CN110747199B

CN110747199B - 蜜蜂抗逆相关基因nf-y及其应用

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Publication number: CN110747199B
Application number: CN201911186586.4A
Authority: CN
Inventors: 郭兴启; 李桂林; 胥保华; 王颖; 王红芳; 刘振国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN110747199A

Abstract

本发明涉及细胞生物学、生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种蜜蜂抗逆相关基因NF‑Y及其应用。本发明首次对蜜蜂NF‑YA、NF‑YB和NF‑YC的细胞定位情况、蛋白间相互作用的模式、在细胞中发挥作用的具体位置，以及NF‑Y与蜜蜂在环境胁迫条件下的抗逆性的相关性进行了研究，对丰富蜜蜂抗逆生物学机制、改良和培育抗逆蜜蜂新品种具有重要的指导意义。此外，如将NF‑Y基因在蜜蜂、家蚕、牛和羊等经济动物中超表达，可提高其抗逆能力，提高其品质和产量，具有重要的实际意义和应用价值。

Description

蜜蜂抗逆相关基因NF-Y及其应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学、生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种蜜蜂抗逆相关基因NF-Y及其应用。

背景技术

蜜蜂是主要的授粉者，可以为开花植物授粉，提高农作物的质量和产量，同时在维持生态平衡，国民经济及生态系统中发挥着重要的作用，具有重要的经济价值和社会效益。据估计，如果没有蜜蜂的授粉，农作物产量将减少90％以上。然而，近年来由于受各种环境胁迫(冷、热、农药、病虫害及栖息地丧失等)的影响，包括我国在内的世界上很多地区的蜜蜂数量逐渐减少。这种现象引起了人民、科研人员及政府人员的高度重视。因此，培育抗逆蜂种、提高蜜蜂的抗逆性具有重要的意义。

环境胁迫可以通过影响蜜蜂的正常生长、发育及行为学导致蜂群衰退，进而引起蜜蜂数量的减少。例如，在蜂巢中蜜蜂生存的最适温度是33℃，蜂巢温度过高或过低就会对蜜蜂造成热胁迫或冷胁迫，严重影响蜜蜂幼虫的生长与发育。采集蜂在环境温度过高或过低时也会减少采集水、花粉、及花蜜的活动，甚至不出巢进行采集活动。此外，农药的使用也严重危害蜜蜂的健康和生存。虽然农药在农业生产中发挥着巨大的作用，但在使用农药除草及防治农作物病虫害时，由于滥用或过度使用农药，对蜜蜂的生存造成了巨大危害。比如，新烟碱类杀虫剂影响蜜蜂的卫生行为、学习能力、采集活动及免疫能力，造成蜜蜂早熟。严重时农药胁迫可在数天内使蜂群崩溃。除草剂-草甘膦可以扰乱蜜蜂肠道微生物群落的多样性，使蜜蜂体重减少，并且使蜜蜂对其他的环境胁迫变得更敏感。尽管如此，蜜蜂如何抵御环境胁迫，在这个过程中起关键作用的基因仍需要进一步探索。因此寻找蜜蜂抗逆相关的基因并研究其功能，探索蜜蜂抗逆的具体分子机制显得尤为重要。

核因子Y(Nuclear factor Y，NF-Y)是一类重要的转录因子，在动物及植物中普遍存在。NF-Y一共有3个亚基，包括NF-YA、NF-YB和NF-YC。在植物中，每个NF-Y亚基可被多个基因编码，但是在动物中每个NF-Y亚基只被一个基因编码。植物的NF-YA一般定位在细胞核，NF-YC定位在在细胞核和细胞质，NF-YB主要定位在细胞质中，但是在植物特定的生长发育时期NF-YB也可以主要定位在细胞核。植物NF-Y的3个亚基间可以形成一个异源三聚体在细胞核中发挥作用。虽然NF-Y最早是在动物(老鼠)中被发现，但是到目前为止关于动物NF-Y的3个亚基的亚细胞定位情况及相互作用的模式很少有研究。在蜜蜂中，NF-Y在细胞中的定位及不同亚基间的相互作用方式未见报道。

NF-Y在动物的生长、发育、肿瘤、癌症及人类的其他一些疾病中起重要的调控作用。在老鼠及果蝇中缺失NF-YA是致死的。3个NF-Y亚基在果蝇的眼、R7光感受器及胸的生长与发育过程中均起着重要的调控作用。此外，NF-Y可以通过与不同的蛋白(p53、p73或者SOX9)互作调控结肠癌、胰腺癌或者肝癌的发生。在植物中，多数研究表明NF-Y在环境胁迫(干旱、盐、冷和热)反应中发挥着重要的作用。然而，关于NF-Y在动物的抗逆反应中的作用少有报道。目前国内外尚没有关于蜜蜂NF-Y的抗逆能力及应用的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种蜜蜂抗逆相关基因NF-Y及其应用。NF-Y基因家族包括3个成员：NF-YA、NF-YB和NF-YC。本发明研究发现，NF-YA定位于细胞核，NF-YB定位于细胞质，NF-YC定位于细胞质和细胞核。NF-YC既可以与NF-YA互作，也可以与NF-YB互作。并且NF-YC通过与NF-YB互作，可以将位于细胞质的NF-YB转移到细胞核中发挥作用。蜜蜂在遭受环境胁迫时，NF-YA、NF-YB和NF-YC均被诱导表达。沉默NF-YA基因，降低蜜蜂对高温的耐受能力。因此，NF-Y基因可以作为调控蜜蜂抗逆性的靶标基因，对于培育抗逆蜂种、提高蜜蜂的抗逆性具有重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供NF-Y基因或者其表达产物作为靶标在如下1)或2)中的应用：

