CN111705020B - 一种绿针假单胞菌橙黄亚种及其微生物菌剂的制备和应用 - Google Patents

一种绿针假单胞菌橙黄亚种及其微生物菌剂的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绿针假单胞菌橙黄亚种及其微生物菌剂的制备和应用，本发明公开的绿针假单胞菌橙黄亚种2501既具有杀菌功能又具有杀虫功能，填补了目前已发现的绿针假单胞菌只具有单一生防功能的空白；并公开了绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂II，包括如下组分：吐温80、海藻糖、蔗糖、橙皮精油、2501液体微生物菌剂I；绿针假单胞菌橙黄亚种2501的固体微生物菌剂II，包括如下份的组分：葡萄糖、豆粕粉、黄腐酸钾、2501固体微生物菌剂I；并且通过大田实验取得了显著的应用效果。

Description

一种绿针假单胞菌橙黄亚种及其微生物菌剂的制备和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种绿针假单胞菌橙黄亚种及其微生物菌剂的制备和应用。
背景技术
目前用于农作物病虫害生物防治的微生物菌剂种类繁多，使用效果参差不齐，而且大部分用于生物防治的微生物菌剂防治农作物病虫害的作用单一，只能用于防治真菌病害或者只能用于防治单一虫害，同时用于防治真菌病害和虫害的微生物菌剂种类很少，同时防治多种真菌病害和多种虫害的微生物菌剂种类极少。
农作物的真菌病害和虫害经常是同时发生的，人们在防治真菌病害的同时也要防治虫害，如果使用纯化学农药防治，既容易造成环境污染，又使农作物产品造成农药残留的危害；如果使用微生物菌剂与化学农药联合使用，因为微生物菌剂与化学农药不能混合使用，容易降低微生物菌剂的使用效果，所以二者需要分开使用，这种防治方式，既有存在使用化学农药的潜在危害，又增加了劳动成本；如果完全使用微生物菌剂防治，那就需要使用多种微生物菌剂，提高了经济成本。
研发同时防治多种真菌病害和多种虫害的多功能微生物菌剂是目前市场急需解决的问题。
中国专利文献CN109258695A(申请号：201811214677.X)公开了绿针假单胞菌在防治线虫中应用，该发明公开了绿针假单胞菌,保藏编号为GDMCC No.60273在制备防治线虫的生物菌剂中的应用，但是并未涉及用于防治真菌病害和其它多种虫害的作用。
中国专利文献CN107099474A(申请号：201710333734.5)公开了一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌及其应用，该发明公开的绿针假单胞菌CCTCC NO：M 2016099，公开了该菌对苹果轮纹病、樱桃疫病、葡萄炭疽病、葡萄霜霉病、小麦纹枯病有生物防治的作用，但是并未涉及用于防治作物虫害的应用。
发明内容：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种绿针假单胞菌橙黄亚种及其微生物菌剂的制备和应用。
本发明涉及的绿针假单胞菌橙黄亚种制备的微生物菌剂，既可以有效防治多种作物病原真菌，又可以有效防治多种作物的病虫害；并且可以添加到肥料中制成具有防病菌和防虫害功能的肥料产品，本发明涉及的微生物菌剂具有防病菌、防虫害效果好、广谱性强、使用次数少的优点，同时减少了化学农药的使用量，提高农产品品质，节约成本，提高经济效益，同时保护环境。
本发明涉及的技术方案
一种绿针假单胞菌橙黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)2501，于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.19900。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501形态特征：在KMB培养基上，菌落呈圆形、扁平，菌落湿润，革兰氏染色呈阴性，培养初期产生绿色色素，培养后期产生橙黄色色素。
所述绿针假单胞菌橙黄亚种2501，是由山东五福生生态工程有限公司筛选获得。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501发酵物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将绿针假单胞菌橙黄亚种2501在固体培养基上活化，培养温度为30±0.5℃，培养时间为48h，制得活化的菌种；
(2)将步骤(1)活化的菌种接种于一级液体种子培养基中，培养温度30±0.5℃，转速 180-200rpm，培养时间20-24h，制得一级种子液；
(3)将步骤(2)制备的一级种子液接种于二级种子液体培养基中，接种量按体积分数计为3-5‰，培养温度为30±0.5℃，培养时间为12-15h，转速为200-250rpm，通气量为1.0-1.2vvm，制得二级种子液；
(4)将步骤(3)制备的二级种子液接种于三级种子液体培养基中，接种量按体积分数计为5-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为6-9h，转速为150-200rpm，通气量为1.0-1.2vvm，制得三级种子液；
(5)将步骤(4)制备的三级种子液，接种于液体发酵培养基，接种量按体积分数计为 5-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为28-32h，转速为100-150rpm，通气量为0.8-1.2vvm，制得液体发酵物，即为绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂I；
(6)将步骤(5)制得的发酵液进行干燥制得固体发酵物，绿针假单胞菌橙黄亚种2501 固体微生物菌剂I。
根据本发明优选的，步骤(1)的固体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂18-20g/L，余量水，pH值7.0-7.2。
根据本发明优选的，步骤(2)中一级液体种子培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，余量水，pH值7.0-7.2。
根据本发明优选的，步骤(2)中的转速为190-200rpm，培养时间为22-24h。
根据本发明优选的，步骤(3)中的二级种子液体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，余量水，pH值7.0-7.2。
