CN105441362A - 可杀鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌及应用 - Google Patents

可杀鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株苏云金芽孢杆菌，该菌是从自然材料向日葵组织碎片杂质中筛选而得。保藏号为CGMCC？No.11769；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北晨西路1号院3号。采用本发明所提供的苏云金芽孢杆菌Bt？00-50-5菌株能产椭圆形孢子、菱形晶体和8种以上孢外蛋白，其中，晶体和孢外蛋白具有高毒性，可高效杀死鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。本发明杀死植物鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌Bt？00-50-5为国内外首次筛选获得，防治植物病虫害效果最佳。

Description

可杀鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌及应用
技术领域
本发明涉及植物保护剂，尤其涉及一株可高效防治鳞翅目昆虫、植物寄生性线虫和植物鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一种昆虫病源细菌，为革兰氏阳性杆菌，为国内外著名的害虫生防菌。由于其对特定的昆虫具有毒性，且毒性大小依昆虫的种类不同。苏云金芽孢杆菌制备的杀虫剂是对人类和环境友好的安全型细菌杀虫剂，目前Bt杀虫剂已被广泛应用。与化学农药相比，使用Bt杀虫剂防治害虫成本较高。若在生物防治中使用超高效的细菌杀虫剂，就可降低其使用剂量和成本。因此，高效杀虫Bt菌株的筛选获得及其植物保护菌剂的制备方法研究就显得很重要。
有文献报道了苏云金芽孢杆菌可应用于防治害虫和植物线虫，如中国专利ZL200410050065.3公开了一种苏云金芽孢杆菌及其菌剂，该菌株或其菌剂能有效防治植物线虫以及鳞翅目地下害虫外，还具有促进植物生长等作用。但其发酵菌剂浓度需每升毫克级以上，才能杀死害虫。中国专利ZL200910210143.4公开了一种拮抗害虫的新颖苏云金芽孢杆菌，应用于生物性控制虫害的技术领域，所需浓度也是每升毫克级以上。尤其是，目前还没有人从自然资源中尤其是植物组织杂质中筛选出一株Bt菌同时具有三种植物保护功能，即可高效杀死多种鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株可杀鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌。
本发明采用的技术手段如下：一株苏云金芽孢杆菌的微生物保藏号为CGMCCNo.11769，拉丁文名称为Bacillusthuringiensis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
优选地，苏云金芽孢杆菌的发酵物成分包括孢子、晶体和8种以上胞外蛋白，晶体和胞外蛋白具有高毒性。
另一方面，一株苏云金芽孢杆菌，应用于杀害鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌。
优选地，鳞翅目昆虫包括向日葵带状蛾、大菜粉蝶、菜青虫、菜尺蠖、黄地老虎、榆树尺蠖、欧洲玉米螟和东方玉米螟，植物线虫包括根结线虫和香蕉螺旋线虫,鞘锈菌包括鸡蛋花鞘锈菌。
另一方面，一种菌剂，其活性成分为苏云金芽孢杆菌的发酵物。
优选地，该菌剂应用于防治植物病虫害。
本发明所提供的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌株能产椭圆形孢子、菱形晶体和8种以上孢外蛋白(分子量：170,133,60,45,27,15,13和7kDa)，其中，晶体和孢外蛋白具有高毒性，可高效杀死鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。
采用本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5发酵成菌剂，无需过滤，可将液体发酵物直接使用，防治植物病虫害，或使用发酵物的冷冻真空干燥成固体粉末，利用率为100％。适合大规模生产应用。
附图说明
图1为本发明的苏云金芽孢杆菌发酵物各组分的形态，其中A、晶体和孢子混合物的形态；B、晶体形态；C、孢子形态；
图2为溶解Bt00-50-5发酵产物孢外蛋白的葡聚糖凝胶G-75柱层析图；
图3为实施例2的分别使用本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂、自来水、化学农药喷施正在生长的白菜后的效果图；
图4为实施例3的不同剂量的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对香蕉螺旋线虫H.Multicinctus防治效果图，其中D10,D20和D40为苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂的稀释倍数，对照(Control)为自来水；