1)调控蜜蜂在环境胁迫条件下的抗逆能力；

2)培育在环境胁迫条件下抗逆能力增强的蜜蜂品种。

上述应用中，NF-Y基因的表达产物包括：NF-YA、NF-YB和NF-YC，其中，NF-YA定位于细胞核，NF-YB定位于细胞质，NF-YC定位于细胞质和细胞核。

上述应用中，所述NF-YC分别和NF-YA、NF-YB互作，并且NF-YC通过与NF-YB互作，将位于细胞质的NF-YB转移到细胞核中发挥作用。

上述应用中，NF-YB和NF-YC的HFM结构域对NF-YB和NF-YC蛋白间的相互作用及共定位到细胞核中是不可缺少的。

上述应用中，所述环境胁迫条件包括：低温、高温、紫外线和农药胁迫。

本发明的第二方面，提供特异性检测NF-Y基因或者其表达产物的试剂在制备用于检测蜜蜂在环境胁迫下抗逆能力的产品中的应用。

上述应用中，所述产品采用实时荧光定量PCR方法检测NF-Y基因或者其表达产物。

上述应用中，所述产品包括：实时荧光定量PCR和试剂盒。

上述应用中，实时荧光定量PCR检测NF-Y基因的产品中含有：

特异性检测NF-YA基因的引物对，其序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；

特异性检测NF-YB基因的引物对，其序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；

特异性检测NF-YC基因的引物对，其序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。

本发明的第三方面，提供沉默NF-Y基因表达的试剂及环境胁迫下抗逆能力提高的蜜蜂模型中的应用。

上述应用中，用于扩增NF-Y沉默片段的引物序列分别如SEQ ID NO.29和SEQ IDNO.30所示。

沉默NF-YA基因降低蜜蜂在热激胁迫条件下的生存能力，若在蜜蜂或其他经济动物(家蚕、猪和牛等)超表达该基因有望提高它们在环境胁迫中的抗逆能力。

本发明的有益效果：

本发明首次对蜜蜂NF-YA、NF-YB和NF-YC的细胞定位情况、蛋白间相互作用的模式、在细胞中发挥作用的具体位置，以及NF-Y基因与蜜蜂在环境胁迫条件下的抗逆性的相关性进行了研究，对丰富蜜蜂抗逆生物学机制、改良和培育抗逆蜜蜂新品种具有重要的指导意义。

附图说明

图1：NF-YA、NF-YB和NF-YC亚细胞定位检测图。A：NF-YA在细胞中的定位情况；B：NF-YB在细胞中的定位情况。C：NF-YC在细胞中的定位情况。

由图中可见，NF-YA定位在细胞核，NF-YB定位在细胞质，NF-YC在细胞核和细胞质中均有定位。

图2：NF-YA、NF-YB和NF-YC蛋白间相互作用方式分析图。A：酵母双杂交结果图；B：免疫共沉淀结果图；C：NF-YB和NF-YC亚细胞共定位图。

由图中可知，NF-YA和NF-YC可以互作，NF-YB和NF-YC可以互作。此外，NF-YB和NF-YC可以共定位到细胞核。

图3：保守结构域HFM对NF-YB和NF-YC蛋白亚细胞共定位结果的影响图。A：NF-YC蛋白与NF-YB的HFM结构域的亚细胞共定位情况；B：NF-YC的HFM结构域和NF-YB蛋白的亚细胞共定位结果；C：缺失HMF结构域的NF-YC与NF-YB蛋白在细胞中的共定位结果图。

由图中可知，只有当HFM结构域存在时NF-YB才能与NF-YC共定位到细胞核中，缺失HMF结构域后，在细胞质里定位的NF-YB不能进入细胞核。

图4：在逆境条件下NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式鉴定图。A：无胁迫处理时NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式；B：低温处理条件下，NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式；C：高温处理条件下，NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式；D：紫外线处理条件下，NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式；E：阿维菌素处理条件下，NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式；F：高效氯氟氰菊酯处理条件下，NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式。

由图中可见，当蜜蜂遭受低温、高温、紫外线、阿维菌素和高效氯氟氰菊酯胁迫时，虽然NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达模式有差异，但它们均在一定程度上被诱导表达。

图5：沉默NF-YA对蜜蜂在热激胁迫条件下生存率的检测图。A：在蜜蜂中NF-YA被沉默的效率检测结果图；B：沉默NF-YA对蜜蜂热耐受能力影响的结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，核因子Y(Nuclear factor Y，NF-Y)是一类普遍存在于酵母、动物、植物等真核生物中的转录因子。NF-Y在不同真核生物中的功能是存在差异的，而且NF-Y的功能需要NF-YA、NF-YB和NF-YC三种亚基之间的互作。目前关于动物NF-Y的3个亚基的亚细胞定位情况及相互作用的模式很少有研究。在蜜蜂中，NF-Y在细胞中的定位及不同亚基间的相互作用方式更是未有报道。

基于此，本发明的目的在于对蜜蜂NF-Y基因以及该基因编码的蛋白在细胞中定位情况、发挥作用时蛋白(亚基)间的相互作用模式和NF-Y基因在蜜蜂抗逆反应中的作用进行了研究。

在本发明中我们根据NCBI上公布的中华蜜蜂的NF-YA、NF-YB和NF-YC的基因组的序列(SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.35)设计特异性引物，利用PCR技术扩增出它们编码区的序列，并将其分别构建到真核表达载体pUAST-3×Flag、pUAST-6×Myc和pUAST-3×HA上。鉴于目前蜜蜂细胞尚不能进行体外培养，我们把构建好的Flag-NF-YA、Myc-NF-YB和HA-NF-YC真核表达载体转染到果蝇的S2细胞中。然后我们利用免疫荧光实验和双光子激光共聚焦显微镜发现NF-YA在细胞核中定位(图1A)，NF-YB在细胞质中定位(图1B)，NF-YC在细胞核及细胞质中均有定位(图1C)。