根据本发明优选的，步骤(3)中的接种量按体积分数计为3.5-5‰，培养温度为30±0.5℃，培养时间为14-15h，转速为220-250rpm，通气量为1.1-1.2vvm。
根据本发明优选的，步骤(4)中的三级种子液体培养基的组分按质量分数计如下：胰豆粕0.2％，玉米粉1％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾 0.05％，磷酸氢二钾0.05％，余量水，pH值7.2-7.5。
根据本发明优选的，步骤(4)中的接种量按体积分数计为6-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为7-9h，转速为160-200rpm，通气量为1.1-1.2vvm。
根据本发明优选的，步骤(5)中的接种量体积分数计为6-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为29-32h，转速为130-150rpm，通气量为1.0-1.2vvm。
根据本发明优选的，步骤(5)中液体发酵培养基的组分如下：豆粕1％，玉米粉3％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，硫酸镁0.2％、硫酸铵0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％, 余量水，pH值7.2-7.5。
根据本发明优选的，步骤(5)制得发酵液的有效活菌数在3.5×1010cfu/mL以上。
根据本发明优选的，步骤(6)中固体微生物菌剂的有效活菌数在2×1011cfu/g以上。
根据本发明优选的，步骤(6)中的干燥方法为喷雾干燥法。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501和/或绿针假单胞菌橙黄亚种2501发酵物在农作物生物防治中的应用。
根据本发明优选的，绿针假单胞菌橙黄亚种2501和/或绿针假单胞菌橙黄亚种2501发酵物在农作物真菌病害、虫害防治中的应用。
根据本发明优选的，所述绿针假单胞菌橙黄亚种2501和/或绿针假单胞菌橙黄亚种2501 发酵物在农作物真菌病害、虫害防治时，用水稀释至有效活菌数为1×108cfu/(mL/g)以上。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：0.03-0.08份的吐温80、0.03-0.08份的海藻糖、1-3份的蔗糖、0.005-0.015份的橙皮精油、96.83-98.94份绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂I。
根据本发明优选的，绿针假单胞菌橙黄亚种2501的液体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：0.05份的吐温80、0.05份的海藻糖、2份的蔗糖、0.008份的橙皮精油、97.89份的绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂I。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂II的制备方法，包括如下步骤：
将重量份为0.03-0.08份的吐温80、0.03-0.08份的海藻糖、1-3份的蔗糖、0.005-0.015份的橙皮精油、96.83-98.94份上述制备的绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂I，混合均匀制得绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂II。
根据本发明优选的，绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂II的制备方法，包括如下步骤：
将重量份为0.05份的吐温80、0.05份的海藻糖、2份的蔗糖、0.008份的橙皮精油、97.89 份绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂I，混合均匀制得绿针假单胞菌橙黄亚种2501 液体微生物菌剂II。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂II在农作物生物防治中的应用。
根据本发明优选的，绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂II在农作物真菌病害、虫害防治中的应用。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501的固体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：20-30份的葡萄糖、15-25份的豆粕粉、25-35份的黄腐酸钾、10-30份为上述绿针假单胞菌橙黄亚种2501 固体微生物菌剂I。
根据本发明优选的，绿针假单胞菌橙黄亚种2501的固体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：30份的葡萄糖、20份的豆粕粉、30份的黄腐酸钾、20份为绿针假单胞菌橙黄亚种 2501固体微生物菌剂I。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501的固体微生物菌剂II的制备方法，包括如下步骤：
将重量份为20-30份的葡萄糖、15-25份的豆粕粉、25-35份的黄腐酸钾、10-30份为上述绿针假单胞菌橙黄亚种2501固体微生物菌剂I，混合均匀，制得绿针假单胞菌橙黄亚种2501 的固体微生物菌剂II。
根据本发明优选的，绿针假单胞菌橙黄亚种2501的固体微生物菌剂II的制备方法，包括如下步骤：
将重量份的组分：30份的葡萄糖、20份的豆粕粉、30份的黄腐酸钾、20份为绿针假单胞菌橙黄亚种2501固体微生物菌剂I，混合均匀，制得绿针假单胞菌橙黄亚种2501的固体微生物菌剂II。
绿针假单胞菌橙黄亚种2501的固体微生物菌剂II在农作物生物防治中的应用。
根据本发明优选的，绿针假单胞菌橙黄亚种2501固体微生物菌剂II在农作物真菌病害、虫害防治中的应用。
本发明技术方案的有益效果
1、广谱性强
本发明涉及的绿针假单胞菌橙黄亚种2501，除对镰刀菌、核盘菌引起的根腐病、菌核病有防治效果外，对苹果小卷夜蛾、小麦管蓟马、金龟子甲虫、瓢虫、科罗拉多马铃薯甲虫、象鼻虫、红叶臭椿盲蝽等农作物害虫也有防治效果。
2、杀虫效果好
本发明涉及的绿针假单胞菌橙黄亚种2501对害虫的防控效果可达80％以上。
