CN102965314B - 一株枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用，主要涉及一株枯草芽孢杆菌菌株Y-1（Bacillus subtilis Y-1），保藏编号为CGMCC No.6539；还涉及了利用该枯草芽孢杆菌制备的菌剂及其和应用；本发明涉及的Y-1菌株能够在苹果树、杨树、黄瓜、辣椒根际及苹果树体内定殖，对镰刀菌、立枯丝核菌、轮斑病菌、疫霉等具有高效、广谱抑菌活性，其菌剂可用于防治由上述病原真菌引起的病害及苹果树、杨树、黄瓜、辣椒连作障碍；菌剂的制备方法工艺简单、发酵周期短、成本低，利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用，属于农用微生物领域。
背景技术
化学农药在防治或减轻病虫害造成的危害、保护农业生产方面起到了重大作用。但是化学农药的毒性较高，结构稳定，难以降解，大量使用后在作物中残留，动物食用后富集，并且会渗透到土壤、河流或地下水中，造成环境污染，影响人类健康。而且，由于长期使用某些化学农药，造成了害虫和病菌的抗药性。为控制化学污染，保护环境，目前世界各国均把发展生态农业，减少化学农药使用、研究和开发生物农药，作为植物病虫害防治的主要发展方向。生物防治以其无污染、无生态毒性和安全性好等优点在病虫害综合防治体系中普遍被人们所接受和高度重视，其中微生物农药又在生防体系中起到主导作用。目前全世界生物农药产品已经超过100多种，其中90%以上是微生物杀虫剂，微生物杀菌剂相对较少。
苹果树连作障碍广泛分布于世界各地的苹果产区，是一种复杂的综合病症，造成的经济损失严重。生物因素是造成连作障碍的主要原因，由于单一植物的连续种植，形成了特殊的土壤环境，为病原菌和致病线虫等根系病虫害提供了赖以生存的寄主和繁殖场所，病原菌可利用寄主植株的根系分泌物和植株组织及其分解物作为养分来源，大量繁殖，成为优势菌群。同时，大多土壤病原菌在缺乏寄主的条件下会寄生在残体或土壤中形成耐久性的生存器官，一旦寄主出现，便重新侵染寄主从而造成危害。通过生物调控进行连作障碍的防治日益受到重视，从自然环境中筛选得到能够有效抑制果树病原菌生长的微生物来防治连作障碍是当前该领域研究的一大热点。
作为一种生防细菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）因其分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、储存期长和使用方便等特点正受到人们广泛关注。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其菌剂的制备和应用，可用于防治苹果树根腐病、立枯病和轮斑病以及苹果树、杨树、黄瓜、辣椒的连作障碍。
一株枯草芽孢杆菌菌株Y-1（Bacillus subtilis Y-1），分离自山东省泰安市泰山苹果园的苹果树中，已于2012年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6539。
利用上述枯草芽孢杆菌Y-1生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌Y-1芽孢及其胞外代谢产物。所述的微生物菌剂为液体菌剂或固体粉剂。
枯草芽孢杆菌Y-1微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）菌种活化：将低温保存的Y-1菌株接种于LB固体培养基上，并在30℃下培养20-24h；然后挑取单菌落接种于LB固体斜面培养基上，并在30℃下培养20-24h，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液。
（2）种子液的制备：按照0.05%-0.5%比例（体积百分比）向LB液体培养基中接入步骤1）制备的接种液，在30℃下震荡培养12-16h，得种子液。
（3）发酵培养：将步骤2）所得种子液与发酵培养基按照1%-2%比例（体积百分比）接入含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，得到Y-1菌株的液体菌剂。
其中所述的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖0.5%，玉米粉2%，黄豆饼粉0.5%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.15%，碳酸钙0.15%，余者为水。
所述发酵罐发酵条件为：培养温度为28-32℃，通气量为1:0.5-1:1.6，搅拌速度为200-400r/m，培养时间为28-36h；所述通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比值。