本发明将NF-YA、NF-YB和NF-YC编码区的核苷酸序列均克隆到pGADT7和pGBKT7酵母双杂交载体上。利用酵母双杂交实验，我们发现在体外NF-YA和NFYB不能互作，而NF-YA和NF-YC可以互作，NF-YB和NF-YC可以互作(图2A)。此外，我们借助果蝇体系，在果蝇的S2细胞中异源表达NF-YA、NF-YB和NF-YC，我们发现在体内NF-YA同样可以与NF-YC互作，NF-YB和NF-YC互作(图2B)。当我们把Myc-NF-YB和HA-NF-YC共转果蝇的S2细胞时，利用免疫荧光实验和双光子激光共聚焦显微镜发现在细胞质定位的NF-YB可以与NF-YC共定位在细胞核中(图2C)，说明NF-YC与NF-YB互作后可以把NF-YB拉进细胞核发挥作用。这个结果进一步揭示了NF-YA、NF-YB和NF-YC发挥作用时的具体作用模式。

本发明同时利用生物信息学方法找到了NF-YB和NF-YC的保守结构域HFM。NF-YB蛋白的第78-170个氨基酸是NF-YB的HFM结构域所在的位置，NF-YC蛋白的第60-136个氨基酸是NF-YC的HFM结构域所在的位置。然后我们构建了Myc-NF-YB-HFM、HA-NF-YC-HFM真核表达载体，通过把Myc-NF-YB、HA-NF-YC、Myc-NF-YB-HFM和HA-NF-YC共转果蝇S2细胞，利用免疫荧光实验和双光子激光共聚焦显微镜我们发现NF-YB的HMF结构域可以和NF-YC共定位到细胞核(图3A)，NF-YC的HMF结构域和NF-YB也能共定位到细胞核(图3B)。但是，当我们利用两次PCR技术把NF-YC的HMF结构域缺失后，构建HA-NF-YC-ΔHFM真核表达载体。把Myc-NF-YB和HA-NF-YC-ΔHFM共转果蝇的S2细胞，NF-YB和NF-YC-ΔHFM均在细胞质中定位(图3C)。由此可见，HFM结构域对NF-YB和NF-YC蛋白间的互作及在细胞核中发挥功能是必须的。

采集蜂相对其他不同生长发育时期的蜜蜂更容易遭受各种环境胁迫，因此本发明选取采集蜂为实验材料，检测当采集蜂遭受环境胁迫时NF-YA、NF-YB和NF-YC的表达水平。通过实施荧光定量PCR，本发明发现在没有胁迫处理时，NF-YA、NF-YB和NF-YC的转录水平没变化(图4A)。在采集蜂遭受低温、高温、紫外线、阿维菌素和高效氯氟氰菊酯胁迫时，相对于对照组，3个NF-Y基因均在一定程度上被诱导表达(图4B-4F)。

本发明为了检测NF-Y的抗逆功能，我们借助dsRNA介导的基因沉默技术，在蜜蜂中成功沉默了NF-YA基因(图5A)。本发明还发现，与对照组相比(图中的gfp)，当沉默NF-YA时(图中的nf-ya^-)，在热激胁迫条件下蜜蜂的存活率显著降低(图5B)。超表达NF-YA基因将可能提高蜜蜂在热激胁迫条件下的耐受力。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

综上，本发明提供了蜜蜂NF-YA、NF-YB和NF-YC的细胞定位情况、蛋白间相互作用的模式、在细胞中发挥作用的具体位置及其抗逆功能和应用。本发明为丰富蜜蜂抗逆生物学机制，改良和培育抗逆蜜蜂新品种具有重要的指导意义。鉴于NF-YA、NF-YB和NF-YC的抗逆性能，将来有望利用基因工程或转基因技术将NF-Y在蜜蜂及其他的经济动物(家蚕、猪、鸡和羊等)过表达，以提高它们耐受逆境胁迫的能力，进而提高源自他们的产品的产量和品质，具有重要的经济效益和社会价值。

实施例1：蜜蜂核转录因子Y(NFY-A、NFY-B和NFY-C)的亚细胞定位分析

1.RNA的提取：采用Trizol法来提取蜜蜂的总RNA。

2.cDNA第一链的合成

采用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(购自TaKaRa公司)，以上一步骤中提取的RNA为模板合成cDNA第一链。

3.真核表达载体的构建

(a)依据NCBI数据库上公布的蜜蜂的NF-YA、NF-YB及NF-YC基因的编码区设计引物。

扩增NF-YA编码区用的引物为：

正向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是NotI酶切位点。

反向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是XbaI酶切位点。

扩增NF-YB编码区用的引物为：

正向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是BgIII酶切位点。

反向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是XhoI酶切位点。

扩增NF-YC编码区用的引物为：

正向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是BgIII酶切位点。

反向引物：

NO.6)

