CN100401898C - 防治温室蔬菜根结线虫病害的复合菌剂 - Google Patents
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Abstract
一种防治温室蔬菜根结线虫病害的生防菌剂，专用于防治黄瓜、番茄、辣椒等温室蔬菜根结线虫病害，由环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)菌株B130，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株J1组成，将各菌按2∶1比例混合后用PDA培养液33℃200rpm摇24-36小时，然后6000rpm离心，取湿菌与本实验室的菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。对蔬菜根结线虫病害的防治效果可达30-40%以上，增产可达85-96%以上。该菌剂使用时可以做成堆肥使用，也可稀释后在移栽时灌根使用。
Description
一、技术领域
本发明防治温室蔬菜根结线虫病害的复合菌剂(PGPR菌剂)配方属于农作物防病治病技术领域，专用于蔬菜根结线虫病害的无公害防治。
二、技术背景
目前我国保护地蔬菜的种植面积不断扩大，由于保护地内温湿条件适宜根结线虫生长和繁殖，再加上同一寄主作物的连作或寄主作物的连续种植，造成根结线虫病害逐年加重。目前对蔬菜根结线虫病害的药剂防治主要还是使用化学农药，如：三氯甲烷、敌敌畏，甲基异硫鳞，阿维菌素等。但是，使用化学农药不仅成本较高，而且还会带来严重的环境和安全问题。特别是高毒农药的大量使用，使得蔬菜中农药残留量超标问题突出。2000年5月份农业部农药检定所组织北京、上海、重庆、山东和浙江等5省市的农药检定所，对50个蔬菜品种，1293个样品的农药残留进行抽样检测，农药残留量超标率达30％，残留浓度高者为允许残留量的几倍甚至几十倍。蔬菜中农药残留量的严重超标，导致中毒事故时有发生。据卫生部统计数字，1999年我国由于农药残留引起的食品店菜性食物中毒菜有37起，急性中毒的例子，还能引起我们的重视，而慢性中毒和蓄积性中毒的情况我们就不得而知，其实其结果会更加可怕。我国出口到日本、韩国等发达国家的蔬菜经常因为农药残留达不到他们的标准而被退回，这给许多菜农造成很大损失。为此应该大力推广种植无公害蔬菜，规范生产标准，尽量减少化学农药的用量。
无公害蔬菜早已成为世界蔬菜生产的主流。早在20世纪20年代，国外就开始发展无公害蔬菜，其主要生产方式是无土栽培。据不完全统计，世界上单用营养液膜法(NFT)栽培无公害蔬菜的国家就达76个。在新西兰，半数以上的番茄、黄瓜等果菜类蔬菜是无土栽培的。日本、荷兰、美国等发达国家，采用现代化的水培温室，常年生产无公害蔬菜。我国无公害蔬菜的研究和生产始于1982年，该年召开全国生物防治会议，江苏省率先提出用生物防治代替化学农药防治。1983年，在全国植保总站的大力支持下，全国23个省、市开展了无公害蔬菜的研究、示范与推广工作。通过几年的研究实践，探索出一套综合防治病虫害、减少农药污染的无公害蔬菜生产技术。1985年全国推广无公害蔬菜生产面积4万hm2(60万亩)，至今全国各地几乎每个市都有无公害蔬菜生产基地。期间，开发了一些成功的生物杀菌剂，如农用链霉素、井岗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。但对根结线虫病害有较高防效的生防制剂穿刺巴氏芽孢杆菌(Pasteuria pentrans)不能在人工培养基上生长，这给其大规模的使用带来不便，同时使使用成本提高。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利(公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)方法，菌体可室温保存2～3年。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的是针对现有技术中的对根结线虫病害有较高防效的生防制剂穿刺巴氏芽孢杆菌不能大规模的使用、使用成本高的缺陷，提供开发一种防治蔬菜根结线虫病害的复合菌剂，该菌剂的防效可达25％以上，并且有增产功能。
技术方案
一种防治温室蔬菜根结线虫病害的复合菌剂，包含的主要细菌菌株为：环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)菌株B130，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株J1，菌株的混合比例为2∶1。
