CN115820564A

CN115820564A - 一种永生化鹿茸间充质干细胞及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115820564A
Application number: CN202211609888.XA
Authority: CN
Inventors: 彭英华; 陈泽; 孟德双; 庞鑫
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开一种永生化鹿茸间充质干细胞及其制备方法与应用，属于细胞永生化技术领域。为了解决鹿茸间充质干细胞在体外培养及应用中所面临的易分化、传代时间长、增殖速度慢等关键技术问题。本发明提供一种通过导入外源性人端粒酶反转录酶激活干细胞内端粒酶活性，使端粒长度保持恒定，增强细胞的增殖能力，延长维持干细胞特性的代数，从而实现鹿茸间充质干细胞永生化，通过细胞形态学鉴定、蛋白免疫印迹、细胞生长曲线、流式细胞术、三系分化等方法鉴定永生化鹿茸干细胞系的生物学特性。本发明同时提供了永生化鹿茸间充质干细胞可用于生产外泌体的一种新应用。

Description

一种永生化鹿茸间充质干细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于细胞永生化技术领域，具体涉及一种永生化鹿茸间充质干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

鹿茸干细胞外泌体在多种疾病、医美等方面具有显著的效果，具有广阔的应用前景，能稳定获得大量鹿茸外泌体是亟待解决的技术问题。在工厂化生产中，面临着原代干细胞体外培养寿命短、增殖慢、效率低等问题。获得稳定传代的鹿茸间充质干细胞是鹿茸干细胞研究中需要重点解决的问题。SV40T抗原慢病毒载体构建永生化鹿茸间充质干细胞系，但通过此方法建立的细胞系为非整倍体细胞，遗传稳定性差，细胞仅不同程度地保留了来源细胞的特性，细胞多发生恶性转变，具有致瘤的特点，存在安全隐患。

在原代细胞规模化应用过程中，采用转染原癌基因或端粒酶逆转录酶等方式获得永生化细胞是解决这一问题的可行性方法。通过转染端粒酶逆转录酶补偿细胞分裂时染色体末端的缩短；从而维持端粒的长度；进而避免细胞因端粒耗尽而出现凋亡，是永生化原代细胞的最有效的方式。开展鹿茸原代干细胞永生化研究是从根本上解决鹿茸干细胞的体外培养难题、保障规模化生产的关键。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种永生化的鹿茸间充质干细胞以及提高鹿茸间充质干细胞的遗传稳定性。解决鹿茸间充质干细胞在大规模体外培养及应用中所面临的寿命短、传代时间长、增殖速度慢等关键技术问题。

本发明提供一种永生化鹿茸间充质干细胞，将鹿茸间充质干细胞中过表达人端粒酶逆转录酶编码基因获得的鹿茸间充质干细胞。

本发明提供一种制备永生化鹿茸间充质干细胞的方法，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，将pBABE-hygro-hTERT，psPAX2和pMD2.G共转染人肾上皮细胞系获得慢病毒颗粒；

步骤2，将步骤1获得的慢病毒颗粒感染鹿茸间充质干细胞，获得永生化鹿茸间充质干细胞。

进一步地限定，步骤1中所述人肾上皮细胞系为HEK293T细胞。

进一步地限定，步骤1中转染细胞利用的是转染试剂lipo3000。

本发明提供一种永生化鹿茸间充质干细胞在生产外泌体中的应用。

进一步地限定，获得外泌体的方法如下：将权利要求1所述的鹿茸间充质干细胞，在37℃，5％ CO₂条件下培养，待细胞融合度达到70～80％，弃去上清，PBS洗涤3次，加入含10％无外泌体血清的DMEM-F12培养基，培养48h后收集鹿茸间充质干细胞培养上清至50mL离心管，收集上清液的条件为300g 10min收集上清，2000g 30min收集上清，10000g30min收集上清，上清过0.22μm滤器，120000g 2h弃去部分上清，留下约2mL液体，重悬外泌体并收集到离心管中，120000g 2h进一步浓缩，加入适量PBS重悬获得外泌体。

有益效果：本发明将通过对鹿茸间充质干细胞稳定转染人端粒酶逆转录酶的手段从而保证所获得外泌体的安全性及稳定性。将选择浸染能力强并可稳定整合于宿主基因组的慢病毒表达载体作为骨架载体，构建带潮霉素抗性基因的hTERT慢病毒表达载体，对其进行病毒包装，从而实现鹿茸间充质干细胞的永生化。开展该研究，将建立鹿茸干细胞体外培养模型，对深入揭示鹿茸生物学特性的分子机制具有重要意义并为外泌体工厂化生产提供稳定细胞系。