3、安全环保
本发明涉及的绿针假单胞菌橙黄亚种2501是从山东寿光蔬菜耕地保护地中筛选分离得到，未进行基因改造，田间使用不具有风险，其分泌的杀菌、杀虫物质是小分子环肽类、脂肽类化合物，可在土壤中自然快速分解，对作物、动物和人体均安全，可实现田间、作物、水源无污染、无残留，与常规杀菌、杀虫剂相比安全性大大提高，有利于有机农业的发展。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不局限于此。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。
下面将绿针假单胞菌橙黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)2501简称为 2501；
绿针假单胞菌BNCC 190697：购自北京北纳创联生物技术研究院；
尖刀镰孢菌、灰葡萄孢霉、禾长蠕孢、粉红单端孢霉：由山东省科学院提供，也可以在现有的菌种保藏中心购买同种菌替代；
疫霉菌：分离自临沂兰山区汪沟镇草莓地，也可以在现有的菌种保藏中心购买同种菌替代；
核盘菌、大丽轮枝菌：由新疆农科院提供，也可以在现有的菌种保藏中心购买同种菌替代；
青枯假单胞菌BNCC335855：购自北京北纳创联生物技术研究院。
实施例1-1
绿针假单胞菌橙黄亚种2501的筛选，包括如下步骤：
寿光蔬菜保护地中细菌的分离：利用KMB、LB培养基、营养琼脂培养基对土壤、健康植株的根、茎中的细菌进行分离，共分离出细菌菌株126株。
1、以植物病原真菌为靶标，对分离纯化到的细菌进一步筛选
将保存于4℃冰箱的供试植物病原真菌(尖孢镰刀菌、疫霉菌、核盘菌)转接到PDA平板中进行活化，30℃培养3d，采用平板对峙法，对初步从寿光蔬菜保护地中分离纯化到的细菌，以供试植物病原真菌为靶标，测定其抗菌活性。具体方法为：待病原菌长满平板后，用打孔器打取菌饼(Φ5mm)，将菌饼倒贴在PDA平板中央，挑取分离到的细菌(已在LB固体培养基上，30℃培养2d)平行接种到离病原菌等距离的三个角上，接种分离细菌到病原菌饼中心的距离为30mm，30℃培养3d，观察是否有拮抗作用，并测量抑菌带的宽度，抑菌带宽度是指连接分离细菌接种点与病原菌菌饼中心点，该连接线上透明带的宽度；以抑菌带宽度作为拮抗作用强弱的标志，不同细菌菌株对植株病原菌的抑菌带检测结果见表1。
表1
Figure BDA0002565208380000051
注：表中所列菌株是抑菌效果相对较好的菌株。
从表1中可以看出编号为2501的菌株对上述三种植物病原菌的抑菌效果较好。
2、以苹果小卷夜蛾、小麦管蓟马为靶标，对分离纯化到的细菌进一步筛选
将分离到的不同细菌按照相同接种量，分别接种平行的LB液体培养基，30℃，培养2d 制得不同细菌发酵液，将制得发酵液稀释50倍，然后将剪好的苹果圆叶片分别浸于不同细菌发酵液中10s，取出后自然晾干，置于培养皿内，分别接入大小一致的苹果小卷夜蛾30头，用封口膜封口后扎孔，保证试虫正常呼吸。24h后分别观察各处理试虫存活情况，以毛笔刷轻触碰，无反应为死虫，计算死亡率。每个处理3次重复，以无菌水处理为空白对照CK。
分别取上述稀释50倍后的不同细菌发酵液1ml至5ml离心管内，盖上管盖，摇匀滚动数分钟，待菌液在管内分布均匀时，倒出菌液，室内自然晾干，制成菌膜。将挑选好的30头小麦管蓟马放在在管内(管盖扎孔)爬动1h后转入另一10ml干净管中，并在其中放入新鲜小麦叶片供其取食，棉花团封口。将处理后的试虫放入人工气候箱培养，72h后分别观察各处理试虫存活情况，以毛笔刷轻触碰，无反应为死虫，计算死亡率，每个处理3次重复，空白对照组CK以无菌水处理，上述处理对苹果小卷夜蛾试虫和小麦管蓟马试虫的作用结果见表2。
表2
Figure BDA0002565208380000061
注：表中所列菌株是杀虫效果相对较好的菌株。
从表2中可以看出编号为2501的菌株对这两种害虫的致死率最高。
实施例1-2
2501菌株的形态特征：革兰氏染色呈阴性，在KMB固体培养基上，菌落呈圆形、扁平，菌落湿润，培养初期产生绿色色素，培养后期产生橙黄色色素，为绿针假单胞菌橙黄亚种 (Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)，命名为绿针假单胞菌橙黄亚种2501。
1018菌株的形态特征：在KMB培养基上，菌落呈圆形、扁平，菌落湿润，革兰氏染色呈阴性，培养初期产生绿色色素，培养后期产生橙黄色色素，与2501相比，培养同样的时间，菌落要小，为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)，命名为绿针假单胞菌1018。
上述绿针假单胞菌橙黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)2501，于2020 年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.19900。
实施例2-1
2501发酵物的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将绿针假单胞菌橙黄亚种2501在固体培养基上活化，培养温度为30±0.5℃，培养时间为48h；
固体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂17g/L，余量水，pH值7.2-7.4。
(2)一级种子液的制备：将步骤(1)活化的菌种接种于一级液体种子培养基中，培养温度30±0.5℃，转速190-200rpm，培养时间22-24h，制得一级种子液；
一级液体种子培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖 5g/L，余量水，pH值7.2-7.4。
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)制备的一级种子液接种于二级种子液体培养基中，接种量按体积分数计为3.5-5‰，培养温度为30±0.5℃，培养时间为14-15h，转速为220-250rpm，通气量为1.1-1.2vvm，制得二级种子液。
二级种子液体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖 5g/L，余量水，pH值7.2-7.4。
(4)三级种子液的制备：将步骤(3)制备的二级种子液接种于三级种子液体培养基中，接种量按体积分数计为6-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为7-9h，转速为160-200rpm，通气量为1.1-1.2vvm，制得三级种子液。
