CN107384868A - 永生化原代绵羊肺细胞系的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种永生化原代绵羊肺细胞系的构建及其应用；所述构建包括以下步骤：用Dispase‑胶原酶灌流法获得高活率的新鲜原代绵羊肺成纤维细胞，经过24h培养后，在浓度为5ug/ml的聚凝胺存在下，用浓缩纯化的含有hTERT基因的重组慢病毒的细胞上清液对原代绵羊肺成纤维细胞进行感染，1周后用2ug/ml的嘌呤霉素进行药物压力筛选，在含有浓度为5ug/ml的聚凝胺存在下，重复感染一次，一周后，用1ug/ml嘌呤霉素维持液培养直至单克隆出现并生长至2.0cm左右时，挑取单克隆的细胞扩大培养，获得能够传代的永生化绵羊肺成纤维细胞。

Description

永生化原代绵羊肺细胞系的构建及其应用

技术领域

本发明涉及细胞系的构建及应用领域，具体涉及一种永生化原代绵羊肺细胞系的构 建及其应用。

背景技术

传代细胞系是开展动物病毒应用和基础研究的重要平台，然而有许多动物病毒缺乏 能支持其稳定增殖的宿主细胞系，例如小反刍兽疫病毒和兔瘟病毒，严重阻碍了这些病毒的分子生物学研究和疫苗研制工作。而某些原代细胞有限的传代次数使得研究工作进展缓慢，目前利用端粒酶成功构建的永生化细胞系有：牛甲状腺细胞系，CCTCC保藏号 为C2014109；皮肤成纤维细胞系，申请公布号为CN 101921729 A；猪源细胞永生化细 胞系，申请公布号CN 103923942 A。前两者采用的方法均为脂质体转染p CIneo-h TERT 质粒，然后经过抗性筛选获得。后者经过一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体建立的永 生化细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种永生化原代绵羊肺细胞系的构建及其应用。本发明利用 磷酸钙转染后携带端粒酶基因的重组慢病毒系统，区别于对其他永生化细胞系构建的方 法进行羊源原代细胞永生化研究，以期获得1株具有自主知识产权的动物传代细胞系，并检测它们对羊源病毒的敏感性，为将来开展相应动物病毒的分子致病机理和新型疫苗等提供良好的操作平台。

为了构建永生化原代绵羊肺细胞细胞系，本发明首先将hTERT基因编码序列插入至 慢病毒pLOV-GFP-3Flag中，构建了pLOV-hTERT重组质粒。其次，将重组质粒pLOV-hTERT与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共同转染293T细胞，获得含hTERT基因的重 组慢病毒颗粒。然后，用浓缩过的慢病毒液感染原代绵羊肺细胞，并通过嘌呤霉素筛选， 最终获得了永生化原代绵羊肺细胞系，并命名为SLT细胞系。连续培养20代后，利用 PCR，RT-PCR和Western blot方法鉴定，结果表明：成功构建了永生化原代绵羊肺细胞 系。SLT细胞系为研究羊源病毒的致病机制奠定了基础。

本发明将永生化原代绵羊肺成纤维细胞株(SLT)--Ovis aries-Lung细胞提交专利 认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CCTCC NO：C201723；分类命名为：绵羊 肺成纤维细胞株SLT。保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏时间是2017年1月 15日：保藏地址：中国武汉武汉大学。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种永生化原代绵羊肺细胞系的构建方法，以原代绵羊肺细胞作为宿主 细胞，用含hTERT基因的重组慢病毒感染宿主细胞，经过筛选、传代、鉴定，即得。

优选的，将重组质粒pLOV-hTERT与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共同转染293T细胞，获得含hTERT基因的重组慢病毒颗粒。