其中，所述培养温度优选为28-30℃，通气量优选为1:1-1:1.2，搅拌速度优选为250-300r/m，培养时间优选为32h。
发酵时可加入植物油作为消泡剂。
所述植物油与培养基的质量体积百分比为1%-2%。
所述的菌剂为液体菌剂，离心后添加适量的基质混合即得固体粉剂。
所述微生物菌剂中枯草芽孢杆菌Y-1的芽孢数为2.74×1010cfu/mL。
上述枯草芽孢杆菌对尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、腐皮镰刀菌、层出镰刀菌、立枯丝核菌、链格孢、杨树腐烂病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉具有抑制作用，对9种病原菌的抑菌率在42.34%-64.90%之间，表现出较好的广谱抑菌活性。
本发明还提供了一种微生物菌剂在防治苹果树根腐病及连作障碍上的应用。
上述枯草芽孢杆菌菌株Y-1可应用于防治苹果树根腐病、立枯病和轮斑病和苹果树、杨树、黄瓜及辣椒的连作障碍。
本发明具有以下优点：
1.枯草芽孢杆菌Y-1具有较好的广谱抑菌活性抗，对苹果树根部常见的病原真菌（立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌）、苹果树叶部病原真菌（苹果链格孢）、杨树腐烂病菌、黄瓜枯萎病菌及辣椒疫霉等均有较好的抑制效果，
2.该枯草芽孢杆菌无污染，无生态毒性，安全性好。
3.该枯草芽孢杆菌发酵性状优良，且传代抑菌性状稳定。
4.该种制备方法的发酵工艺简单，发酵周期短，成本低，利于工业化生产。
附图说明
图1为根据16S rDNA序列利用Mega 4.0分析获得的Y-1菌株到的系统进化树结果。
图2为Y-1菌株对多种病原菌到的抑制作用。其中：A为尖孢镰刀菌；B为串珠镰刀菌；C为层出镰刀菌；D为腐皮镰刀菌；E为立枯丝核菌；F为苹果链格孢菌。
具体实施方式：
实施例一
1、Y-1菌株的分离
Y-1菌株是通过对泰安市苹果树中多种细菌的分离、筛选对峙等一系列试验得到的。其具体分离方法为：将采集的苹果树样品用无菌水冲洗干净，然后分别用75%的酒精和5%次氯酸钠浸泡3min，再用无菌水冲洗3-5次；然后将样品研碎，加入90ml无菌水，置于三角瓶中在25°C下180r/m振荡培养2h；将培养液进行梯度稀释，涂布于LB平板。每处理重复3次，28°C培养3-5d，选取不同形态的单菌落反复平板划线纯化，再对尖孢镰刀菌与纯化后的单菌落进行对峙试验，经多次重复试验，获得一株对尖孢镰刀菌具有显著抑制作用的细菌，命名为Y-1。
该菌株菌种的保存方法：短期保存采用LB平板培养基保存菌种，长期保存采用甘油管保存菌种。
2、Y-1菌株的鉴定
（1）菌体形态特征
Y-1菌株在LB培养基上生长12h后菌落为圆形，边缘整齐，脓状，白色不透明，菌落隆起。随着培养时间增长，菌落边缘不整齐，有皱褶状凸起，变为淡黄色。菌体为杆状，具鞭毛，孢子囊无明显膨胀。
（2）生理生化特征
Y-1菌株的生理生化特征见表1。
表1Y-1菌株的生理生化特征
| 特征 | 结果 |
| 革兰氏反应 | + |
| 需氧性 | + |
| 运动性 | + |
| 接触酶反应 | + |
| 硝酸盐还原反应 | + |
| 淀粉水解试验 | + |
| V-P测定 | + |
| 耐盐性 | 0-5.0% |
| 明胶液化试验 | + |
| 柠檬酸盐利用试验 | + |
| 苯丙氨酸脱氨酶试验 | - |
注:＋:阳性反应;－:阴性反应
（3）16S rDNA序列分析
Y-1菌株的16S rDNA序列长度为1461bp，具体序列如下：
GAGGTTTCGGAGTCTATACGTGCGAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTCATGAGCCAGCCGCCGAAGGGACGAAGATCCTTCCC
将此序列与GenBank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，选取10株与Y-1菌株序列相似性高的菌株进行系统发育分析，利用Mega4.0软件采取Neighbor-Joining法构建以16S rDNA全序列为基础的系统进化树(见图1)。Y-1菌株的16S rDNA序列同公开发表的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性较高，达到99%，结合其形态和生理生化特征指标，将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例二
（1）枯草芽孢杆菌Y-1双抗生素突变菌株的筛选
首先将Y-1菌株接种于利福平浓度为0.5μg/mL的LB平板上，待肉眼看到菌落明显生长后，转接到利福平浓度为1μg/mL的LB平板上，待其菌落明显生长后，依次转接入利福平浓度为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、300μg/mL的LB平板上。得到具有利福平抗性的Y-1突变株。