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是XhoI酶切位点。

引物由上海生工生物股份有限公司合成。

(b)以蜜蜂cDNA为模版，上面提到的正向及反向引物进行PCR扩增。

PCR体系如下：

扩增NF-YA编码区PCR反应程序如下：

扩增NF-YB编码区PCR反应程序如下：

扩增NF-YC编码区PCR反应程序如下：

(c)将上一步获得的PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，确定目的片段大小正确后，对目的片段分别进行胶回收。用对应的酶对胶回收产物、pUAST-3×Flag、pUAST-6×Myc和pUAST-3×HA空载体进行酶切。其中pUAST-3×Flag、pUAST-6×Myc和pUAST-3×HA空载体来源于山东农业大学。然后分别对酶切产物进行胶回收。酶切产物分别进行胶回收后，再用T4 DNA连接酶把NF-YA、NF-YB及NF-YC的编码区分别连接到pUAST-3×Flag、pUAST-6×Myc和pUAST-3×HA载体上。把连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞里，再把菌液涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基(50mg/L)上培养，在37℃培养12h后对菌落进行PCR鉴定。最后对测序正确的菌液摇菌，用金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒(康为试剂公司生产)提取质粒获得构建成功的Flag-NF-YA、Myc-NF-YB和HA-NF-YC真核表达载体。提取的质粒放-20℃保存，等需要时用于转染果蝇的S2细胞。

4.果蝇S2细胞的复苏、传代与转染

4.1果蝇S2细胞的复苏

(a)将果蝇的S2细胞从-80℃冰箱拿出后立即放在25℃的水浴锅中融化。同时用于培养果蝇S2细胞的培养基也在25℃预热。果蝇的S2细胞培养基购买自GE Healthcare LifeSciences公司。

(b)在超净工作台里将融化的果蝇S2细胞转入到含有10mL培养基的直径为10cm的一次性无菌塑料培养皿中。然后将该培养皿放入到25℃的无菌培养箱中进行果蝇S2细胞的一次复苏。

(c)待一次复苏的果蝇S2细胞长满盘时，把细胞平均分到2个培养皿中进行二次复苏。另外，这2个培养皿里均再额外加入10mL的培养基。然后轻轻晃动培养皿使细胞混匀后，把培养皿放到25℃的无菌培养箱中进行果蝇S2细胞的二次复苏。大约2天后，待二次复苏的细胞长满盘时，进行细胞的传代与分离。

4.2细胞的传代与分离

拿出1个直径为3cm的培养皿依次加入3mL上一步中预热的果蝇S2细胞培养基和1mL二次复苏的细胞，将细胞混匀并放在25℃的无菌培养箱中培养。次日，待细胞长满盘时进行转染实验。

4.3转染果蝇S2细胞

在超净工作台上将需要转染的质粒与转染试剂PEI按照1：2(质量比)的比例加入到400μL的PBS中配置转染液，旋涡震荡混匀后室温放15min。然后将转染液加入到已传代的细胞中，轻轻混匀，放在25℃的无菌培养箱中培养48h后进行免疫荧光实验。

5.免疫荧光实验

把上一步培养的细胞收集到15mL的离心管中，室温下12000rpm离心3min；去上清，沉淀用1mL的PBS轻轻悬浮并转移到1.5mL的离心管中。离心管里加入1mL的4％的甲醛后，常温条件下放摇床上摇20min。12000rpm离心3min，去上清，沉淀用1mL的PBS洗3次，每次10min。12000rpm离心3min，去上清，然后把1mL的PBT加入含有沉淀的离心管中，在摇床上摇10min。12000rpm离心1min，去上清，用200μL的PBS悬浮沉淀，轻轻混匀，按1:200的比例加入对应的鼠源anti-Flg、anti-HA或者anti-Myc一抗，4℃条件下摇12h。然后，拿出离心管，12000rpm离心3min，去上清，沉淀用1mL的PBS洗3次，每次10min。常温条件下12000rpm常温离心3min，去上清，把200μL的PBS加入离心管中，按1:200的比例加入Cy3标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，常温条件下避光摇2h。然后加入300uL的PBS，按照1:1000的比例再加入DAPI用于标记细胞核，常温条件下避光摇15min。12000rpm常温离心3min，沉淀用1mL的PBS洗3次，每次10min。最后制作玻片，利用双光子激光共聚焦显微镜观察NF-YA、NF-YB和NF-YC的亚细胞定位情况。

实施例2：NF-YA、NF-YB和NF-YC蛋白间的互作模式分析

1.酵母双杂交

1.1构建NF-Y的酵母双杂交表达载体：

(a)根据NF-YA、NF-Y和NF-YC编码区的核苷酸序列设计特异性引物。

用于构建NF-YA的酵母双杂交的引物为：

正向引物：5'-CATATGATGGAACAACTGGGAGAAGG-3'；(SEQ ID NO.7)

划横线的序列是NdeI酶切位点。

反向引物：5'-GGATCCTATTAAACAATTATTTGAGGTAAC-3'；(SEQ ID NO.8)

划横线的序列是BamHI酶切位点。

用于构建NF-YB的酵母双杂交的引物为：

正向引物：5'-GAATTCATGTCTATTGATAAGTGTATCAAACTGG-3'；(SEQ ID NO.9)

划横线的序列是EcoRI酶切位点。

反向引物：5'-GGATCCAGAAAGTTGAAATTGCATTTGATCAG-3'；(SEQ ID NO.10)

划横线的序列是BamHI酶切位点。

用于构建NF-YC的酵母双杂交的引物为：

正向引物：5'-CATATGATGTCGGTATTCTTCGTGAAT-3'；(SEQ ID NO.11)

划横线的序列是NdeI酶切位点。

反向引物：5'-GGATCCCTCATTGTCTGTTCCGCTAG-3'；(SEQ ID NO.12)