优选的，所述重组质粒pLOV-hTERT是通过将hTERT基因编码序列通过Infusion技术插入至慢病毒pLOV-GFP-3Flag中构建而得。

优选的，所述插入是以pCI-Neo-hTERT为质粒模板进行PCR扩增反应，PCR上游引物InFu-hTERT-BamHI序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物InFu-hTERT-XbaI序列如SEQ IDNO.2所示。

优选的，所述筛选是采用嘌呤霉素进行筛选。

优选的，嘌呤霉素筛选浓度为2ug/Ml。

优选的，所述原代绵羊肺细胞是用Dispase-胶原酶灌流法获得的高活率的新鲜原代 绵羊肺成纤维细胞。

优选的，构建得到的永生化原代绵羊肺细胞系能支持小反刍兽疫病毒增殖。

本发明还涉及一株永生化原代绵羊肺细胞系，所述细胞系为Ovis aries-Lung细胞 CCTCC NO：C201723。

本发明还涉及一种本发明的永生化原代绵羊肺细胞系在作为细胞模型研究羊源病 毒的致病机制中的用途。

优选的，所述羊源病毒的致病机制包括免疫损伤，炎症反应或组织病理损伤。

本发明的永生化原代绵羊肺细胞系能支持小反刍兽疫病毒增殖。能支持小反刍兽疫 病毒增殖的细胞系很少，更是没有一种羊源细胞系可以支持PPRV增殖的，该细胞系可以很好的支持小反刍兽医病毒-N75株的增殖。因此在研究羊源病毒诸如羊口疮等病毒提供了潜在的研究工具。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、相对于利用脂质体转染瞬时转染穿梭质粒的方法，慢病毒系统可以转染利用脂质体等转染试剂比较难转的细胞，比如原代细胞和悬浮细胞，也可以转染非分裂细胞， 另一方面慢病毒可携带的较大外源基因片段高效率的整合到细胞的基因组内，达到稳定 转染的效果，而且脂质体本身有一定的毒性，会在一定程度上影响细胞的状态。

2、本发明构建的过表达细胞系创新性地应用于原代细胞的永生化，操作难易程度， 目的，及应用方面完全与现有技术不同，诸如本发明采用了小反刍兽疫病毒N75株来进行检测其敏感性，因为PPRV-N75株缺乏可以支持其有效增殖的同源细胞系。

3、本发明采用的是慢病毒系统，其可以携带大片段外源基因，对细胞毒性小，由慢病毒介导并整合到靶细胞基因组中的靶基因不仅对转录沉默有较强的抗性，比使用脂质体瞬转穿梭质粒的方法更易于获得稳定表达目的基因的细胞系，此外，永生化的方法 很多，利用端粒酶构建的细胞系除了保留了细胞的正常的生理特性外，这些细胞具有更 快的生长速率。

4、在构建永生化细胞系的方面目前还没有人利用携带hTERT基因的慢病毒系统来进行羊源原代细胞的永生化工作。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目 的和优点将会变得更明显：

图1为重组质粒pLov-hTERT的构建及鉴定；

图2为重组慢病毒的鉴定；

图3为永生化绵羊肺细胞中hTERT基因的检测结果；其中，A为基因组水平的hTERT基因的检测结果，B为转录水平RT-PCR检测hTERT基因的检测结果，M：DL2000；对照： 原代绵羊肺细胞；

图4为Western blot分析外源基因hTERT蛋白表达；其中，A为目的蛋白hTERT 检测结果，B为内参蛋白检测结果；

图5为RT-PCR方法检测SLT细胞中PPRV-N基因；其中，M：2K plus II，1:N75-P1, 2:N75-P2，3:N75-P3，4：空白对照，5：阴性对照；

图6为Western Blot检测SLT细胞中PPRV-N蛋白；其中，A为目的蛋白检测结果， 1为阴性对照，2为N75-P3-F蛋白；B为内参蛋白β-actin检测结果，1为对照组，2 为实验组；