图5为实施例4的不同剂量的苏云金芽孢杆菌00-50-5杀害根结线虫Meloidogyneincognita防治效果图；其中D10,D20和D40为苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂的稀释倍数，对照(Control)为自来水；
图6为实施例5的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对根结线虫Meloidogyneincognita的防效图，其中G为正常的根结线虫，H为Bt00-50-5菌剂处理过的根结线虫；
图7为实施例6的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂防治植物病原真菌鸡蛋花鞘绣菌的效果图。其中：I和K分别为未处理的蛋花鞘绣菌培养36h、48h的孢子堆形态；J和L分别为用Bt00-50-5菌剂处理鸡蛋花鞘绣菌培养36h、48h的孢子堆形态；M、未处理的鸡蛋花鞘绣菌培养72h后的形态；N、用Bt00-50-5菌剂处理鸡蛋花鞘绣菌培养72h的孢子形态。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的苏云金芽孢杆菌(生物菌株00-50-5)菌株微生物保藏号为CGMCCNo.11769；拉丁文名称为Bacillusthuringiensis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址：CGMCC，北京市朝阳区北晨西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年12月1日。
本发明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5是从自然界中的向日葵组织碎片杂质中筛选的。本发明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的微生物特征为革兰氏染色阳性，能产椭圆形孢子、菱形晶体和8种以上孢外蛋白，如图1和图2所示。其中，8种以上孢外蛋白(分子量：170,133,60,45,27,15,13和7kDa)，经测试毒性，7kDa的孢外蛋白毒性最高，133,60,45,27,15和13六种孢外蛋白有毒，可高效杀死鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。
通过对苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌株基因的核苷酸序列鉴定。Bt00-50-5DNA基因组共含50万个以上核苷酸；合成6000多个不同功能的蛋白质。苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5还产生3个与溶解细胞有关的蛋白，分别为ToxinDoc蛋白毒素，芽孢杆菌溶血毒素HBL和小带带毒素Zot，用于抑制细胞生长，加快溶解和渗透细胞，其氨基酸系列表与现有技术中的苏云金芽孢杆菌公开的氨基酸序列表相似度非常高(相似度为98-100％)。
但是本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5产生3个cry晶体蛋白(如cry22AA1-liketoxin)，4个cyt细胞溶解蛋白毒素(如cyt2Ba13toxin)，一个vip营养体细胞分泌蛋白(如vip3BA1-liketoxin)；其中本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的1、cry22AA1-liketoxin、2、cyt2Ba13toxin和3、vip3BA1-liketoxin对应的具体DNA核苷酸系列表见附表。其氨基酸序列表与现有技术中的苏云金芽孢杆菌公开的氨基酸序列表相似性较低(相似度为24.11to35.58％)，如苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的cry22Aa1-like毒蛋白序列与苏云金芽孢杆菌cry22Aa1序列相比，最多32.58％相一致。这些已知Bt菌毒蛋白可以杀许多种类的害虫，特别是vip3Ba1-like,具有更广泛的植物保护功能。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌株有三种不同的活性，均可高效杀死鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。其中本发明杀死植物鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5为国内外首次筛选获得，防治植物病害虫效果最佳。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的具体筛选方法：