三级种子液体培养基的组分如下：豆粕0.2％，玉米粉1％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，余量水，pH值7.2-7.4。
(5)发酵液的制备：将步骤(4)制备的三级种子液，接种于液体发酵培养基，接种量按体积分数计为6-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为29-32h，转速为130-150rpm，通气量为1.0-1.2vvm，制得液体发酵物，即为2501液体微生物菌剂I，有效活菌数为3.5×1010cfu/mL。
液体发酵培养的组分如下：豆粕1％，玉米粉3％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，硫酸镁0.2％、硫酸铵0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，余量水，pH值7.2-7.4。
(6)将步骤(5)制得的发酵液进行喷雾干燥制得固体发酵物，即为2501固体微生物菌剂 I，有效活菌数为2×1011cfu/g。
实施例2-2
2501发酵物的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将绿针假单胞菌橙黄亚种2501在固体培养基上活化，培养温度为30±0.5℃，培养时间为48h；
固体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂17g/L，余量水，pH值7.2-7.4。
(2)一级种子液的制备：将步骤(1)活化的菌种接种于一级液体种子培养基中，培养温度30±0.5℃，转速180-200rpm，培养时间20-24h，制得一级种子液；
一级液体种子培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖 5g/L，余量水，pH值7.2-7.4。
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)制备的一级种子液接种于二级种子液体培养基中，接种量为3-5‰，培养温度为30±0.5℃，培养时间为12-15h，转速为200-250rpm，通气量为 1.0-1.2vvm，制得二级种子液。
二级种子液体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，余量水，pH值7.2-7.4。
(4)三级种子液的制备：将步骤(3)制备的二级种子液接种于三级种子液体培养基中，接种量为5-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为6-9h，转速为150-200rpm，通气量为 1.0-1.2vvm，制得三级种子液。
三级种子液体培养基的组分如下：胰豆粕0.2％，玉米粉1％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，硫酸镁0.1％、硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，余量水，pH值7.2-7.4。
(5)发酵液的制备：将步骤(4)制备的三级种子液，接种于液体发酵培养基，接种量为5-10％，培养温度为30±0.5℃，培养时间为28-32h，转速为100-150rpm，通气量为0.8-1.2vvm，制得液体发酵物，即为2501液体微生物菌剂I，有效活菌数为2.0×1010cfu/mL。
液体发酵培养的组分如下：豆粕0.5％，玉米粉3％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，硫酸镁0.2％、硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，余量水，pH值7.2-7.4。
(6)将步骤(5)制得的发酵液进行喷雾干燥制得固体发酵物，即为2501固体微生物菌剂 I，有效活菌数为1.25×1011cfu/g。
对比例2-1
与实施例2-1不同之处在于发酵培养1018菌株，制得与2501液体微生物菌剂I相同活菌数的1018液体微生物菌剂I，并制得与2501固体微生物菌剂I相同活菌数的1018固体微生物菌剂I。
对比例2-2
与实施例2-1不同之处在于发酵培养绿针假单胞菌BNCC 190697，制得与2501液体微生物菌剂I相同活菌数的BNCC 190697液体微生物菌剂I，并制得与2501固体微生物菌剂I相同活菌数的BNCC 190697固体微生物菌剂I。
效果例2-1
将不同菌种的绿针假单胞菌对部分植物致病菌的拮抗性实验
分别取100μL 108cfu/mL的不同植物病原菌稀释液涂布于PDA固体培养基平板表面，然后在每个平板中央放置1个无菌牛津杯(6mm×7.8mm×10mm)，将牛津杯轻轻按压，使其与培养基接触无缝隙后，向每个牛津杯中加入300μL不同方法生产的绿针假单胞菌发酵液，然后将平板置于30℃培养箱中恒温培养，培养72h后，测量各个样品的抑菌圈直径，所述抑菌圈直径为牛津杯外抑菌圈的宽度，结果见表3。
表3
Figure BDA0002565208380000081
Figure BDA0002565208380000091
从表3中，可以看出不同处理的绿针假单胞菌发酵物对病原真菌都具有抑菌作用，对病原细菌无作用，但在对不同病原真菌的抑菌效果上，这几种菌存在明显的差异，在抑制尖刀镰孢菌、大丽轮枝菌上，实施例2-1、实施例2-2、对比例2-1、对比例2-2差异不显著，但在抑制疫霉菌、灰葡萄孢霉、核盘菌、粉红单端孢霉、禾长蠕孢病原真菌上，差异显著，其中实施例2-1的抑菌效果最好。
效果例2-2
不同菌种的绿针假单胞菌对苹果小卷夜蛾、小麦管蓟马的杀虫活性实验
将预先剪好的苹果圆叶片分别浸于相同发酵方法制备的相同活菌数的不同菌种的绿针假单胞菌发酵液中10s，取出后自然晾干，置于培养皿内，分别接入大小一致的苹果小卷夜蛾 30头，用封口膜封口后扎孔，保证试虫正常呼吸。24h后分别观察各处理试虫存活情况，以毛笔刷轻触碰，无反应为死虫，计算死亡率。每个处理3次重复，以无菌水处理为空白对照 CK。
分别取分散均匀、不同方法生产的绿针假单胞菌发酵液1ml至5ml离心管内，盖上管盖，摇匀滚动数分钟，待菌液在管内分布均匀时，倒出菌液，室内自然晾干，制成菌膜。将挑选好的30头小麦管蓟马放在在管内(管盖扎孔)爬动1h后转入另一10ml干净管中，并在其中放入新鲜小麦叶片供其取食，棉花团封口。将处理后的试虫放入人工气候箱培养，72h后分别观察各处理试虫存活情况，以毛笔刷轻触碰，无反应为死虫，计算死亡率，每个处理3次重复，空白对照组CK以无菌水处理。