图7为IFA检测SLT细胞中PPRV-N蛋白；其中，A为核染结果，B为FITC结果，C 为Merge图，D为阴性对照；

图8为电镜观察PPRV病毒粒子；

图9为第十代永生化绵羊肺细胞状态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进 一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发 明的保护范围。

本发明的永生化原代绵羊肺细胞系的构建包括以下步骤：用Dispase-胶原酶灌流法 获得高活率的新鲜原代绵羊肺成纤维细胞，经过24h培养后，在浓度为5ug/ml的polybrene(聚凝胺)存在下，用浓缩纯化的含有hTERT基因的重组慢病毒的细胞上清 液对原代绵羊肺成纤维细胞进行感染，1周后用2ug/ml的puromycin(嘌呤霉素)进行 药物压力筛选，在含有浓度为5ug/ml的polybrene存在下，重复感染一次，一周后， 用1ug/mlpuromycin维持液培养直至单克隆出现并生长至2.0cm左右时，挑取单克隆 的细胞扩大培养，获得能够传代的永生化绵羊肺成纤维细胞。具体实施例如下：

实施例

本实施例涉及一种永生化原代绵羊肺细胞系的构建及其应用，具体如下：

1.材料与方法

1.1材料

1.11菌种，质粒和绵羊肺细胞

pCI-Neo-hTERT载体，重组质粒pLOV-GFP-3Flag、ps PAX2、p MD2.G等慢病毒包 装载体由本实验室保存。DH5a感受态，293T细胞，原代绵羊肺细胞本实验室保存；

1.12主要试剂与仪器

rTaq DNA聚合酶、LA Taq聚合酶、infusion连接酶,BamI,NotI等限制性内切 酶、基因组提取试剂盒和Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒均购自生物工程大连有 限公司；DMEM培养基、MEM培养基、1×PBS购于Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购 于Gibco生物公司；钙转染试剂自配(Ca Cl2和Heps试剂购自Sigma公司)；嘌呤 霉素(Puromycin)购自Sigma公司；HRP标记的山羊抗鼠Ig G购自Santa Cruz公 司；去内毒素质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；恒温摇床购于美国精骐有限公司，37℃ 恒温细胞培养箱购自于Thermoscientific公司，低温高速台式离心机、台式高速离 心机均为Eppendorf公司产品，倒置荧光显微镜购置于日本Nikon公司，DNA电泳仪、 PCR仪、凝胶成像分析系统、蛋白转印仪均为美国Bio-Rad公司产品。

1.1.4主要缓冲液及试剂的配制

(1)1M Tris-HCl(pH 6.8)、1M Tris-HCl(pH 8.0)、1.5M Tris-HCl(p H 6.8)、30％聚丙烯酰胺溶液(29:1)购自碧云天生物技术有限公司。

(2)10％过硫酸铵溶液(APS)：称取1g过硫酸铵粉末至10ml双蒸馏水中，溶 解混匀后每管200μl分装，-20℃保存。

(3)10％SDS溶液：称取1g SDS粉末至60ml双蒸馏水中60℃溶解，溶解后降 至室温用1M HCl调节PH值至7.2，然后加水定容至100ml，室温保存。

(4)SDS-PAGE电泳缓冲液：称取甘氨酸18.8g、Tris粉末3g和SDS粉末1g， 先用700ml蒸馏水溶解，然后加水定容至1L，室温保存。

(5)半干转转印缓冲液：称取甘氨酸2.9g、Tris粉末5.8g和SDS粉末0.37g 加入至600ml的蒸馏水中溶解，然后加入200ml的甲醇，最后加水定容至1L，室温保 存。

(6)TBST缓冲液：称取Na Cl 8.8g置于600ml去离子水中，然后加入20ml 1M Tris-HCl(pH 8.0)溶液，加入500μl Tween 20充分混匀，最后用去离子水定容至 1L，4℃保存。