将野外采集的向日葵样本编号，如00-01到00-80，在冷库储存。每5个储存的样品(100克：如00-01和00-02，…00-05混合在一起；如00-46,00-47,…00-50混合在一起)，用破碎机把植物组织破碎。放置，自然沉降，过夜后去沉淀，用上面的悬浮液作为生物活性测定样品。高效杀虫细菌筛选的靶标昆虫是向日葵带状蛾。用人工饲料饲养向日葵带状蛾，每管(共25管)一个有微孔泡沫条，滴上不同浓度的样品悬浮液，含0.05％TritonX-100，加入一头二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。如那组混合样品有毒性，再分别用每一个样品制备悬浮液，进行活性测定。找到可杀虫的样品。接着用可杀虫的悬浮液，接种到牛肉膏-蛋白胨细菌培养基平板，在30℃细菌生长12小时，挑选单独菌落，再转接到另一个牛肉膏-蛋白胨细菌平板培养12小时，然后再选择单独的细菌菌落的一半，再次转接到牛肉膏-蛋白胨细菌平板培养基平板，培养4天。细菌染色鉴定：用苯酚-碱性品红染色液染色，如发现着色的菱形晶体和椭圆形的孢子。最后将上代细菌的另一半菌落，扩大培养并生测，SDS-聚丙烯酰胺电泳鉴定，如Bt00-50-5含133,000(含原毒素)和60,000道尔顿(含毒素)大小的蛋白。其中培养基选用牛肉膏和蛋白胨液体培养基，培养基含0.5％牛肉膏和1％蛋白胨,用自来水稀释，用NaOH调节pH到7.2，于121℃灭菌20分，冷却后放置24小时备用。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的发酵方法为常规方法，本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂为苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的发酵产物，包含晶体，孢子，上清液孢外蛋白和少数营养体。
通过生物活性测试证明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5晶体和胞外蛋白均可杀菜尺蠖(Trichoplusiani)；孢子没有毒性，其杀虫特性不同于已报道的其它Bt菌株。其发酵产物可全部回收，可采用冷冻旋转喷雾干燥法进行工业发酵制备菌粉或制备菌剂。经测试，由于苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的发酵物成分包含晶体(有毒)，孢子(负责遗传、再生)，孢外蛋白(有毒)和少数营养体菌剂，这不同于传统的苏云金芽孢杆菌菌剂的制备方法。传统的苏云金芽孢杆菌由于发酵上清液含的孢外蛋白毒性太低，所以一般要将发酵物经过板框过滤掉孢外蛋白，剩下的孢子和晶体混合物为杀虫剂，发酵物利用率较低、工艺繁杂导致菌剂制备成本高。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5发酵成菌剂，无需过滤，可将液体发酵物直接使用，防治植物病虫害，或使用发酵物的冷冻真空干燥剂，利用率为100％。适合大规模生产应用。
实施例1：测试苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂(包含晶体，孢子，上清液孢外蛋白和少数营养体)的生物杀菌活性。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对鳞翅目昆虫的杀虫活性实验如下：
供试昆虫或线虫：向日葵带状蛾、大菜粉蝶、菜青虫、菜尺蠖、黄地老虎、榆树尺蠖、欧洲玉米螟、东方玉米螟。
向日葵带状蛾采用每管一虫测定法：用人工饲料饲养幼虫；每管顶部打孔，放入一个有微孔的泡沫条，滴上不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100，每管加入一头二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。
大菜粉蝶采用浸叶法，剪抱球甘蓝叶片，浸入不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100，30秒，在滤纸上干燥，每瓶加入10头二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。
菜青虫采用浸叶法，剪小白菜叶片，浸入不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100，在滤纸上干燥，每瓶加入10头二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。
④菜尺蠖采用浸叶法，剪小白菜叶片，浸入不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100，在滤纸上干燥，每瓶加入10头二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。
⑤黄地老虎采用每孔一虫测定法，上代昆虫用人工饲料饲养；用带25-孔塑料盒，每孔注入1毫升加热的人工饲料，冷却后，在用移液枪在人工饲料表面上滴5微升不同浓度的Bt悬浮液，含0.005％TritonX-100，抽风干燥后每孔放入一头新孵化的一龄幼虫，3天后记录死亡虫数。
⑥欧洲玉米螟采用拌药法：用人工饲料饲养幼虫，把不同浓度Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100拌入人工饲料，每瓶加入10头二龄幼虫，7天后记录死亡虫数。
⑦东方玉米螟采用浸叶法：剪玉米叶片，浸入不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100，在滤纸上干燥，每瓶加入10头三龄幼虫，3天后记录死亡虫数，3天后记录死亡虫数。