利用SPSS方法对上述杀虫试验数据分析结果见表4：
表4
Figure BDA0002565208380000101
注：a差异不显著，b、c差异显著
从表4中可以看出，2501对苹果小卷夜蛾和小麦管蓟马有杀虫效果，对照与BNCC190697 无差异性，对苹果小卷夜蛾和小麦管蓟马无杀虫活性。
实施例3-1
2501液体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：
0.05份的吐温80、0.05份的海藻糖、2份的蔗糖、0.008份的橙皮精油、97.892份为实施例2-1制备的2501液体微生物菌剂I；
所述2501液体微生物菌剂II的制备方法，包括如下步骤：
将上述组分按相应重量份混合均匀既得2501液体微生物菌剂II。
实施例3-2
2501液体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：
0.03份的吐温80、0.05份的海藻糖、3份的蔗糖、0.008份的橙皮精油、96.912份为实施例2-1制备的2501液体微生物菌剂I；
所述2501液体微生物菌剂II的制备方法，包括如下步骤：
将上述组分按相应重量份混合均匀既得2501液体微生物菌剂II。
实施例3-3
2501液体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：
0.05份的吐温80、0.08份的海藻糖、2份的蔗糖、0.015份的橙皮精油、97.855份为实施例2-1制备的2501液体微生物菌剂I；
所述2501液体微生物菌剂II的制备方法，包括如下步骤：
将上述组分按相应重量份混合均匀既得2501液体微生物菌剂II。
实施例3-4
与上述实施例3-1的不同之处在于，2501液体微生物菌剂II的成分组成中，将实施例2-1 制备的2501液体微生物菌剂I改为实施例2-2制备的2501液体微生物菌剂I。
对比例3-1
与上述实施例3-1的不同之处在于，液体微生物菌剂II的成分组成中，将实施例2-1制备的2501液体微生物菌剂I改为对比例2-1制备的1018液体微生物菌剂I，制得1018液体微生物菌剂II。
对比例3-2
与上述实施例3-1相比，不同之处在于2501液体微生物菌剂II的成分组成中，不加海藻糖，用蔗糖代替海藻糖的重量份。
对比例3-3
与上述实施例3-1相比，不同之处在于2501液体微生物菌剂II的成分组成中，不加蔗糖，用海藻糖代替蔗糖的重量份。
对比例3-4
与上述实施例3-1相比，不同之处在于2501液体微生物菌剂II的成分组成中，不加吐温80，用甘油代替吐温80的重量份。
对比例3-5
与上述实施例3-1相比，不同之处在于2501液体微生物菌剂II的成分组成中，不加橙皮精油，用柠檬精油代替橙皮精油的重量份。
对比例3-6
与上述实施例3-1的不同之处在于，液体微生物菌剂II的成分组成中，将实施例2-1制备的2501液体微生物菌剂I改为对比例2-2制备的BNCC 190697液体微生物菌剂I，制得到 BNCC 190697液体微生物菌剂II。
效果例3-1
将预先剪好的苹果圆叶片分别浸于实施例3-1、3-2、3-3、3-4与对比例3-1、3-2、3-3、 3-4、3-5、3-6制备的液体微生物菌剂II的100倍稀释液中10s，取出后自然晾干，置于培养皿内，分别接入大小一致的苹果小卷夜蛾，用封口膜封口后扎孔，保证试虫正常呼吸。72h后分别观察各处理试虫存活情况，以毛笔刷轻触碰，无反应为死虫，计算死亡率。每个处理3次重复，以无菌水处理为空白对照CK，处理结果建表5。
表5
Figure BDA0002565208380000111
Figure BDA0002565208380000121
注：1、虫口减退率(％)＝(施药前活虫数-施药后活虫数)/施药前活虫数×100
2、防治效果(％)＝(药剂处理区虫口减退率-空白对照区虫口减退率)/(100-空白对照区虫口减退率)x 100
3、菌剂稀释100倍使用
a:差异不显著；b、c、d、e:差异显著
从表5中的数据可以看出，实施例3-1制备的菌剂对苹果小卷夜蛾的致死效果最好，防效可达90.74％；由上述实验数据可以看出吐温80、海藻糖、蔗糖、橙皮精油、2501液体微生物菌剂I混合使用产生了一定的协同作用，对苹果小卷叶蛾的防治效果显著。
效果例3-2
分别取实施例3-1、3-2、3-3、3-4与对比例3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6制备的液体微生物菌剂II1ml至5ml离心管内，盖上管盖，摇匀滚动数分钟，待菌液在管内分布均匀时，倒出菌液，室内自然晾干，制成菌膜，菌膜浓度即为菌液浓度。将挑选好的30头小麦管蓟马放在在管内(管盖扎孔)爬动1h后转入另一10mL干净管中，并在其中放入新鲜小麦叶片供其取食，棉花团封口。将处理后的试虫放入人工气候箱培养，72h后分别观察各处理试虫存活情况，以毛笔刷轻触碰，无反应为死虫，计算死亡率，每个处理3次重复，空白对照组CK 以无菌水处理，处理结果见表6。
表6
Figure BDA0002565208380000122
注：1、虫口减退率(％)＝(施药前活虫数-施药后活虫数)/施药前活虫数×100
2、防治效果(％)＝(药剂处理区虫口减退率-空白对照区虫口减退率)/(100-空白对照区虫口减退率)x 100
a:差异不显著；b、c、d:差异显著
从表6中的数据可以看出，实施例3-1制备的微生物菌剂对小麦管蓟马的致死效果最好，防效可达82.33％，由上述实验数据可以看出吐温80、海藻糖、蔗糖、橙皮精油、2501液体微生物菌剂I混合使用产生了一定的协同作用，对小麦管蓟马的防治效果显著。
效果例3-3
用小型喷雾器将灰葡萄孢霉孢子悬液喷雾接种于给处理盆栽的番茄植株上，待植株发病后，分别取实施例3-1、3-2、3-3、3-4与对比例3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6制备的液体微生物菌剂II液体，稀释50倍后，用喷雾器喷施于各处理的盆栽番茄植株上，每盆喷量为20mL, 空白对照组CK以无菌水处理，在处理后第3d、第7d调查各处理组的发病情况，统计各处理病情，计算病情指数、防治效果，见表7。
表7
Figure BDA0002565208380000131
注：病情指数＝∑【(各级病叶数×病级数)/(调查总叶数×最高病级数)】×100；防治效果(％)＝(对照病情指数- 处理病情指数)/对照病情指数×100