(7)LB培养液：称取Tryptone 10g、Yeast Extract 5g、Na Cl 10g至800ml去 离子水中，充分搅拌溶解，滴加2M Na OH将pH值调节至7.0，然后加去离子水定 容至1L，高温高压灭菌后4℃保存。其他常规试剂的配制配方及方法参见《分子克隆 实验指南》。

2.研究方法

2.1慢病毒包装质粒pLov-hTERT的构建

根据hTERT基因序列设计一对引物并加上酶切位点，命名如下：上游引物 InFu-hTERT-BamHI，下游引物InFu-hTERT-XbaI，质粒模板pCI-Neo-hTERT，扩增产物 3264bp。PCR反应体系如下表1：

表1

hTERT基因PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；94℃变性1min；53℃退火30s；72℃延伸3min30s；12℃终止反应。PCR产物分别经割胶回收纯化后和pLOV-GFP-3Flag慢病毒载体利用BamH I和Xba I双酶切，再次胶回收。将胶回收产物通过In-Fusion技术进行连接。构建p LOV-hTERT 重组质粒，构建的重组质粒经酶切鉴定为阳性，然后送上海华津生物技术有限公司测序， 确定插入基因正确无误。

引物设计

利用引物设计软件设计两对引物，一对引物扩增hTERT全长基因，一对是鉴别引物， 扩增片段为214bp。

表2 SLT细胞系构建引物表

将测序正确的阳性克隆以及辅助质粒ps PAX2、p MD2.G扩大培养，采用QIAGENMaxiprep Endo-free Plasmid Kit提取高纯度无内毒素转染级质粒，主要步骤如下：

(1)取菌液200ml，6000g，4℃离心15min；

(2)加入10ml Buffer P1完全重悬菌落沉淀；

(3)加入10ml Buffer P2，轻缓颠倒4～6次彻底混匀，室温孵育5min；

(4)加入10ml Buffer P3，立即轻缓颠倒4～6次彻底混匀，冰上孵育20min；

(5)20,000g，4℃离心30min，取上清加入至10ml Buffer QBT平衡过的柱子， 通过重力作用使其自然流空；

(6)用30ml QC Buffer清洗柱子；

(7)用15ml QF Buffer洗脱DNA；

(8)加入10.5ml异丙醇立即混匀，15,000g，4℃离心30min，沉淀DNA；

(9)加入5ml 70％乙醇清洗DNA沉淀，15,000g离心10min；

(10)空气干燥DNA沉淀，用适当体积的TE溶液溶解DNA，并测定DNA浓度。

2.2制备含hTERT基因的重组慢病毒样颗粒

表3慢病毒样颗粒制备的质粒转染方案

钙转染的主要步骤如下：

(1)将293T细胞饲养于10cm的培养皿中，过夜培养，待细胞密度大约为50％ 时进行转染，转染前1h更换新鲜培养基；

(2)制备DNA-Ca Cl2复合物：将ps PAX2(10μg)、p MD2.G(15μg)与 p LOV-hTERT(25μg)/p LOV-GFP-3Flag(25μg)分别加至相应装有66μl 2.5M Ca Cl2 的2ml离心管中，然后用无菌水将体积补至660μl，充分混匀，室温静置3min；

(3)取660μl加热至37℃的2×HBS缓冲液(pH 7.01)(由140mM Na Cl, 1.5m MNa2HPO4·2H2O,50m M HEPES组成)，迅速滴加至DNA-Ca Cl2混合液中，并 立即吹打充分混匀，室温孵育10min；