划横线的序列是BamHI酶切位点。

(b)参照实施例1中的PCR方法，以蜜蜂的cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后把目的片段进行胶回收。把胶回收产物连接到pEasy-T1Simple载体上，连接产物转化大DH5α大肠感受态细胞里，挑选目的片段测序正确的阳性克隆菌并提取质粒。把该质粒与酵母载体pGBKT7、pGADT7用相同的酶进行酶切，然后用T4 DNA连接酶把NF-YA、NF-YB和NF-YC的编码区分别连接到pGBKT7和pGADT7上，连接产物转化DH5α大肠感受态细胞，挑选目的片段测序正确的阳性克隆菌提取质粒，以获得AD-NF-YA、AD-NF-YB、AD-NF-YC、BD-NF-YA、BD-NF-YB和BD-NF-YC酵母表达载体。pEasy-T1 Simple载体是从北京全式金生物技术有限公司购买。酵母载体pGBKT7、pGADT7来源于山东农业大学。

1.2酵母感受态的制备

(a)挑取2-3个Y187单克隆酵母双杂交菌株，接种于3ml的YPDA液体培养基，30℃，250rpm震荡培养8h，得到种子液。Y187单克隆酵母双杂交菌株来源于山东农业大学。YPDA培养基购买自TaKaRa公司。

(b)取100μL种子液加入到含50mL的YPDA三角瓶中，30℃，250rpm震荡培养12-20h，培养到菌的OD₆₀₀达到0.15-0.3。

(c)将培养液转移到50mL的离心管中，室温，700rcf(相对离心力)，离心5min。

(d)弃上清，沉淀用100mL的YPDA培养基重悬后移至250mL的三角瓶，30℃，250rpm培养3-5h，培养菌的OD₆₀₀达到0.4-0.5。

(e)将上一步培养液平均分装到两个50mL的离心管中，室温，700rcf，离心5min。

(f)弃上清，然后每管沉淀用30mL的去离子超纯水重悬，室温，700rcf，离心5min。

(g)弃上清，沉淀用3mL的1.1×TE/LiAc重悬，轻轻混匀，吸出重悬液到新的1.5mL离心管，室温，12000rpm离心15-30s。1.1×TE/LiAc的配置方法为：1.1mL 10×TE Buffer、1.1mL 10×LiAC(1M)和7.8mL ddH₂O。

(h)弃上清，沉淀用600μL的1.1×TE/LiAc重悬，混匀后备用。

1.3酵母双杂交载体共转化酵母感受态

(a)在新的1.5mL离心管中加入待转化的质粒DNA，5μL已变性的Carrier DNA，100μL酵母感受态。Carrier DNA购买自Takara公司。Carrier DNA变性步骤为：100℃，10min；然后冰浴，10min；重复两次。

(b)然后，在上述离心管中加入600μL新配制的PEG/LiAC，轻轻混匀。

(c)30℃水浴放置30min，每隔10min轻轻摇匀一次。

(d)在离心管里再加70μL的DMSO，缓慢混匀后，42℃热激30min，每隔10min缓慢摇匀一次。

(e)12000rpm，离心15-30s。

(f)弃上清，沉淀加入150μL的YPD plus培养基(购买自TaKaRa公司)，混匀后，30℃，250rpm培养30min。

(g)12000rpm，离心15-30s。

(h)弃上清，沉淀用200uL的生理盐水重悬，并涂在SD/-Leu-Trp+Aba^r的缺陷型培养基(购买自TaKaRa公司)上，30℃培养。

(l)培养数天，把单克隆挑取并转移至新的SD/-Leu-Trp+Aba^r(购买自TaKaRa公司)培养基上。

(i)培养2-3天，将划线的单克隆转移至SD/-Trp-Leu-His+X-α-Gal培养基(购买自TaKaRa公司)上，培养2-5天观察互作结果。

2.免疫共沉淀

2.1果蝇S2细胞的转染和收集

(a)将提取的Flag-NF-YA、Myc-NF-YB和HA-NF-YC质粒根据需要按照实施例1中4.3步骤中描述的方法转染果蝇的S2细胞。

(b)果蝇S2细胞转染48h后，把细胞转移到15mL的离心管中，常温条件下，1200rpm离心3min。

(c)去上清，沉淀加400μL的细胞裂解液与10×蛋白酶抑制剂的混合液(按照混合液里细胞裂解液和10×蛋白酶抑制剂1：9体积比配置混合液)。用枪头把沉淀吹打起来并转移到一个新的1.5mL的离心管里，冰上放置30min，然后放-80℃过夜，次日做免疫沉淀。

2.2免疫沉淀

(a)将裂解好的细胞放置常温融化10min，待细胞完全融化后，4℃条件下12000rpm离心10min。

(b)先取30μL的上清于一个新的1.5mL的离心管里，加30uL的2×蛋白上样缓冲液，混匀后放100℃煮6min使蛋白变性。处理好的样品放-20℃冰箱保存，等需要时将样本取出做免疫印记实验。剩下的上清液全部转移到另外一个新的1.5mL的离心管里，按照抗体与细胞裂解液1：200的比例加入一抗，4℃条件下摇床上摇2h做免疫沉淀实验。

(c)2h后按照上清液与protein A/G PLUS-Agarose是20：1(体积比)的比例加protein A/G PLUS-Agarose，4℃条件下摇床上摇2h。

(d)4℃，2200rpm离心30s。

(e)去上清，沉淀用500μL的细胞裂解液洗。4℃条件下2000rpm离心1min。该步骤重复3次。

(f)将上一步最后一次离心后的液体吸干，加40μL的1×蛋白上样缓冲液，混匀后100℃煮5min进行蛋白变性。然后将处理好的样品放-20℃冰箱暂存，等需要时将样品取出做免疫印记实验。