a差异不显著，b、c、d差异显著
从表7中我们可以看出实施例3-1制备的微生物菌剂对番茄灰霉病的防治效果最好，防效可达79.53％，由上述实验数据可以看出吐温80、海藻糖、蔗糖、橙皮精油、2501液体微生物菌剂I混合使用产生了一定的协同作用，对番茄灰霉病的防治效果显著。
实施例4-1
2501固体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：30份的葡萄糖、20份的豆粕和30份的黄腐酸钾，20份为实施例2-1制备的2501固体微生物菌剂I；
所述固体微生物菌剂的制备方法：包括以下步骤：
将上述组分按相应重量份混合均匀既得2501固体微生物菌剂II。
实施例4-2
2501固体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：20份的葡萄糖、25份的豆粕和35份的黄腐酸钾，20份为实施例2-1制备的2501固体微生物菌剂I；
所述固体微生物菌剂的制备方法：包括以下步骤：
将上述组分按相应重量份混合均匀既得2501固体微生物菌剂II。
实施例4-3
2501固体微生物菌剂II，包括如下重量份的组分：30份的葡萄糖、25份的豆粕和25份的黄腐酸钾，20份为实施例2-1制备的2501固体微生物菌剂I；
所述固体微生物菌剂的制备方法：包括以下步骤：
将上述组分按相应重量份混合均匀既得2501固体微生物菌剂II。
实施例4-4
与上述实施例4-1相比，不同之处在于固体微生物菌剂II的成分组成中，实施例2-1制备的2501固体微生物菌剂I改为实施例2-2制备的2501固体微生物菌剂I。
对比例4-1
与上述实施例4-1相比，不同之处在于固体微生物菌剂II的成分组成中，实施例2-1制备的2501固体微生物菌剂I，改为对比例2-1制备的1018固体微生物菌剂I。
对比例4-2
与上述实施例4-1相比，不同之处在于固体微生物菌剂II的成分组成中，不添加葡萄糖，用蔗糖代替葡萄糖的重量份。
对比例4-3
与上述实施例4-1相比，不同之处在于固体微生物菌剂II的成分组成中，不添加豆粕粉，用花生粕代替豆粕粉的重量份。
对比例4-4
与上述实施例4-1相比，不同之处在于固体微生物菌剂II的成分组成中，不添加黄腐酸钾，用腐殖酸钾代替黄腐酸钾的重量份。
对比例4-5
与上述实施例4-1相比，不同之处在于固体微生物菌剂II的成分组成中，实施例2-1制备的2501固体微生物菌剂I，改为对比例2-2制备的BNCC 190697固体微生物菌剂I。
效果例4-1
盆栽实验：取小麦大田耕层土，去除石子等杂质后过孔径1.0cm筛，添加有机肥15g/kg，尿素0.25g/kg及磷肥0.5g/kg后充分混匀装入塑料盆钵(直径14.5cm×高11.5cm),每盆装土 1.5kg。选取大小一致的健康黄瓜幼苗(四个叶片)进行移栽，每盆1株。按照常规水肥措施管理。
接种：刮取直径90cm，PDA平板上25℃，培养10d的尖刀镰孢菌的孢子制备成孢子悬浊液混合均匀，分成平行份共10份，每份100mL，分别取与上述实施例4-1、4-2、4-3、4-4、对比例4-1、4-2、4-3、4-4、4-5制备的固体微生物菌剂II各20g，各自分别与1份上述孢子悬液混合均匀制得混合液，以无菌水与孢子悬液混合均匀作为对照液CK。在黄瓜苗移栽5d 后，采取灌注法，接种上述混合液和对照液CK，每个处理对应3盆黄瓜苗，每盆接种100mL。后期正常管理，接种1个月后挖取植株，统计发病程度，计算病情指数，防治效果，处理结果见表8。
表8
Figure BDA0002565208380000151
注：1、发病率＝(发病株数/总株数)×100％；2、病情指数＝∑【(各病级株数×代表级值)/(总株数×发病最高级的代表级值)】×100；3、防治效果＝【(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数】×100％；4、病害分级标准：0级，根部健康；Ⅰ级，1/5以下侧根腐烂；Ⅱ级，1/5至1/3侧根腐烂；Ⅲ级，1/3至2/3侧根腐烂；Ⅳ级，2/3以上侧根腐烂甚至整株死亡 4、相同字母间表示差异不显著，不同字母间表示差异显著
从表8中可以看出，在实验室黄瓜盆栽实验中，实施例4-1对黄瓜根腐病的防治效果最好，葡萄糖、豆粕、黄腐酸钾与2501固体微生物菌剂I混合使用产生了一定的协同作用，对黄瓜根腐病的防治效果显著。
效果例4-2
盆栽实验：取小麦大田耕层土，去除石子等杂质后过1.0cm筛，添加有机肥25g/kg，尿素0.20g/kg及磷肥0.45g/kg后充分混匀装入塑料盆钵(直径14.5cm×高11.5cm),每盆装土 1.5kg。选取大小一致的健康草莓幼苗进行移栽，每盆1株，按照常规水肥措施管理。
接种：刮取直径90cm，PDA平板上25℃，培养10d的疫霉菌的孢子制备成孢子悬浊液混合均匀，分成平行份共10份，每份100mL,分别取与上述实施例4-1、4-2、4-3、4-4、对比例4-1、4-2、4-3、4-4、4-5制备的固体微生物菌剂II各20g，各自分别与1份上述孢子悬液混合均匀制得混合液，以无菌水与孢子悬液混合均匀作为对照液CK。在草莓苗移栽5d后，采取灌注法，接种上述混合液和对照液CK，每个处理对应3盆草莓苗，每盆接种100mL。后期正常管理，接种1个月后挖取植株，统计发病程度，计算病情指数，防治效果，处理结果见表9。
表9
Figure BDA0002565208380000152
Figure BDA0002565208380000161
注：1、发病率＝(发病株数/总株数)×100％；2、病情指数＝∑【(各病级株数×代表级值)/(总株数×发病最高级的代表级值)】×100；3、防治效果＝【(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数】×100％；4、病害分级标准：0级，根部健康；Ⅰ级，1/5以下侧根腐烂；Ⅱ级，1/5至1/3侧根腐烂；Ⅲ级，1/3至2/3侧根腐烂；Ⅳ级，2/3以上侧根腐烂甚至整株死亡
从表9中可以看出，在实验室草莓盆栽实验中，实施例4-1对草莓根腐病的防治效果最好，葡萄糖、豆粕、黄腐酸钾与2501固体微生物菌剂I混合使用产生了一定的协同作用，对尖刀镰孢菌的防治效果显著。
效果例4-3
分别称取土样1500g同实施例4-1、4-2、4-3、4-4和对比例4-1、4-2、4-3、4-3、4-4、4-5制备的微生物菌剂5g混合均匀，以未与菌剂混合的处理作为对照，每个处理重复3次，每个重复接入10头2龄蛴螬幼虫，在25±1℃、相对湿度60％～80％试验条件下饲养观察。处理后72h调查蛴螬死亡情况。判断死亡标准为虫体明显收缩或针刺不能正常爬动，处理结果见表10。
表10