(4)将制备好的转染液均匀滴加至293T细胞培养基表面，并在显微镜下观察是 否形成细小颗粒；

(5)转染16h后，用新鲜的完全培养基更换含转染颗粒的培养基；

(6)转染48h后，收集含慢病毒颗粒的所有培养上清液，0.45um滤器过滤后，-70℃保存备用。

2.3最佳嘌呤霉素筛选浓度确定

(1)细胞培养：复苏原代绵羊肺细胞并制备成细胞悬液以约1×10 5次方个/ml 的密度接种于24孔板内。

(2)制备筛选培养液，将嘌呤霉素在0-5ug/mL范围内按1ug/mL一个梯度，用培 养液稀释嘌呤霉素制成筛选培养液。

(3)嘌呤霉素筛选：弃掉培养孔中培养液，PBS清洗2次，每孔加入不同浓度筛选 培养液，每个梯度3个重复。

(4)确定最佳筛选浓度:每6h,记录一次细胞生长状况，24h内能够杀死所有细胞的最小嘌呤霉素浓度即为最佳筛选浓度。

2.4重组病毒的浓缩

重组质粒pLov-hTERT，psPAX2包装质粒和pMD2.G外膜质粒共转染于293T细胞48h后收集上清，过滤后，梯度离心，5000rpm/ml,10min,7000rpm/mL,10min,9000rpm/mL,10min,34000rpm,3h,每管用 500ulPBS溶解后，-80℃保存。

2.5RT-PCR鉴定重组慢病毒颗粒中hTERT基因

取200ul重组慢病毒液提取RNA进行RT-PCR，反转录为cDNA。以cDNA为模板，体 系和扩增条件同2.1。

2.6荧光定量PCR测定重组慢病毒滴度

取200ul重组慢病毒液提取RNA进行RT-PCR，反转录为cDNA,用重组质粒 pLov-hTERT进行10倍梯度稀释绘制标准曲线，qPCR引物设计如下：

F2-qpcr:5‘-CGTGGTTTCTGTGTGGTGTC-3’，SEQ ID NO.3，

R2-qpcr:5‘-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’，SEQ ID NO.4；

重组慢病毒浓度为5×106次方。,

2.7重组慢病毒感染原代绵羊肺细胞

(1)将原代绵羊肺细胞制成细胞悬液并接种于25平方厘米培养瓶，培养24h后细胞汇合度在80％左右，PBS清洗2次；

(2)取500ul浓缩后的重组慢病毒液，加入5ug/mL Polybrene(聚凝胺),6h后 换成DMEM完全培养基培养48h；

(3)更换DMEM完全培养基，内含2ug/mL嘌呤霉素，当阳性细胞出现后，约4天 后将嘌呤霉素维持在0.5ug/mL将细胞扩大培养并连续传代，命名为SLT细胞。

在此过程中，我们利用平行实验的对照组即稳定表达GFP的过程进行参照。重组慢病毒样颗粒感染原代绵羊肺细胞24h荧光显微镜下观察可见绿色荧光。细胞形态学 鉴定SLT细胞利用倒置显微镜观察不同代次的SLT细胞和原代绵羊肺细胞进行照相，记 录并进行比较分析。

2.8hTERT基因组插入水平检测以及m RNA转录水平检测

将培养状态良好的第10代和20代SLT细胞，用胰酶消化离心，取沉淀，提取细胞 总基因组DNA和RNA，提取过程参照上海生工生物有限公司试剂盒操作说明书，mRNA 进行反转录获得cDNA，以cDNA和抽提的细胞基因组DNA为模板，用引物 InFu-hTERT-BamHI(+)和InFu-hTERT-XbaI(-)进行PCR扩增。PCR反应程序如下：

将PCR扩增产物取10ul，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.9SLT细胞表达hTERT蛋白Western blot检测

取第10和20代细胞，并取Hela细胞作为阳性对照，弃掉培养基，用PBS清洗2 次，加入细胞裂解液200ul/瓶，冰上孵育5min,用细胞刮快速刮下细胞于1.5ml离心管 中，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃金属浴10min,使蛋白变性，12000rpm离心5min, 取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜。

5％脱脂乳，4℃封闭过夜，1：1000稀释hTERT一抗,37℃2h,PBST清洗3次，8min/次，1：5000稀释HPR标记的二抗，室温1h,PBST清洗3次，10min/次，ECL显色。