3.免疫印记

3.1 SDS-PAGE电泳

(a)配制SDS-PAGE凝胶(浓缩胶和分离胶)，其中分离胶配制的浓度根据蛋白质分子量的大小来确定。

(b)待SDS-PAGE凝胶凝固后，在点样孔里加入预先变性好的蛋白样品。

(c)根据电泳装置选用合适的电流和电压强度电泳。待预染Marker的条带完全分离后停止电泳。

3.2转膜

(a)SDS-PAGE电泳完成后，将分离胶放置在转膜缓冲液中浸泡。

(b)裁剪与分离胶大小一样的厚滤纸及PVDF膜。滤纸放在转膜缓冲液中全部浸湿透待用。PVDF膜需要放在甲醇中先活化15s，然后转移到转膜缓冲液中浸泡。

(c)打开半干转膜仪的外盖和不锈钢电极板。在铂金阳极板上从下往上依次放置事先准备好的厚滤纸、PVDF膜、分离胶和厚滤纸，使每层之间对齐。然后用玻璃棒赶走每层之间的气泡。小心的装上转膜仪的电极板及外盖，打开电源，根据PDVF膜的面积、分离胶的大小选择合适的转膜电流、电压及时间。

3.3抗体的孵育

(a)转膜结束后，把PDVF膜放在封闭液中，常温条件下摇1h。

(b)用TBST缓冲液配5％的脱脂奶粉，根据所用抗体的不同加入对应比例的一抗来制备一抗溶液。把PVDF膜转移到一抗溶液里4℃条件下孵育10h。

(c)一抗孵育结束后用TBST缓冲液漂洗PDVF膜3次，每次10min。

(d)把二抗按比例加入到TBST缓冲液配置的5％的脱脂奶粉溶液里来配置二抗溶液。把漂洗过的PDVF膜放到二抗溶液里常温条件下孵育2h。

(e)二抗孵育结束后用TBST漂洗PDVF膜3次，每次10min。

3.4底物显色

配制显影液，利用化学发光成像系统检测PVDF膜上的蛋白的显影反应。

4.亚细胞共定位

按照实施例1中的果蝇S2细胞的转染方法把Myc-NF-YB和HA-NF-YC质粒共同转化同一盘果蝇S2细胞。完成转染的细胞在25℃培育48h后按照实施例1中的步骤进行免疫荧光实验。与实施例1不同的地方为，在加一抗时同一管细胞同时加入鼠源anti-HA和兔源anti-Myc。在加二抗时在同一管细胞里同时加入Cy3标记亲和纯化驴抗小鼠IgG(H+L)和Cy2标记亲和纯化驴抗兔IgG(H+L)。

实施例3：保守结构域(HFM)对NF-YB和NF-YC蛋白间互作的影响

1.Myc-NF-YB-HFM、HA-NF-YC-HFM和HA-NF-YC-ΔHFM真核表达载体的构建

1.1根据HFM结构域在NF-YB和NF-YC编码区上的位置设计引物：

构建Myc-NF-YB-HFM真核表达载体所用的引物为：

正向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是BgI II酶切位点。

反向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是XhoI酶切位点。

构建HA-NF-YC-HFM真核表达载体所用的引物为：

正向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是BgI II酶切位点。

反向引物：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是XhoI酶切位点。

构建HA-NF-YC-ΔHFM真核表达载体所用的引物为：

第一对引物

正向引物(F1)：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是BgI II酶切位点。

反向引物(R1)：5'-TCTCTTGATTGTGTTTTTAAGTCCAT-3'；(SEQ ID NO.18)

第二对引物

正向引物(F2)：5'-AATCAAGAGATGAATTGAAACAAAG-3'；(SEQ ID NO.19)

反向引物(R2)：

加粗的序列是保护碱基，划横线的序列是XhoI酶切位点。

1.2构建Myc-NF-YB-HFM和HA-NF-YC-HFM真核表达载体时，按照实施例1中真核表达载体构建的步骤进行。

在构建HA-NF-YC-ΔHFM真核表达载体时与实施例1真核表达载体构建步骤不同的地方是：

先分别以F1/R1和F2/R2为引物，蜜蜂的cDNA为模板分别进行第一次PCR。然后把第一次PCR反应产物混在一起，以此为模板，F1/R2为引物进行第二次PCR扩增。第二次PCR扩增的产物再按照实施例1中真核表达载体构建的步骤进行实验。

2.本实施方式中构建好的Myc-NF-YB-HFM、HA-NF-YC-HFM和HA-NF-YC-ΔHFM真核表达载体与实施例1中构建的Myc-NF-YB和HA-NF-YC按照实施例2中的亚细胞共定位的方法进行实验。

实施例4：逆境胁迫条件下NF-Y的表达模式分析

1.选取采集蜂300只，随机分成6组，每组50只。按照下面叙述的步骤处理蜜蜂。

对照组：第1组蜜蜂不做胁迫处理，被放置在温度为33℃、相对湿度为70％，光照度24h均为0的培养箱中培养。

冷处理组：第2组蜜蜂被放置在低温环境下培养，培养环境的相对湿度为70％，光照度24h均为0。

热处理组：第3组蜜蜂被放置在高温环境下培养，培养环境的相对湿度为70％，光照度24h均为0。

紫外线处理组：第4组蜜蜂被放置在温度为33℃、相对湿度为70％，光照度24h均为0的培养箱中培养。同时培养箱里放一个紫外灯对蜜蜂进行紫外线处理。

阿维菌素处理组：第5组蜜蜂用阿维菌素处理，被处理的蜜蜂放置在温度为33℃、相对湿度为70％，光照度24h均为0的培养箱中培养。

高效氯氟氰菊酯处理组：第6组蜜蜂用高效氯氟氰菊酯处理，被处理的蜜蜂放置在温度为33℃、相对湿度为70％，光照度24h均为0的培养箱中培养。

对照组的蜜蜂在0、1、2、3、4和5h取样，处理组的蜜蜂在被处理后的1、2、3、4和5h后取样，样品放在-80℃冰箱保存。待需要时把样品拿出进行RNA的提取。

2.按照实施例1中的方法进行蜜蜂总RNA的提取及cDNA第一链的合成。

3.利用TaKaRa公司生产的TB Green^TM Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)试剂及上一步合成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR实验。内参基因用β-actin(GenBank注册号为HM640276.1)。做实时荧光定量PCR时用到的引物如下：