菌株的混合培养方法为：同时将各菌接种到PDA培养液中分别培养33℃200rpm，约24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，到各OD值在0.1～1之间时即可开始混菌，取OD值最大的菌1毫升，则其他某菌的量(ml)＝最大OD值×该菌与最大OD值菌的配比值/该菌的OD值。
混合后用PDA培养液33℃200rpm摇24-36小时，然后6000rpm离心，每1000ml培养液可获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体。
其中所用PDA培养液配制方法为：用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.5-8.0，然后121℃灭菌20分钟。
取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml应用于防治温室蔬菜根结线虫病害。
有益效果
本发明与现有蔬菜根结线虫病害防治技术相比，其优点和积极效果如下：
本发明是专门针对蔬菜根结线虫病害开发的生防制剂，因而在防治蔬菜根结线虫病害方面与穿刺芽孢杆菌相比有可以在人工培养基上生长和增产的作用。由于是生物制剂，没有因化学农药的使用所带来的一系列环境和安全问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，不但可以减少其他防治根结线虫病害化学农药的用量，为农民节省开支，而且有利于蔬菜的出口。
湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml，可室温保存2～3年。
离体试验表明，该菌剂对根结线虫二龄幼虫活性和对卵的孵化都有很好的抑制作用(表1、表2)。温室实验表明：该菌制剂能显著降低根结线虫的侵入，并兼有促进番茄生长的作用。温室大棚实验表明：使用该菌剂对蔬菜根结线虫病害的防治效果可达30-40％以上，增产可达85-96％以上(表3～5)。
四、具体实施方式
本发明提供的复合菌剂由已知公用对人及动植物无致病性的环状芽孢杆菌菌株B130(Bacillus circulans，)，枯草芽孢杆菌菌株J1(Bacillus subtilis)组成。
其中菌株B130见文献：郭坚华等.1994.抗青枯生防菌拮抗物性质的初步研究.南京农业大学学报.18(2)：59∽62.；菌株J1见文献：郭坚华等.2001.辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定.中国生物防治.17(3)：101∽106。
以上各菌株属公知公用常用菌株，在南京农业大学植物病理实验室(发明人所在实验室)均有保存，可保证长期向社会供应。
实施步骤如下：
1)PDA培养液配制：用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.5-8.0，然后121℃灭菌20分钟。
2)菌株混合方法：同时将各菌接种到PDA培养液中分别培养33℃200rpm，约24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零。当有OD值不在0.1～1之间时将各菌继续培养，每隔3小时测一次，直到各OD值均在此范围内时即可开始混菌，例如取OD值最大的菌1毫升，则其他某菌的量(ml)＝最大OD值×该菌与最大OD值菌的配比值/该菌的OD值。注：通常认为当600nm处OD值在0.1～1之间时符合浓度＝OD值×109cfu/ml。
3)将各菌混合后加到250ml PDA培养液中33℃200rpm摇36小时，通常每1000ml培养液可生产13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体。
4)取湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml，可室温保存2～3年。
该菌剂可以在温室移栽前倒入有机肥中制成堆肥(使用方法参照一种防治植物土传病害的堆肥法，专利公开号：CN1358693)，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在栽苗时灌根使用。栽苗后，其中的菌能在苗的根部定殖；另一些则占据根围空间，并消耗根的分泌物等，从而达到防治根结线虫病害的效果。
实施效果
(一)离体实验表明(表1、表2)，将菌株B130、菌株J1两菌株按2∶1比例混合后获得的复合菌剂(代号为AR11)对根结线虫Meloidogyneincognita二龄幼虫活性和对卵的孵化都有很好的抑制作用，对根结线虫二龄幼虫活性抑制作用达到52.5％，对根结线虫卵的孵化可降低到11.0％。
表1本发明复合菌剂AR11对根结线虫二龄幼虫活力的影响
注：AR11-10：菌液稀释10倍；CK：清水对照；S-AR11-10：上清液原液稀释10倍.