在含有利福平300μg/mL的LB平板上以上述相同的方法筛选出耐卡那霉素300μg/mL的Y-1突变株。
（2）枯草芽孢杆菌Y-1的定殖
将上述试验中得到的Y-1双抗生素突变菌株接种至含利福平和卡那霉素300μg/mL的LB液体培养基中，30℃，200r/m振荡培养24h，试验组取20mL发酵液分别加入到栽有苹果幼苗、杨树幼苗、黄瓜幼苗、辣椒幼苗的盆中，以添加20mL无菌水的处理为对照。60天后取对照组及试验组的苹果、杨树、黄瓜、辣椒根际土壤及苹果幼苗进行菌株回收试验，检测Y-1菌株在根际土壤及苹果幼苗中的定殖情况。同时检测根际土壤中真菌数量的变化。试验结果见表2和表3。试验结果表明枯草芽孢杆菌Y-1能够在苹果、杨树、黄瓜、辣椒根际土壤及苹果幼苗体内定殖，并使其根际土壤中真菌的数量降低。说明枯草芽孢杆菌Y-1对苹果树根腐病、立枯病和轮斑病有明显抑制作用，可有效克服苹果树、杨树、黄瓜和辣椒连作障碍。
表2 Y-1菌株在根际土壤及苹果幼苗中的定殖
表3 根际土壤中真菌数量的变化
实施例三
选取葡萄糖为速效碳源，玉米粉、黄豆饼粉为缓效碳氮源，硫酸铵、磷酸二氢钾和碳酸钙三种无机盐，进行正交试验设计，试验因素与水平的设置见表4，各培养基的配方见表5，对枯草芽孢杆菌Y-1的最佳产芽孢发酵培养基进行优化。
表4 试验因素与水平设置
表5 18种发酵培养基的配方
用接种环挑取枯草芽孢杆菌Y-1菌落，接种到含50ml LB培养基的250ml三角瓶中，30℃，200r/m培养10h后得其种子液，然后将种子液以2%的接种量接种到上述18种培养基中，30℃，200r/m摇床振荡培养。发酵28h、32h、36h和40h后，对发酵液进行80℃，15min处理后系列梯度稀释，即吸取1ml处理后的发酵液加入9ml的无菌水中，为10-1梯度，混匀后吸取1ml 10-1梯度中的液体加入9ml无菌水中，为10-2梯度，依次稀释获得10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，然后选择10-5、10-6、10-7梯度进行涂布平板，30℃条件下培养1-2d，进行计数，计算发酵液中的芽孢数。结果发现当发酵培养基为：葡萄糖5.0g，玉米粉20.0g，黄豆饼粉5.0g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾1.5g，碳酸钙1.5g，水1000mL，培养32h时，菌落数最多，该培养基即为枯草芽孢杆菌Y-1的最佳产芽孢发酵培养基。
实施例四
枯草芽孢杆菌Y-1对多种病原菌的抑制作用见图2，抑制效果采用抑菌率法测定，即将枯草芽孢杆菌发酵上清液按照1:10(v:v)的比例加入LB培养基中制成平板，分别将活化的尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、层出镰刀菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌、链格孢菌、杨树腐烂病菌、黄瓜枯萎病菌及辣椒疫霉用打孔器打成直径5mm的菌块，放于培养基中央，4d后观察菌落直径大小，以无菌水为对照，按如下公式计算抑菌率。抑菌率=(对照平板菌落直径-试验平板菌落直径)/对照平板菌落直径×100%。试验结果见表6，枯草芽孢杆菌Y-1对供试的9种病原真菌的的抑菌率在42.34%-64.90%之间，对尖孢镰刀菌的抑菌率达到64.90%，对链格孢菌的抑菌率最低，为42.34%。说明枯草芽孢杆菌Y-1具有较好的广谱抑菌活性。
表6 Y-1菌株对多种病原真菌的抑菌率
实施例五
该微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：
（1）菌种活化：将低温保存的Y-1菌株接种于LB固体培养基上，并在30℃下培养20-24h；然后挑取单菌落接种于LB固体斜面培养基上，并在30℃下培养20-24h，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液。
（2）种子液的制备：按照0.05%-0.5%比例（体积百分比）向LB液体培养基中接入步骤（1）制备的接种液，在30℃下震荡培养12-16h，得种子液。
（3）发酵培养：将步骤（2）所得种子液按照1-10%比例（体积百分比）接入含有发酵培养基的10L发酵罐中进行发酵，得到菌株Y-1的菌剂。
其中所述的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖0.5%，玉米粉2%，黄豆饼粉0.5%，硫酸铵0.05%，磷酸二氢钾0.15%，碳酸钙0.15%，余者为水。
所述发酵罐发酵条件中，培养温度为28-32℃，通气量为1:0.5-1:1.6，搅拌速度为200-400r/m，培养时间为28-36h；所述通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比值。