NF-YA的实时荧光定量PCR引物：

正向引物：ACAACTGGGAGAAGGACAAG；(SEQ ID NO.21)

反向引物：CCATTTGGTGCTGCTACTT；(SEQ ID NO.22)

NF-YB的实时荧光定量PCR引物：

正向引物：AGGAGGTGGTGTTTCTGC；(SEQ ID NO.23)

反向引物：TTCCCGCTTCTGGTATTG；(SEQ ID NO.24)

NF-YC的实时荧光定量PCR引物：

正向引物：ACACCTACAACACAAACTGGG；(SEQ ID NO.25)

反向引物：GCACTCATCCTTCCGTTACTC；(SEQ ID NO.26)

β-actin的实时荧光定量PCR引物：

正向引物：TTATATGCCAACACTGTCCTTT；(SEQ ID NO.27)

反向引物：AGAATTGATCCACCAATCCA；(SEQ ID NO.28)

实施例5：沉默NF-YA基因对蜜蜂耐热能力的影响

1.利用实施例1中所述的PCR技术扩增用于沉默NF-YA的部分编码区片段。同时扩增GFP的部分核苷酸序列，GFP在GenBank上的注册号为：U87974。

扩增NF-Y沉默片段的引物为：

正向引物：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAGCATTGCCAAATGCAGAAG；(SEQ ID NO.29)

反向引物：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTATTAAACAATTATTTGAGGTAAC；(SEQ IDNO.30)

扩增GFP用的引物为：

正向引物：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAGTGGAGAGGGTGAAGGTGA；(SEQ ID NO.31)

反向引物：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGTAAAAGGACAGGGCCATC；(SEQ ID NO.32)

以上4条引物里划线部分均为T7 RNA聚合酶的启动子序列。

2.把上一步扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段。然后利用Promega公司生产的T7 RiboMAX^TM Express RNAi System，以胶回收产物为模版，合成dsRNA-NF-YA和dsRNA-GFP。

3.选取采集蜂40只，分成2组，每组20只蜜蜂。第1组的每只蜜蜂饲喂5μg的dsRNA-NF-YA作为实验组，第2组的每只蜜蜂饲喂5μg的dsRNA-GFP作为对照组。2组蜜蜂均放在温度为33℃、相对湿度为70％，光照度24h均为0的培养箱中培养，饲喂新鲜的花粉和蔗糖溶液。1天后按照实施例4中所述的实时荧光定量PCR方法检测NF-YA在蜜蜂中的沉默效率。

4.确定可以成功沉默蜜蜂中的NF-YA后，选取采集蜂70只，分成2组，每组蜜蜂35只。2组蜜蜂分别按上一步所述的方法饲喂dsRNA-NF-YA和dsRNA-GFP。2天后，2组蜜蜂均用热激胁迫处理，每隔1h统计一次蜜蜂的存活率，结果见图5。

需要说明的是，蜜蜂中NF-YA、NF-YB和NF-YC只有形成异源三聚体才能发挥作用，三者缺一不可，所以三者都很重要。NF-YA基因在热激胁迫条件下的转录水平比NF-YB基因及NF-YC基因的高，说明其受热激胁迫的影响比NF-YB基因和NF-YC基因可能大，所以本实施例中选择考察沉默NF-YA基因对蜜蜂耐热能力的影响。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 蜜蜂抗逆相关基因NF-Y及其应用

<130> 2019

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaggaaaaaa gcggccgcga tggaacaact gggagaagg 39

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctctagact atattaaaca attatttg 28

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaagatctgc atgtctattg ataagtgtat caaactgg 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt caagaaagtt gaaattgcat ttgatcag 38

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaagatctat gtcggtattc ttcgtgaat 29

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctcgagt catctcttag tcttcctgct tagggc 36

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catatgatgg aacaactggg agaagg 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggatcctatt aaacaattat ttgaggtaac 30

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaattcatgt ctattgataa gtgtatcaaa ctgg 34

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggatccagaa agttgaaatt gcatttgatc ag 32

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catatgatgt cggtattctt cgtgaat 27

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggatccctca ttgtctgttc cgctag 26

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaagatctgc cgtgaacaag atcgattcct 30

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccgctcgagt catgttgctt ctctatattt ttgta 35

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaagatcttt gccattagca aggataaa 28

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccgctcgagt caagggacta tatcaattag aaaa 34

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaagatctat gtcggtattc ttcgtgaat 29

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tctcttgatt gtgtttttaa gtccat 26

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aatcaagaga tgaattgaaa caaag 25

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccgctcgagt catctcttag tcttcctgct tagggc 36

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acaactggga gaaggacaag 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccatttggtg ctgctactt 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aggaggtggt gtttctgc 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttcccgcttc tggtattg 18

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acacctacaa cacaaactgg g 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcactcatcc ttccgttact c 21

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ttatatgcca acactgtcct tt 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agaattgatc caccaatcca 20

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ggatcctaat acgactcact ataggagcat tgccaaatgc agaag 45

<210> 30

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggatcctaat acgactcact ataggtatta aacaattatt tgaggtaac 49

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggatcctaat acgactcact ataggagtgg agagggtgaa ggtga 45

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggatcctaat acgactcact ataggggtaa aaggacaggg ccatc 45