⑧椰心叶甲采用浸叶法：剪椰子树叶片，浸入不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100，在滤纸上干燥，每瓶加入10头三龄幼虫，4天后记录死亡虫数。
⑨黄粉虫采用拌药法，用麸皮饲料饲养昆虫，把Bt菌剂悬浮液，含0.05％TritonX-100拌入麸皮饲料，每瓶加入10头二龄幼虫，7天后记录死亡虫数。
对照组：自来水(含0.05％TritonX-100)。重复4次实验，实验结果计算LC50值。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对植物寄生线虫的杀虫活性测定：
供试南方根结线虫用2龄幼虫，是从温室培养的感染了南方根结线虫的番茄根系中分离并孵化的。
供试香蕉螺旋线虫用2龄幼虫，是从温室培养的感染了香蕉螺旋线虫的番香蕉根系中分离并孵化的。
取冷冻干燥的0.03ml液体发酵物悬浮液，加人到0.3ml线虫悬浮液(含线虫2龄幼虫300条左右：活虫率：95％以上)，在室温下放置24h、48h后，在解剖镜下观察，记录死亡线虫数，然后计算并校正线虫死亡率。对照组：无菌的液体培养基。实验重复4次。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对植物病原鸡蛋花鞘锈菌的杀菌活性测定：
用鞘锈菌感染的鸡蛋花树叶，剪成小片，计真菌孢子数。浸入不同浓度的的Bt菌剂悬浮液(含0.05％TritonX-100)30秒，在滤纸上干燥，3天后观察真菌孢子堆颜色、形状并记录死亡孢子数。对照组：自来水(含0.05％TritonX-100)。实验重复4次。
苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5发酵物菌剂的杀虫/杀菌活性测试结果如表1。
表1
*+++高毒性(LC50＝0.2-0.5μg/mL)
++中等毒性((LC50＝5.0μg/mL)
+低毒性(LC50＝10.0-15.0μg/mL)
±微毒性(LC50≥100.0μg/mL)
-无毒性(LC50≥500.0μg/mL)
从表1的测试结果来看，0.2-0.4μg/mL的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂可高效杀害鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌，鳞翅目昆虫包括向日葵带状蛾、大菜粉蝶、菜青虫、菜尺蠖、黄地老虎、榆树尺蠖、欧洲玉米螟和东方玉米螟，植物线虫包括根结线虫和香蕉螺旋线虫,鞘锈菌包括鸡蛋花鞘锈菌。
实施例2:苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂高效防治植物病、昆害虫
以苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5液体发酵的悬浮液菌剂稀释40倍，另外在喷施前加入0.05％Triton-X100，
处理组D：往野外正在生长的大白菜喷施Bt00-50-5菌剂、从大白菜菜苗出土的第10天喷施，每7天一次,共3次；
对照组E：以自来水替代Bt00-50-5菌剂在相同的条件下喷施正在生长的白菜；
对照组F：以化学农药替代Bt00-50-5菌剂在相同的条件下喷施正在生长的白菜。
第45天观察防治效果，野外喷施Bt00-50-5菌剂的大白菜叶子没有发现被昆虫咬的洞和被植物病危害的症状，结果如图3所示，苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂处理大白菜菜叶上无虫咬的痕迹，长势良好。对照组E和F的菜叶上有多个虫咬的痕迹，说明了苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂能够高效防治植物病、昆害。
实施例3:不同剂量的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对香蕉螺旋线虫H.Multicinctus防效效果
使用不同剂量的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5杀香蕉螺旋线虫H.multicinctus效力。两次分别用稀释10、20和40x稀释的Bt00-50-5菌发酵原液进行野外灌根。40天后观察苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5杀线虫效力，效果如图3。具体方法：从香蕉根围取土样，带回实验室。拌匀后，取200g土样、2个同样尺寸的塑料盆，将带网洞的置于上部并于底部铺两层手帕纸，土样置其上，下层盆内装入400ml水，静置过夜后将下层塑料盆内含线虫的水溶液过筛(上层100目，下层500目定容至40ml，倒入烧杯内，内置转子于磁力搅拌器上搅拌，取1ml于线虫计数板上计数)。结果如图4所示，说明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂能够高效防治香蕉螺旋线虫H.Multicinctus。
实施例4:不同剂量的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5防治根结线虫Meloidogyneincognita效力
