
取400 μL活化的分离菌株的菌液（每个编号下的菌株）均匀地涂布于1/2 LB固体培养基上，在30°C恒温条件下培养至50%以上菌体裂解时，将全部菌体刮到50 mL离心管中，加适量预冷的超纯水充分洗涤两次，每次8000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀最后加入4mL无菌水悬浮，得到蛋白芽孢混合液。对蛋白芽孢混合液进行梯度稀释，每个梯度浓度下吸取100μL稀释液于含有卡那霉素的LB平板上进行涂布。30℃培养12 h后统计菌落数量，计算得蛋白芽孢混合液中菌落形成单元浓度（CFU/ml）。
实施例3：草地贪夜蛾活性菌株的筛选。
供试草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）由中国农科院植物保护研究所提供。
草地贪夜蛾人工饲料配方：玉米粉200 g，黄豆粉100 g，酵母粉90 g，蔗糖50 g，琼脂15 g，山梨酸1.8 g，对羟基苯甲酸甲酯（尼泊金）1.8 g，水1000 ml。
用已经定量的实施例2制备的待测样品的蛋白芽孢混合液先进行杀虫活性初筛，具体操作如下：称取15 g草地贪夜蛾人工饲料置于灭菌培养皿中，加入3mL实施例2制备且已经定量的BiotB53菌株的待测蛋白芽孢混合液，充分搅拌均匀，于室温放置；待饲料中多余的水分蒸发后，将全部饲料均匀的分装于24孔板中；随后用毛笔挑取拉丝、个体活跃且大小一致的初孵幼虫接于24孔板内，每孔一头，接好幼虫后用内置吹塑纸板的顶盖盖好，再用橡皮筋固定扎紧，防止幼虫逃逸。将24孔板置于温度（27±1）°C，RH（65±5）%，光照周期16L﹕8D的养虫室中。每处理3次重复，每个重复24头。以无菌水作为空白对照。每天检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。
分别调查7 d后死、活虫数，计算平均死亡率。
结果表明BiotA93对草地贪夜蛾有非常好的杀虫活性。
实施例4：BiotA93菌株的测序分析。
测序：提取BiotA93菌株的基因组DNA，核酸电泳检测合格的基因组DNA样品送至上海欧易生物医学科技有限公司测序：先经过Covaris随机打断成350bp至500bp的片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit试剂盒进行建库，DNA片段经过末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤，最终完成文库构建。文库构建合格后利用测序仪进行双端测序。
生物信息学分析：将测序下机获得原始测序数据 (Raw data) 后，进入生物信息分析流程，由上海欧易生物医学科技有限公司完成。具体分为如下两个阶段。
测序数据质量评估：主要通过对测序错误率，数据量，比对率，覆盖度等进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续分析。其中，高通量测序中产生的原始数（raw reads）为fastq格式序列。为了得到可用于后续分析的高质量reads，对raw reads进行进一步的质量过滤以获得高质量cleanreads。预处理软件为fastp（Version:0.19.5），质量过滤标准经过4步：1）去除接头序列；2）去除N（非 AGCT）碱基大于等于5的reads；3）以4个碱基为Windows的size进行滑窗，其平均碱基质量值小于20，则切除；4） 经过上述过滤后，去除长度小于75 bp或平均碱基质量值小于15 的reads。然后利用BWA（Version: 0.7.12）软件将clean reads比对到参考基因组（G033A菌株的基因组）上，以确定reads在参考基因组上的位置，比对算法为bwamen，参数为默认参数。比对结果经过SAMtools（Version: 1.4）软件转换格式并排序后，利用Picard（Version: 4.1.0.0）软件去除PCR重复reads。通过测序错误率、数据量、比对率、覆盖度等来评估样本数据是否达到标准，符合标准则进行后续分析。
变异信息分析：将高质量的测序序列比对到参考基因组上，将结果（以二进制binary 文件即bam 文件进行储存）进行变异信息分析-SNP&InDel检测。使用GATK（Version: 4.1.0.0）软件的Haplotypecaller模块的GVCF模式进行SNP和InDel检测。为了降低SNP和InDel检测的错误率，选用QD>=2.0的标准进行过滤，只保留满足该条件的突变位点。QD：QD是变异质量值（Quality）除以覆盖深度（Depth）得到的比值，实际上就是单位深度的变异质量值，大部分假阳性的变异的QD值都小于2。利用SnpEff（Version: 4.4）软件对SNP&InDel检测结果进行注释。最后将检测到的基因组变异信息利用Circos图进行可视化展示。
生物信息学分析：对测序下机数据使用Spade（Version:3.13.1）软件进行拼接获得BiotA93菌株全基因组DNA使用prodigal（Version：2.6.3）进行注释。使用CVtree4.0网站基于基因组DNA对BiotA93构建系统发育树进行聚类分析，结果见图1，图1的结果显示BiotA93与苏云金芽孢杆菌聚类在一起，其中，与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种G033A亲缘关系最为接近，因此，BiotA93菌株的系统分类为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。该菌株已于2024年01月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 29756，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