3结果

3.1重组质粒pLov-hTERT的构建及鉴定

pLov-CMV慢病毒载体利用BamH I和Xba I双酶切，再通过In-Fusion技术进行连接。

提取质粒进行BamH I和Xba I双酶切鉴定，已经BamH I单酶切鉴定，如图1所示，显示pLov-hTERT重组质粒构建成功，下一步开始继续慢病毒包装。

3.2重组慢病毒的鉴定

鉴定结果如图2所示：1,2，3为质粒pCI-neo-hTERT作为阳性对照；4，5，6为重 组慢病毒；7为空白对照；由图2可知，重组慢病毒拯救成功。

3.3稳定表达hTERT的原代绵羊肺细胞筛选

前期利用原代绵羊肺细胞筛选出杀死该细胞最低的嘌呤霉素浓度为2μg/ml。将pLOV-hTERT与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共转染于293T细胞中，48h后 收集含hTERT的重组慢病毒样颗粒的细胞培养液。然后分别将其转接至原代绵羊肺细胞 中进行感染，48h后加入嘌呤霉素至终浓度为2μg/ml，每天更换新培养基，待细胞不 出现死亡，将细胞进行传代，分别将稳定表达hTERT的细胞系命名为SLT细胞系。

3.4细胞基因组中的hTERT基因检测及其转录水平mRNA的检测

选取SLT细胞的第10和20代并以Hela细胞作为阳性对照，提取细胞中的总DNA 和细胞总RNA，细胞总RNA经过反转录合成c DNA。然后分别用F2-qpcr和R2-qpcr特 异引物，分别以各自细胞的DNA和c DNA为模板，扩增hTERT基因。以表达质粒p LOV-hTERT基因为阳性对照，片段大小为214bp。如图3A所示，第10和20代细胞中 能检出hTERT基因，而原代绵羊肺细胞未检测出。如图3B所示，RT-PCR检测第10 和20代SLT细胞均能检测出hTERT基因，而原代绵羊肺细胞未检测出。从而表明， hTERT基因成功插入到原代绵羊肺细胞基因组中，并且能够转录成m RNA。

3.5Western blot分析外源基因hTERT蛋白表达

分别选取第10代和第20代SLT细胞并以Hela细胞做阳性对照，进行Western blot和IFA检测。以人源端粒酶抗体为一抗，β-actin为内参蛋白。如图4A所示， hTERT蛋白在第10代和第20代SLT细胞中均得到有效表达；同时，IFA检测获得相 同结果如图4B所示。从而表明SLT细胞能够稳定表达hTERT蛋白。

3.6PPRV-N75在SLT细胞上的增值特性研究

选用PPRV-N75疫苗毒在30代永生化绵羊肺细胞中盲传3代后通过RT-PCR方法检测PPRV-N基因。

步骤：待SLT细胞生长至80％时，弃掉培养基，接着用PBS清洗2次，按培养基的10％的量接入PPRV-N75疫苗毒，37°孵育2h后，含有2％FBS培养基补液至5ml。盲传三 代后按照生工RNA提取试剂盒提取RNA后反转录为cDNA。N基因大小为1500bp。

图5为RT-PCR检测SLT细胞中PPRV-N75-N基因。由图5所示：1，PPRV-N75-P1； 2，PPRV-N75-P2；3，PPRV-N75-P3；4，阴性对照；5，空白对照；结果表明在SLT细胞 上盲传3代PPRV-N75后，均可检测到PPRV-N75-N基因。

3.61Western Blot和IFA检测PPRV-N蛋白

取34代SLT细胞，按照10％的剂量接种PPRV-N75-P3代毒，48h后进行检测。步骤 如下：

WB：弃掉培养基，用PBS清洗2次，加入细胞裂解液200ul/瓶，冰上孵育5min,用 细胞刮快速刮下细胞于1.5ml离心管中，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃金属浴10min, 使蛋白变性，12000rpm离心5min,取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜。