其中，所述培养温度优选为28-30℃，通气量优选为1:1-1:1.2，搅拌速度优选为250-300r/m，培养时间优选为32h。
其中所述的菌剂为液体菌剂，经离心后添加适量的基质混合即得固体粉剂。
步骤3）中发酵培养时可加入植物油作为消泡剂；所述植物油与发酵培养基的质量体积百分比为1%-2%。
所述微生物菌剂中枯草芽孢杆菌Y-1的芽孢数为2.74×1010cfu/mL。
实施例六
本实施例是本发明的微生物菌剂作为植物病原真菌抗菌剂在防治苹果树根腐病及连作障碍上的应用。选取健康无病的盆栽苹果树苗60株，每盆一株，分成两组，每组30盆。一组用本发明实施例四得到的微生物菌剂灌根处理，另一组为对照组。试验组将实施例三得到的微生物菌剂灌根处理苹果苗，50mL/株，三天后灌根接种尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液，孢子浓度为1×106个/mL；对照组用不接菌的发酵培养基灌根处理苹果苗，50ml/株，三天后灌根接种尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液，10mL/株，孢子浓度为1×106个/mL。60天后统计计算防病效果。根据苹果苗根部的病斑面积将病情分为五级。1级为无病斑；2级为病斑面积<5%；3级为病斑面积<5-20%；4级为病斑面积<20-50%；5级为病斑面积>50%。各级没处理的植株总数分别为A、B、C、D、E，病情指数=（0×A+1×B+2×C+3×D+4×E）/（4×A+4×B+4×C+4×D+4×E）×100；防病效果=100%—（处理组病情指数/对照组病情指数）×100%。试验结果见表7，实施例四中得到的微生物菌剂对苹果树根腐病的防治效果可达85.02%。
表7 Y-1菌株对苹果树根腐病的防治效果
| 项目 | 病情指数 | 防治效果 |
| 处理组 | 8.36 | 85.02% |
| 对照组 | 55.82 | / |
Claims (5)
1.一株保藏编号为CGMCC No.6539的枯草芽孢杆菌Y-1(Bacillus subtilis Y-1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其 16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Y-1生产的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）菌种活化：将低温保存的Y-1菌株接种于LB固体培养基上，30℃下培养20-24h；然后挑取单菌落接种于LB固体斜面培养基上，30℃下培养20-24h，再用无菌水洗涤培养基表面，取洗脱液作为接种液；
2）种子液的制备：按照体积百分比0.05%-0.5%向LB液体培养基中接入步骤1）制备的接种液，30℃震荡培养12-16h，得种子液；
3）发酵培养：将步骤2）所得种子液与发酵培养基按照体积百分比1%-2%的比例接入含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，培养温度为28-32℃，通气量为1:0.5-1:1.6，搅拌速度为200-400r/m，培养时间为28-36h；得到Y-1菌株的液体微生物菌剂；
所述的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖0.5%、玉米粉2%、黄豆饼粉0.5%、硫酸铵0.05%、磷酸二氢钾0.15%和碳酸钙0.15%，余者为水；
所述通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比值。
3.如权利要求书2所述的枯草芽孢杆菌Y-1生产的微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤3）中，培养温度为28-30℃，通气量为1:1-1:1.2，搅拌速度为250-300r/m，培养时间为32h。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Y-1在防治尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、 腐皮镰刀菌、层出镰刀菌、立枯丝核菌、链格孢菌、杨树腐烂病菌、黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病中的应用。
5.根据权利要求2制备的微生物菌剂在防治苹果树根腐病、立枯病和轮斑病以及苹果树、杨树、黄瓜和辣椒连作障碍中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140305 |