表2AR11对南方根结线虫Meloidogyne incognita孵化率的影响
注：AR11-2：菌液稀释2倍；AR11-5：菌液稀释5倍；AR11-10：菌液稀释10倍；CK：清水对照；
(二)温室试验(表3、表4)：试验结果表明，该菌制剂(液)AR11能显著降低根结线虫的侵入，并兼有促进番茄生长的作用。
表3：AR11菌液对番茄南方根结线虫病害的防治的温室盆钵试验
注：CK：对照组；AR11-2：菌液稀释2倍；AR11-10：菌液稀释10倍；
AR11-100：菌液稀释100倍
表4，AR11拌土处理的结果
根重(g/株) 茎重(g/株) 根结数(块/株) 卵块数(个/株) 平均卵量(个/卵块)
CK 20.2 61.4 719 234 444
A1 25.6 98.7 225 76 405
A2 24.4 92.4 328 122 427
A3 21.6 84.3 405 148 406
注：CK：对照组：AR11-2：菌液稀释2倍；AR11-10：菌液稀释10倍；
AR11-100：菌液稀释100倍
(三)温室大棚试验(表5、表6)：试验结果表明，使用该菌剂对蔬菜根结线虫病害的防治效果可达30-40％以上，增产可达85-96％以上。
表5：2003年江苏淮阴黄瓜根结线虫病害生防实验
| 处理方案 | 病情指数(％) | 防效(％) | 增产率(％) | |
| 对照组 | 0ml菌剂/亩 | 81.3 | ||
| 试验组a | 5000ml菌剂/亩 | 48 | 41 | 96.4 |
| 试验组b | 2500ml菌剂/亩 | 58.7 | 27.8 | 82.5 |
| 试验组c | 2000ml菌剂/亩 | 54.7 | 32.7 | 79.2 |
| 试验组d | 1000ml菌剂/亩 | 61.3 | 24.6 | 75.2 |
注：方案1菌剂稀释1000倍，混匀，作为定根水在移栽时灌根，每株约100ml，以灌够定根水为宜，一周后再如此浇灌一次；以后隔30天使用一次，共使用7次。
表6：2003年江苏马群大田黄瓜根结线虫病害生防实验
| 处理方案 | 病情指数(％) | 防效(％) | 增产率(％) | |
| 对照组 | 0ml菌剂/亩 | 88.4 | ||
| 试验组a | 5000ml菌剂/亩 | 58 | 34.3 | 85.1 |
| 试验组b | 2500ml菌剂/亩 | 61.2 | 30.8 | 72.5 |
| 试验组c | 2000ml菌剂/亩 | 64.7 | 26.8 | 65.2 |
| 试验组d | 1000ml菌剂/亩 | 71.3 | 19.3 | 55.6 |
注：方案1菌剂稀释1000倍，混匀，作为定根水在移栽时灌根，每株约100ml，以灌够定根水为宜，一周后再如此浇灌一次；以后隔30天使用一次，共使用7次。
Claims (5)
1.一种防治温室蔬菜根结线虫病害的复合菌剂，其特征在于，包含的细菌菌株为：环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)菌株B130，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株J1，菌株的混合比例为2∶1。
2.权利要求1所述的一种防治温室蔬菜根结线虫病害复合菌剂的制备方法，其特征在于：
1)同时将各菌接种到PDA培养液中分别培养33℃200rpm，24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，到各OD值在0.1～1之间时即可开始混菌，取OD值最大的菌1毫升，则其他某菌的量(ml)＝最大OD值×该菌与最大OD值菌的配比值/该菌的OD值；
2)混合后用PDA培养液33℃200rpm摇24-36小时，然后6000rpm离心，每1000ml培养液可获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体。
3.根据权利要求2所述的一种防治温室蔬菜根结线虫病害复合菌剂的制备方法，其特征在于，
所用PDA培养液配制方法为：用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.5-8.0，然后121℃灭菌20分钟。
4.根据权利要求2或3所述一种防治温室蔬菜根结线虫病害复合菌剂的制备方法，其特征在于，取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。
5.权利要求1所述一种防治温室蔬菜根结线虫病害复合菌剂在防治温室蔬菜根结线虫病害方面的应用。
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