CN102919275A - 一种桔黄假单胞菌微生物农药及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桔黄假单细胞菌微生物农药及其制备方法，以硅藻土为载体，将桔黄假单细胞菌JD37菌株经培养获得菌体，加入助剂羧甲基纤维素溶液，与经处理的硅藻土混合均匀，得桔黄假单细胞菌微生物农药。该活体微生物农药制备方法简单，保水性强，为菌体的生存提供了必要的营养物质，从而增加了菌体的存活率和存活期。同时能够增强植株对病原真菌的防御能力，降低其发病率。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药领域，具体涉及一种桔黄假单胞菌微生物农药及其制备方法。
背景技术
目前，农业上对植物病虫害的防治方法主要是化学防治方法，化学防治容易引起抗药性产生；大量使用时会造成农药残留物超标，危害人类及其他生物的生存，引起环境污染，破坏生态平衡。而生物防治方法则可以有效避免这些危害。
生物农药是指用来防治农林牧业有害生物的生物活体及其代谢产物和转基因产物，一般分为生物体农药和生物化学农药两大类，其中生物体农药又分为动物体农药、植物体农药和微生物体农药；生物化学农药又分为动物源生物化学农药、植物源生物化学农药和微生物源生物化学农药等。
本实验室自行筛选的一株桔黄假单胞菌JD37（菌种保藏号CGMCCNo.1.10967）对多种植物病菌都具有较强的抑制作用，根据JD37菌株生长所需的温度、pH等条件，选取硅藻土作为载体，羧甲基纤维素作为助剂，通过载体结合法研制活体微生物农药。该菌剂中有效菌体释放率较高，贮藏期内菌剂中活菌数保持在较高水平（＞108cfu/mL），且生防效果较为理想，对今后降低化学农药的使用以及生物菌剂的大规模生产和应用等方面奠定的良好的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种延长菌体存活期，生防作用良好的微生物农药，同时提供其制备方法，以解决目前活体微生物农药菌体释放率不高、贮藏期短的问题。
本发明采取的技术方案如下：
上述桔黄假单细胞菌微生物农药的制备方法如下：
（1）将硅藻土在1.0-1.2×105Pa,120-130℃下灭菌两次，每次时间30-35min，烘干备用；硅藻土具有以下特点：质量轻；成微粒状，具有较大表面积；表面密集多孔，具有良好的吸附能力；亲水性强，具有良好的保湿效果，这些特点有利于增加菌体的吸附量并且延长保质期；
（2）将桔黄假单细胞菌JD37菌株接种如液体KB培养基中，在28℃下培养24h，得发酵液；取上述发酵液接种于新鲜液体KB培养基中，在28℃下培养24h，得菌体悬液；在无菌条件下将菌体悬液离心去除上清液，得菌体，每升菌体悬液所得菌体用3-5mL新鲜KB液体培养基吹打使之充分悬浮；离心后用少量的新鲜KB培养基重新悬浮菌体，为菌体的正常生存提供了营养物质，菌体的存活率和存活期也随之提高；
（3）加入质量分数1%的羧甲基纤维素溶液，混匀后得悬浮液，将悬浮液与经步骤（1）处理的硅藻土混合均匀，室温过夜，得桔黄假单细胞菌微生物农药。所得农药转入塑封袋中室温下贮藏。
步骤（2）中发酵液与液体KB培养基的体积比为1:100。经过多次重复实验，JD37以1%的接种量进行扩大培养至对数期（28℃，24h）后，其菌体数量以及抑菌能力均达到最大值，此时收集的菌体存活能力强且生防效果最佳。
步骤（3）中加入的羧甲基纤维素溶液与步骤（2）中用于悬浮所得菌体的新鲜KB培养基体积比为1:1。
根据载体硅藻土的饱和吸水量以及菌体存活率，步骤（3）中硅藻土与悬浮液的混合比例为500-700g/L。
本发明所得到的桔黄假单胞菌活体微生物农药，制作方法简单，成本低，以硅藻土为载体加入羧甲基纤维素助剂后对菌体的吸附率高，同时菌体的存活率和保存期以及应用过程中菌体的释放率较高。且研究证实，该菌株不仅能够有效控制病害，同时对植物还具有促生能力。
具体实施方式
实施例1
以硅藻土为载体制备微生物农药
（1）将选定的载体材料（硅藻土）进行高压（1.034×105Pa）灭菌两次（121℃，30min），烘干备用。
（2）液体KB培养基：蛋白胨20g、K2HPO41.5g、MgSO4·7H2O1.5g、甘油10mL、去离子水1L。（121℃，30min）
（3）挑取单菌落至100mL液体KB培养基中，28℃、200rpm培养24h后，按1%接种量取10mL发酵液于1000mL新鲜液体KB培养基中，培养至对数期（28℃，200rpm，24h），在无菌条件下，将菌体悬液在8000rpm下离心15min，去除上清液，用5mLKB液体培养基轻轻吹打使之充分悬浮。
（4）加入5mL1%羧甲基纤维素溶液，混匀后按比例与载体材料混合（600g硅藻土吸附100mL菌悬液），用无菌玻璃棒搅拌均匀或用震荡器震荡均匀，室温过夜，转入无菌塑封袋中室温下贮藏。
实施例2
以滑石粉为载体制备微生物农药
（1）将选定的载体材料（滑石粉）进行高压（1.034×105Pa）灭菌两次（121℃，30min），烘干备用。
（2）液体KB培养基：蛋白胨20g、K2HPO41.5g、MgSO4·7H2O1.5g、甘油10mL、去离子水1L。（121℃，30min）