处理 蛴螬死亡率％
实施例4-1 80
实施例4-2 60
实施例4-3 50
实施例4-4 50
对比例4-1 48
对比例4-2 40
对比例4-3 40
对比例4-4 50
对比例4-5 10
无菌水 10
由表10可知，实施例4-1制成的固体微生物菌剂对蛴螬的致死率最高。
应用例1
利用实施例4-1制备2501固体微生物菌剂II对草莓红中柱根腐病的防治，包括如下步骤：
使用地点：临沂兰山区汪沟镇草莓种植区。
选择发生草莓红中柱根腐病严重的地块，利用微生物菌剂不同稀释浓度对发生红中柱根腐病的草莓进行灌根，查看草莓根腐病的防治情况，实验共设六个处理：微生物菌剂50倍液、微生物菌剂100倍液、微生物菌剂200倍液、微生物菌剂300倍液、微生物菌剂500倍液及无菌水对照；每处理重复3次，随机区组排列。
使用时期：移栽苗时使用一次，使用量200mL/株，然后间隔12天使用一次，使用量200mL/ 株，之后再间隔15天使用一次，使用300mL/株，整个生长季共计使用3次，各处理灌根用量一致。
调查与统计：三次菌剂使用完成后15d，调查各处理组的发病植株与健康植株的数量及根部的发病程度，结果见表11。
表11
处理 发病率％ 病情指数 防治效果％
微生物菌剂50倍液 12.72±0.25a 12.05±0.5a 87.56±1.87a
微生物菌剂100倍液 16.22±0.4b 14.87±0.75b 81.17±1.56b
微生物菌剂200倍液 28.37±0.51c 24.49±0.7c 71.22±1.33c
微生物菌剂300倍液 34.16±1.12c 29.69±1.2c 67.25±1.59c
微生物菌剂500倍液 56.8±1.05d 46.15±1.25d 43.54±1.37d
CK无菌水 94.55±0.8e 77.98±1.05e ---
注：1、发病率＝(发病株数/总株数)×100％；2、病情指数＝∑【(各病级株数×代表级值)/(总株数×发病最高级的代表级值)】×100；3、防治效果＝【(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数】×100％；4、病害分级标准：0级，根部健康；Ⅰ级，1/5以下侧根腐烂；Ⅱ级，1/5至1/3侧根腐烂；Ⅲ级，1/3至2/3侧根腐烂；Ⅳ级，2/3以上侧根腐烂甚至整株死亡
由表11可以看出，使用2501固体微生物菌剂II灌根后，对草莓红中柱根腐病具有不同的防治效果，发病率和病情指数随着稀释倍数的增大而增加，防治效果随稀释倍数的增加而降低；其中无菌水对照发病率高达94％以上，使用300倍液以下效果显著，特别是100倍液以下，可基本控制病害不发生，而稀释500倍以上防治效果低于50％。
应用例2
利用实施例4-1制备2501固体微生物菌剂II对向日葵菌核病的防治，包括如下步骤：
使用地点：内蒙古包头市萨拉旗向日葵田
选择发生向日葵菌核病严重的地块，利用微生物菌剂稀释一定倍数于向日葵灌根处理，分三次使用，苗期200mL/株，间隔15d，第二次使用，使用量300mL/株，再间隔20d，第三次使用，使用量500mL/株；实验共设五个处理，微生物菌剂50倍液、微生物菌剂100倍液、微生物菌剂200倍液、微生物菌剂500倍液及无菌水对照，每处理重复三次，随机区组排列；于花期当对照出现水渍斑白色菌丝时调查各处理的发病株数，并计算发病率和防治效果，结果见表12。
表12微生物菌剂不同使用量对向日葵的防治效果
处理 发病率％ 防治效果％
微生物菌剂50倍液 8.37±0.25a 79.22±1.87a
微生物菌剂100倍液 14.15±0.4b 71.17±1.56b
微生物菌剂200倍液 38.80±1.05c 49.66±1.33c
微生物菌剂500倍液 61.23±1.05d 25.57±1.37d
CK无菌水 94.55±0.8e —
注：1、发病率＝(发病株数/总株数)×100％；2、防治效果＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100％；
a:差异不显著；b:差异显著
由表12可以看出，使用2501固体微生物菌剂灌根后，对向日葵菌核病具有不同的防治效果，发病率和病情指数随着稀释倍数的增大而增加，防治效果随稀释倍数的增加而降低。其中无菌水对照发病率高达94％以上，使用100倍液以下效果显著，使用200倍以上稀释液时，防治效果不佳，在50％以下。
应用例3
利用实施例3-1制备的2501液体微生物菌剂Ⅱ对苹果小卷叶蛾的防治，包括如下步骤：
使用地点：山东蓬莱大辛店镇三村苹果园
本次试验共设六个处理：微生物菌剂50倍液、微生物菌剂100倍液、微生物菌剂200倍液、微生物菌剂300倍液、微生物菌剂500倍液及无菌水对照；每处理重复4次，共24个小区，随机区组排列，每个小区4株果树。越冬代幼虫发生初盛期(4月中旬)进行，田间喷药2次，第1次药后10d进行第2次全树喷雾，使树冠内全部均匀着药，平均每株用药量4L。
调查与统计：施用前调查虫口基数，每处理随机选择2株，按每株东、西、南、北、中五个方位各标记一个枝条，所标记的枝条大小尽量一致。施药后5d、10d、14d分别调查每个标记株的活虫数，结果见表13
表13
Figure BDA0002565208380000181
Figure BDA0002565208380000191
注：1、虫口减退率(％)＝(施药前活虫数-施药后活虫数)/施药前活虫数×100
5、防治效果(％)＝(药剂处理区虫口减退率-空白对照区虫口减退率)/(100-空白对照区虫口减退率)x 100
a:差异不显著；b:差异显著
由表13，2501液体微生物菌剂Ⅱ对苹果卷小夜蛾的防治效果可知：将微生物菌剂稀释到 50、100、200倍施用，其对苹果卷小夜蛾的防治效果差异不显著，使用效果显著。稀释到500 倍以上，杀虫效果比较差，防效在50％以下，建议稀释200倍以下使用。
应用例4
利用实施例3-1制备的2501液体微生物菌剂Ⅱ对小麦管蓟马的防治，包括如下步骤：
使用地点：山东章丘区高官寨镇小麦田
本次试验共设六个处理：微生物菌剂50倍液、微生物菌剂100倍液、微生物菌剂200倍液、微生物菌剂300倍液、微生物菌剂500倍液及无菌水对照；每处理重复3次，共18个小区，随机区组排列，每个小区面积为20m2。小麦孕穗期进行茎叶喷雾处理，每个小区900ml。
调查与统计：施用前调查虫口基数，每个小区5点取样，每点固定10株做好标记，调查并记录株(穗)上的蓟马头数。施药后12h、24h、48h分别调查标记株的活虫数，处理结果见表14。
表14
Figure BDA0002565208380000192
Figure BDA0002565208380000201