菌株BiotA93的杀虫基因分析：使用blast（Version：2.2.26）软件将菌株BiotA93与G033A的所有已知杀虫蛋白进行比对，结果见图2。其中，BiotA93菌株中与G033A菌株中Cry1Aa蛋白比对结果完全相同的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。结果显示，BiotA93菌株中包含的所有杀虫蛋白与G033A的所有杀虫蛋白的一致性均为100%。
实施例5：BiotA93和G033A菌株对草地贪夜蛾杀虫活性的比较。
将BiotA93和G033A菌株按照实施例2的操作分别制备BiotA93蛋白芽孢混合液和G033A蛋白芽孢混合液。
草地贪夜蛾人工饲料配方同实施例3。
称取15 g草地贪夜蛾人工饲料置于灭菌培养皿中，加入3mL已经定量且梯度稀释的待测样品的蛋白芽孢混合液，充分搅拌均匀，于室温放置；待饲料中多余的水分蒸发后，将全部饲料均匀的分装于24孔板中；随后用毛笔挑取拉丝、个体活跃且大小一致的初孵幼虫接于24孔板内，每孔一头，接好幼虫后用内置吹塑纸板的顶盖盖好，再用橡皮筋固定扎紧，防止幼虫逃逸。将24孔板置于温度（27±1）°C，RH（65±5）%，光照周期16L﹕8D的养虫室中。每处理3次重复，每个重复24头。每天检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。
以无菌水作为空白对照。
分别调查7 d后死、活虫数，计算平均死亡率，并基于空白对照的测定结果计算校正死亡率，使用PoloPlus软件分析致死中浓度LC50值，结果见图3。
实施例6：BiotA93和G033A菌株对玉米螟杀虫活性的比较。
将BiotA93和G033A菌株按照实施例2的操作分别制备BiotA93蛋白芽孢混合液和G033A蛋白芽孢混合液。
玉米螟人工饲料配方同草地贪夜蛾人工饲料配方。
称取15 g玉米螟人工饲料置于灭菌培养皿中，加入2mL已经定量且梯度稀释的待测样品的蛋白芽孢混合液，充分搅拌均匀，于室温放置；待饲料中多余的水分蒸发后，将饲料均匀的分装到直径90 mm培养皿中；随后用毛笔挑取拉丝、个体活跃且大小一致的初孵幼虫接种10头，接好幼虫后用盖上一张卫生纸并盖好培养皿盖，再用橡皮筋固定扎紧，防止幼虫逃逸。将培养皿置于温度（27±1）°C，RH（50±5）%，光照周期14L﹕10D的养虫室中。每处理3次重复，每个重复10头。每天检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。
以无菌水作为空白对照。
分别调查7 d后死、活虫数，计算平均死亡率，并基于空白对照的测定结果计算校正死亡率，使用PoloPlus软件分析致死中浓度LC50值，结果见图3。
根据图3的结果可知，对于草地贪夜蛾，BiotA93的杀虫活性时G033A的1.97倍；对于玉米螟，BiotA93的杀虫活性时G033A的2.87倍。
Claims (8)
1.一种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 29756。
2.一种对权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过向如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌转入功能基因得到。
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述苏云金芽孢杆菌防治为害植物害虫效果的基因中的至少一种。
5.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌或如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为悬浮剂、粉剂和颗粒剂中的一种。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为油悬剂或可湿性粉剂。
8.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌、如权利要求2至4中任意一项所述的工程菌和如权利要求5至7中任意一项所述的组合物中的至少一种在用于防治草地贪夜蛾和/或玉米螟中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410354978.1A CN117965392B (zh) | 2024-03-27 | 一种用于防治草地贪夜蛾和玉米螟的苏云金芽孢杆菌 |
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| CN117965392B CN117965392B (zh) | 2024-06-07 |
Family
ID=
Citations (5)
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