不同剂量的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5防治根结线虫Meloidogyneincognita效力。用10、20和40x稀释的Bt00-50-5发酵液和M.incognita线虫拌土，装在花盆，埋入黄瓜籽，黄瓜苗出土、生长，40天后调查根结线虫的数量。如图5所示，说明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂能够高效防治根结线虫Meloidogyneincognita。
实施例5:不同剂量的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对根结线虫Meloidogyneincognita效力
取冷冻干燥的0.03ml苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂，加到0.3ml线虫悬浮液(含线虫2龄幼虫300条左右：活虫率：95％以上)，在室温下放置24h、48h后，在解剖镜下观察并记录死亡线虫数。对照组：无菌的液体培养基。实验重复4次。观察结果如图6所示，其中G为正常的根结线虫，观察到的线虫形态为蠕动的，弯曲的形态，H为Bt00-50-5菌剂处理过的根结线虫，观察到的线虫形态为垂直型的，尸体漂浮在悬浮液表面。说明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂可直接杀害根结线虫Meloidogyneincognita。
实施例6:苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂防治植物病原真菌鸡蛋花鞘绣菌
对照组：鸡蛋鞘锈菌感染的鸡蛋花树叶使用自来水(含0.05％TritonX-100)处理。处理组：分别用鸡蛋鞘锈菌感染的鸡蛋花树叶剪片，把叶片浸入不同浓度的的Bt菌剂悬浮液(含0.05％TritonX-100)30秒，在滤纸上干燥，处理后的叶子要保湿，观察孢子堆和孢子形态变化并在光学显微镜下照相，结果如图7。I和K分别为未处理的蛋花鞘绣菌培养36h、48h的孢子堆形态；J和L分别为用Bt00-50-5菌剂处理鸡蛋花鞘绣菌培养36h、48h的孢子堆形态；M、未处理的鸡蛋花鞘绣菌培养72h后的形态；N、用Bt00-50-5菌剂处理鸡蛋花鞘绣菌培养72h的孢子形态。正常培养36h和48h的鸡蛋花鞘绣菌的孢子堆为金黄色，鸡蛋花鞘绣菌在加入苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂处理36h后，孢子堆变黑色，外包一层膜；48h后鸡蛋花鞘绣菌的孢子堆裂开，为黑棕色。正常培养72h的鸡蛋花鞘绣菌孢子在苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂处理72h后变肿胀，膨大。说明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂防治植物病原真菌鸡蛋花鞘绣菌。
综上所述，采用本发明所提供的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌株有三种不同的活性，可高效杀死鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。其中本发明杀死植物鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5为国内外首次筛选获得，杀虫效果最佳。
采用本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5发酵成菌剂，无需过滤，可将液体发酵物直接使用，防治植物病虫害，或使用发酵物的冷冻真空干燥成固体粉末，利用率为100％。适合大规模生产应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (7)

1.一株苏云金芽孢杆菌，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌的微生物保藏号为CGMCCNo.11769，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的一株苏云金芽孢杆菌，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌的发酵物包括孢子、晶体和8种以上胞外蛋白。
3.如权利要求1所述的一株苏云金芽孢杆菌，用于防治植物病虫害。
4.如权利要求3所述的一株苏云金芽孢杆菌，用于杀害鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌。
5.根据权利要求1所述的一株苏云金芽孢杆菌，其特征在于：所述鳞翅目昆虫包括向日葵带状蛾、大菜粉蝶、菜青虫、菜尺蠖、黄地老虎、榆树尺蠖、欧洲玉米螟和东方玉米螟，所述植物线虫包括根结线虫和香蕉螺旋线虫,所述鞘锈菌包括鸡蛋花鞘锈菌。
6.一种菌剂，其特征在于：其活性成分为权利要求1或2所述的苏云金芽孢杆菌发酵物。
7.如权利要求6所述的一种菌剂，用于防治植物病虫害。
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