（3）挑取单菌落至100mL液体KB培养基中，28℃、200rpm培养24h后，按1%接种量取10mL发酵液于1000mL新鲜液体KB培养基中，培养至对数期（28℃，200rpm，24h），在无菌条件下，将菌体悬液在8000rpm下离心15min，去除上清液，用5mLKB液体培养基轻轻吹打使之充分悬浮。
（4）加入5mL1%羧甲基纤维素溶液，混匀后按比例与载体材料混合（600g滑石粉吸附100mL菌悬液），用无菌玻璃棒搅拌均匀或用震荡器震荡均匀，室温过夜，转入无菌塑封袋中室温下贮藏。
实施例3
以蛭石为载体制备微生物农药
（1）将选定的载体材料（蛭石）进行高压（1.034×105Pa）灭菌两次（121℃，30min），烘干备用。
（2）液体KB培养基：蛋白胨20g、K2HPO41.5g、MgSO4·7H2O1.5g、甘油10mL、去离子水1L。（121℃，30min）
（3）挑取单菌落至100mL液体KB培养基中，28℃、200rpm培养24h后，按1%接种量取10mL发酵液于1000mL新鲜液体KB培养基中，培养至对数期（28℃，200rpm，24h），在无菌条件下，将菌体悬液在8000rpm下离心15min，去除上清液，用5mLKB液体培养基轻轻吹打使之充分悬浮。
（4）加入5mL1%羧甲基纤维素溶液，混匀后按比例与载体材料混合（600g蛭石吸附100mL菌悬液），用无菌玻璃棒搅拌均匀或用震荡器震荡均匀，室温过夜，转入无菌塑封袋中室温下贮藏。
实施例4实施例1、2、3有效活菌数检测
（1）在无菌条件下，分别称取以上三种微生物农药10g，加入装有100mL无菌水的锥形瓶中，放入摇床（200rpm）摇匀40-60min。
（2）梯度稀释后，取0.1mL在涂平板（含氨苄青霉100μg/mL，氯霉素50μg/mL），三次重复。28℃，培养1-2d后计数。
结果如下：
表1不同载体微生物农药有效活菌数检测结果
| 编号 | 原始 | 2个月 | 4个月 | 6个月 | 8个月 |
| 1 | 5.30×1011 | 1.60×1011 | 5.10×1010 | 1.10×1010 | 2.10×109 |
| 2 | 6.75×1011 | 2.85×1011 | 3.65×1010 | 3.15×109 | 6.20×108 |
| 3 | 4.12×1011 | 7.20×1010 | 4.56×109 | 2.16×107 | 6.45×106 |
备注：1:硅藻土 2：滑石粉 3：蛭石 单位：cfu/mL
由表1可见，以滑石粉为载体的微生物农药原始吸附率最高，以蛭石为载体的微生物农药有效活菌数下降最快，6个月后低于108cfu/mL,6个月后，以硅藻土为载体的微生物农药中有效活菌数最高。
实施例5
对油菜菌核病抑制效果检测
在温室条件下，播种油菜种子，每盆一株，待其长到四叶期时，进行JD37微生物农药的温室内生防实验。
供试菌株：油菜菌核病，由国家南方农药创制中心（上海）提供
实验组：
称取适量实施例1所制备的菌剂溶于水中（比例：1g/L），溶液中菌体浓度约107-108cfu/mL，均匀喷洒于油菜叶片上。
接种油菜菌核病菌，用打孔器在培养3-5d的油菜菌核病平板上取菌饼接种于油菜叶片上，用保鲜膜包裹接种菌饼的叶片，
对照组：
用无菌水均匀涂抹于叶片上，接种油菜菌核病后用保鲜膜包裹叶片。
两组实验各三次重复，3-5d后记录叶片感染率。
实验结果显示，实验组和对照组菌核病的感染率分别为21.4%，58.65%，实验组经微生物农药处理的油菜对菌核病具有明显的防御作用。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (5)
1.一种桔黄假单细胞菌微生物农药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将硅藻土在1.0-1.2×105Pa,120-130℃下灭菌两次，每次时间30-35min，烘干备用；
（2）将桔黄假单细胞菌JD37菌株接种如液体KB培养基中，在28℃下培养24h，得发酵液；取上述发酵液接种于新鲜液体KB培养基中，在28℃下培养24h，得菌体悬液；在无菌条件下将菌体悬液离心去除上清液，得菌体，每升菌体悬液所得菌体用3-5mL新鲜KB液体培养基吹打使之充分悬浮；
（3）加入质量分数1%的羧甲基纤维素溶液，混匀后得悬浮液，将悬浮液与经步骤（1）处理的硅藻土混合均匀，室温过夜，得桔黄假单细胞菌微生物农药。
2.权利要求1所述的桔黄假单细胞菌微生物农药的制备方法，其特征在于，步骤（2）中发酵液与液体KB培养基的体积比为1:100。
3.权利要求1所述的桔黄假单细胞菌微生物农药的制备方法，其特征在于，步骤（3）中加入的羧甲基纤维素溶液与步骤（2）中用于悬浮所得菌体的新鲜KB培养基体积比为1:1。
4.权利要求1所述的桔黄假单细胞菌微生物农药的制备方法，其特征在于，步骤（3）中硅藻土与悬浮液的混合比例为500-700g/L。
5.一种桔黄假单细胞菌微生物农药，其特征在于，根据权利要求1-4任意一项所述的方法制备。
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2012
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