5％脱脂乳，4℃封闭过夜，用PPRV-F杂交瘤细胞上清作为一抗,4℃孵育过夜,PBST清洗3次，8min/次，1：5000稀释HPR标记的羊抗鼠二抗，室温1h,PBST清洗3次，10min/ 次，ECL显色。

IFA：取34代SLT细胞在六孔板中，加入fisher片，待细胞生长至60％时，接毒量 及步骤同WB操作，48h后弃液，用PBS清洗3次，5min/次。将培养的细胞用4％多聚甲 醛固定，4℃固定15min.PBST清洗3次，5min/次。3％BSA，4℃封闭过夜,PPRV-F杂交 瘤细胞上清为一抗，4℃孵育8h。用PBST清洗3次，5min/次，加入FITC标记的二抗(1： 1000稀释)，37℃孵育40min.PBST清洗3次，DIPA(1:1000)染色5min,PBST清洗3次， 10min/次。最后在激光共聚焦荧光显微镜下镜检并记录结果；如图6，Western Blot检 测SLT细胞中PPRV-N75-N蛋白所示：(A)PPRV-N蛋白检测，1为阴性对照；2为实验 组；(B)内参蛋白β-actin检测，1为阴性对照；2为实验组；由图6可知，结果与预 期结果一致。如图7，IFA检测PPRV-N75-F蛋白所示：(A)，DAPI图；(B)，FITC 图；(C)Merge图；(D)阴性对照；结果表明在SLT细胞中已检测到PPRV-N75-F蛋白。

3.62电镜

36代SLT细胞，接毒PPRV-N75-P5代，步骤同上，接毒6天后，收集细胞上清 65ml,8000rpm离心10min后，32000g离心3h,沉淀用500ul双蒸水溶解后，取15ul进 行电镜观察，如图8所示电镜检测SLT细胞培养液中的PPRV病毒粒子。由图8可知， 在电镜下可以观察到直径大小在100-300nm左右的病毒粒子。

图9为第十代永生化绵羊肺成纤维细胞态；由图9可知，永生化后的细胞生长状态良好。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特 定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所

<120> 永生化原代绵羊肺细胞系的构建及其应用

<130> DAG28612

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> InFu-hTERT-BamHI

<400> 1

cccgggattt ggatccatgg gctagcctcg agaattc 37

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> InFu-hTERT-XbaI

<400> 2

cgctcagtta tctagacgaa gcattaaccc tcactaa 37

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F2-qpcr

<400> 3

cgtggtttct gtgtggtgtc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2-qpcr

<400> 4

ccttgtcgcc tgaggagtag 20

Claims (8)

1.一种永生化原代绵羊肺细胞系的构建方法，其特征在于，以原代绵羊肺细胞作为宿主细胞，用含hTERT基因的重组慢病毒感染宿主细胞，经过筛选、传代、鉴定，即得。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将重组质粒pLOV-hTERT与包装质粒psPAX2和外膜质粒p MD2.G共同转染293T细胞，获得含hTERT基因的重组慢病毒颗粒。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pLOV-hTERT是通过将hTERT基因编码序列通过Infusion技术插入至慢病毒pLOV-6FP-3Flag中构建而得。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述插入是以pCI-Neo-hTERT为质粒模板进行PCR扩增反应，PCR上游引物InFu-hTERT-BamHI序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物InFu-hTERT-XbaI序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述筛选是采用嘌呤霉素进行筛选。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，嘌呤霉素筛选浓度为2ug/Ml。

7.一株永生化原代绵羊肺细胞系，其特征在于，所述细胞系为Ovis aries-Lung细胞CCTCC NO：C201723。

8.一种如权利要求7所述的永生化原代绵羊肺细胞系在作为细胞模型研究羊源病毒的致病机制中的用途。