注：1、虫口减退率(％)＝(施药前活虫数-施药后活虫数)/施药前活虫数×100
2、防治效果(％)＝(药剂处理区虫口减退率-空白对照区虫口减退率)/(100一空白对照区虫口减退率)×100
a:差异不显著；b:差异显著
由表14可得，2501制备的微生物菌剂Ⅱ对小麦麦管蓟马的防治效果可知：将微生物菌剂稀释到50、100、200、300倍施用，其对小麦麦管蓟马的防治效果差异不显著，使用效果最好。稀释到500倍以上，杀虫效果比较差，防效在45％以下，建议稀释300倍以下使用。
以植物病原真菌(尖刀镰孢菌、疫霉菌、核盘菌)、苹果小卷夜蛾和麦管蓟马为靶标，筛得既具有杀菌功能又具有杀虫功能的微生物菌株绿针假单胞菌橙黄亚种，填补了目前已发现的绿针假单胞菌只具有单一生防功能的空白，并且通过大田应用实验取得了很好的效果。本发明涉及的含绿针假单胞菌橙黄亚种的微生物菌剂，与常规菌剂及化学农药相比，本发明具有以下优点：经过实际测试，本发明对植物病原真菌(尖刀镰孢菌、疫霉菌、核盘菌)、苹果小卷夜蛾和麦管蓟马、蛴螬具有显著的防治效果，与目前已发现的常规菌剂相比，可提高防治效果；杀菌谱、杀虫谱广，一剂多用，可替代部分常规菌剂，减少工作量，降低成本；高效环保，也能减少化学农药的使用，降低抗药性的发生，有利于环境保护和综合治理，对农业生产具有重要意义。

Claims (10)

1.一种绿针假单胞菌橙黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）2501，于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO. 19900。
2.权利要求1所述绿针假单胞菌橙黄亚种2501的发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将绿针假单胞菌橙黄亚种2501在固体培养基上活化，培养温度为30±0.5℃，培养时间为48h，制得活化的菌种；
（2）将步骤（1）活化的菌种接种于一级液体种子培养基中，培养温度30±0.5℃，转速180-200rpm，培养时间20-24h，制得一级种子液；
（3）将步骤（2）制备的一级种子液接种于二级种子液体培养基中，接种量按体积分数计为3-5‰，培养温度为30±0.5℃，培养时间为12-15h，转速为200-250rpm，通气量为1.0-1.2vvm，制得二级种子液；
（4）将步骤（3）制备的二级种子液接种于三级种子液体培养基中，接种量按体积分数计为5-10%，培养温度为30±0.5℃，培养时间为6-9h，转速为150-200rpm，通气量为1.0-1.2vvm，制得三级种子液；
（5）将步骤（4）制备的三级种子液，接种于液体发酵培养基，接种量按体积分数计为
5-10%；培养温度为30±0.5℃，培养时间为28-32h，转速为100-150rpm，通气量为0.8-1.2vvm，制得液体发酵物，即为绿针假单胞菌橙黄亚种2501液体微生物菌剂I；
（6）将步骤（5）制得的发酵液进行干燥制得固体发酵物，绿针假单胞菌橙黄亚种2501
固体微生物菌剂I。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）的固体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂18-20g/L，余量水，pH值7.0-7.2；
步骤（2）中一级液体种子培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，余量水，pH值7.0-7.2；
步骤（2）中的转速为190-200rpm，培养时间为22-24h。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的二级种子液体培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖5g/L，余量水，pH值7.0-7.2；
步骤（3）中的接种量按体积分数计为3.5-5‰，培养温度为30±0.5℃，培养时间为14-15h，转速为220-250rpm，通气量为1.1-1.2vvm。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中的三级种子液体培养基的组分按质量分数计如下：胰豆粕0.2%，玉米粉1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.1%、硫酸铵0.1%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，余量水，pH值7.2-7.5；
步骤（4）中的接种量按体积分数计为6-10%，培养温度为30±0.5℃，培养时间为7-9h，转速为160-200rpm，通气量为1.1-1.2vvm。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中的接种量体积分数计为6-10%，培养温度为30±0.5℃，培养时间为29-32h，转速为130-150rpm，通气量为1.0-1.2vvm；
步骤（5）中液体发酵培养基的组分如下：豆粕1%，玉米粉3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.2%、硫酸铵0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%,余量水，pH值7.2-7.5。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）制得发酵液的有效活菌数在3.5×1010cfu/mL以上。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中固体微生物菌剂的有效活菌数在2×1011cfu/g以上；
步骤（6）中的干燥方法为喷雾干燥法。
9.权利要求1所述绿针假单胞菌橙黄亚种2501和/或所述绿针假单胞菌橙黄亚种2501的发酵物在农作物真菌病害、农作物卷蛾科虫害、农作物管蓟马科虫害、农作物金龟总科虫害防治中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述绿针假单胞菌橙黄亚种2501和/或绿针假单胞菌橙黄亚种2501的发酵物在农作物真菌病害、农作物卷蛾科虫害、农作物管蓟马科虫害、农作物金龟总科虫害防治时，用水稀释至有效活菌数为1×108cfu/(mL/g)以上。
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