<210> 33

<211> 894

<212> DNA

<213> NF-YA

<400> 33

atggaacaac tgggagaagg acaagcagtt gtggttggaa gtgctggagg aacagttcaa 60

gttgttcaaa tgggtcaagg aggtcaagca atgatgttac cacaagctat acaagtagca 120

gcaccaaatg gacaaataca agttgttcca gtatctagtt taactggtac aggtcaacaa 180

attgtaattc aacaaccaca aacacctcaa atcattcaaa ctccagatgg acaaacgtat 240

atttatcagc cagtacagtt agaaggtcaa gttcaacaag cacaacccac agtaattaat 300

atcaatggaa atcttatgca aattcctgga acagcatcac aaacaacaac cactgcagca 360

accacaacac cagtgcaacc tttagcaagc cctacagcaa cagcgtctca gatggtacca 420

ggaaatagtg gacagacgca gtttcaaagg gtagcattgc caaatgcaga agtttttgaa 480

gaagaacctt tatatgtaaa tgctaaacaa tataggcgta tattaaaacg tcgtcaagct 540

cgggctaaat tagaagctga aggaaaaata cctaaagaaa gaccaaaata tcttcatgaa 600

tctcgccatc gacacgcaat gaatagaatt cgtggtgaag gtggtagatt tcattctggt 660

caagtaaaga aaagaaatag aacaaacgaa aacgccatga ttacccagca catcacaact 720

tcgaccagca ctaataccgt tcgtactata gcaatagcag cagcaaatat aggtgtacag 780

tatcgcgaca cagataatat ggcctccaca attgttattg aaaaacaagg tattcctctt 840

caggatatga tctctgaaaa cgatattgtt acctcaaaca attgtttaat atag 894

<210> 34

<211> 690

<212> DNA

<213> NF-YB

<400> 34

atgtctattg ataagtgtat caaattggag atggaaaata gtggtgaaag tggtgacgat 60

ggaggacctt taggtccgac tgcgtttctt ggaggaggtg gtgtttctgc atcgtatatc 120

agtgtacagt ctgacgatat ggaagatgat cctgaaaata cagatgattc aaatcatggg 180

gcaagtgatc ctttgcaagg agctggaagt ggcagtgttg gagggcctct tcgtgaacaa 240

gatcgattcc ttccaatagc aaatgtagca aaaattatga aaagagcaat accagaagcg 300

ggaaaaatag caaaagatgc acgcgaatgt gttcaagaat gtgtatccga atttatatct 360

tttatcacat cagaagcaag tgatcgatgt catatggaaa aacgaaaaac tattaatggt 420

gaagatattc tatttgctat gacaactctt ggttttgaca attatgtaga accactaaaa 480

gtatatctac aaaaatatag agaagcaaca aaaggagaca atccaggtaa tgttccaaca 540

acaggcaatg gaaaaactga accacaagga actatatacg aagatcaatt atttgctatt 600

gctgcaactg catctagtgc taccacttct gatacacctg ttatatatag ttacacttcc 660

actgatcaaa tgcaatttca actttcttga 690

<210> 35

<211> 1041

<212> DNA

<213> NF-YC

<400> 35

atgtcggtat tcttcgtgaa tgctaatcaa gatagtgaag ttgaaggtga ttcaaatgga 60

gacttacaaa ttgcatcgcc tggtagttct gaagctcaac aaactttggc tcaattttgg 120

ccaaaagtta cagaagaaat taaaaaaatt actactatgg acttaaaaac acaatcattg 180

ccattagcaa ggataaaaaa aattatgaaa cttgatgatg atgttaaaat gataagtgca 240

gaagctccaa tgttattctc taaagcagca gaaattttta tacatgaatt aacattaaga 300

gcatgggttc atacagaaga taataaaaga cgtactcttc aaagaaatga tatagcaatg 360

gcaataacta agtatgatca atttgatttt ctaattgata tagtccctag agatgaattg 420

aaacaaagta aagcacagac tgaaagcact gtacgtactt ctatgaattc agatcaggta 480

cattactact ttcaattagc acaacaacaa gcttctgcca atcaaaatgt tcaaagtggt 540

aatgctacta cacaacccat acaaatagtg caaccgtcaa ctggacaaat acaaacaatt 600

aatattggta gtccagtaga acaggaaagc actactccaa atacagcaca gactgtaaca 660

gtacaaagtc cacaacaatc atcaggccaa caaattatac aattacaaca ggctcaacaa 720

acacctacaa cacaaactgg gggaatacaa attgtacaac aaattgtaac acctagtgga 780

gaaattcaac aaataccaat acaattaacg cctcaacaac ttcaaatgat tcgtatgcaa 840

gtacaaggtg gaagtaatca accaattata attcaaactg ctcctataca agctcaaccc 900

caattgatac aggttgcgca aggtgctcaa gcaccggtgt ttctacaaac tagcggaaca 960

gacaatgact ccacgaatat tttcatcgca acgaagagta acggaaggat gagtgcccta 1020

agcaggaaga ctaagagatg a 1041

Claims

1.NF-YA基因作为靶标在如下1）或2）中的应用：

1）调控蜜蜂在热激胁迫条件下的抗逆能力；

2）培育在热激胁迫条件下抗逆能力增强的蜜蜂品种；

所述NF-YA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。

2.特异性检测NF-YA基因的试剂在制备用于检测蜜蜂在热激胁迫下抗逆能力的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品采用实时荧光定量PCR方法检测NF-YA基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，实时荧光定量PCR检测NF-YA基因的产品中含有：

特异性检测NF-YA基因的引物对，其序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。

5.沉默NF-YA基因表达的试剂在构建热激胁迫下抗逆能力降低的蜜蜂模型中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用于扩增NF-YA基因沉默片段的引物序列分别如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。