附图说明

图1为制备永生化鹿茸间充质干细胞的流程图；

图2为潮霉素最适浓度验证；

图3为重组慢病毒包装感染流程；

图4为永生化前后细胞的hTERT蛋白表达结果；

图5为永生化前后细胞形态；

图6为永生化细胞表面标志物鉴定。

图7为诱导永生化细胞三系分化；

图8为永生化前后细胞生长曲线。

具体实施方式

pBABE-hygro-hTERT(Addgene)是商业购买的。

实施例1.获得鹿茸间充质干细胞的方法

鹿茸干细胞分离培养

1.选择二杠鹿茸，在鹿茸快速生长期锯茸，切口向下、轻轻按压鹿茸枝干排出茸血，用锡纸包好置于冰盒中迅速带回实验室。

2.75％酒精淋洗鹿茸表面，截取鹿茸尖端5cm，倒置、轻轻按压进一步排出茸血。

3.将鹿茸尖端置于75％酒精中消毒5min，重复3次。

4.生理盐水洗涤5min，重复3次。

5.PBS(+1％青霉素，+1％链霉素)洗涤5min，重复3次，迅速转移至生物安全柜。

6.将鹿茸尖端组织纵向切片，剪去鹿茸皮肤和结缔组织，分离间充质层收集于1.5mL离心管中，用无菌剪刀剪成1-2mm³的组织块，转移到含有F12培养基(+10％FBS，+1％青霉素，+1％链霉素)的离心管中反复吹打，1000rpm/min离心5min，洗涤3次。

7.将洗涤后的组织块转移到培养皿中加入终浓度0.2％的Ⅱ型胶原酶(或终浓度0.2％Ⅰ型胶原酶，或Ⅰ型Ⅱ型混合胶原酶)，置于37℃培养箱中消化，每30min观察一次，待组织边缘模糊不清，用移液管轻轻吹打组织将上清转移至移液管中，1000rpm/min离心5min，弃上清，接种于T75培养瓶中，5％ CO₂ 37℃培养。待细胞生长至90％融合度，1：2或1：3传代。

实施例2.构建重组病毒

将慢病毒三质粒系统pBABE-hygro-hTERT，psPAX2和pMD2.G，分别转入DH5α感受态细胞进行大量扩增并进行高纯度无内毒素抽提质粒，目的是进行质粒的扩繁，通过转染试剂lipo3000共转染进入HEK293T细胞，以10cm板为例，在a管中加入500ul Opti-MEM培养基和24ul lipo3000，在b管中加入500ul Opti-MEM培养基，6ug pBABE-hygro-hTERT，4ugpsPAX2和2ug pMD2.G，5分钟后将b管液体缓慢加入a管中，轻柔混匀后室温静止15分钟，之后将混合液逐滴加入HEK293T细胞中。在转染结束6h后进行换液，并于第24h，48h，72h收集富含重组慢病毒颗粒的细胞上清液。

实施例3.构建永生化鹿茸间充质干细胞

慢病毒感染原代干细胞：取第四代鹿茸间充质干细胞扩增于6cm培养皿中，在细胞对数生长期时加入polybrene(聚凝胺，终浓度为8ug/ml)和实施例2获得的慢病毒颗粒的细胞上清液，分别在第24h，48h，72h进行转染，以增加感染效率。待干细胞生长到90％时，加入潮霉素(终浓度为200ug/ml)进行细胞筛选，未感染细胞将全部死亡，最终将获得转染成功的鹿茸干细胞。重组慢病毒包装感染流程如图3所示。

实施例4.潮霉素最适浓度验证

配制1mg/ml潮霉素溶液，溶剂为DMEM(+10％FBS，+1％青霉素+1％链霉素)将实施例3分离得到的MSC转入24孔板进行培养，待生长至70％进行换液，使得培养基中潮霉素终浓度分别为0ug/ml，100ug/ml，150ug/ml，200ug/ml，250ug/ml，300ug/ml。在第0h，24h，36h，48h，60h，72h时记录筛选情况，实验结果如图2。最终确定潮霉素筛选MSC的最适浓度为200ug/ml。

实施例5.获得外泌体的方法

利用实施例3获得的永生化间充质干细胞制备外泌体的方法：

取实施例3获得的形态、生长状态良好的鹿茸间充质干细胞，在37℃，5％ CO₂条件下培养，待细胞融合度达到70～80％，弃去上清，PBS洗涤3次，加入含10％无外泌体血清的DMEM-F12培养基，培养48h后收集鹿茸间充质干细胞培养上清至50mL离心管，300g 10min收集上清(去除死细胞)，2000g 30min收集上清(去除细胞碎片)，10000g30min收集上清(进一步去除细胞碎片)。上清过0.22μm滤器，去除粒径大于220nm的粒子。120000g 2h弃去部分上清，留下约2mL液体，充分吹打重悬外泌体并收集到离心管中，120000g 2h进一步浓缩，加入适量PBS重悬外泌体，充分吹打后收集、分装、置于-80℃冰箱保存。

原代鹿茸间充质干细胞一般可传5-7代，通过本方法制备的永生化鹿茸间充质干细胞可传至35代以上，在初始细胞数目相同的情况下，本方法制备的永生化鹿茸间充质干细胞所能提取到的外泌体粒子数是原代鹿茸间充质干细胞所能提取到的外泌体粒子数的1.3×10⁸倍以上。

利用以下实验验证实验效果：

感染干细胞中目的基因的表达：

通过western blot方法检测hTERT蛋白的表达情况，如图4。结果显示筛选得到的永生化鹿茸间充质干细胞成功表达hTERT基因。

永生化干细胞的鉴定：

通过观察其细胞形态、诱导三系分化、流式细胞术检测永生化干细胞是否依然具备鹿茸原代干细胞的特征，通过CCK8法检测细胞永生化后的生长曲线。

三系分化：

1)成骨诱导

1.接种细胞：6孔板接种1×10⁵cell/孔，待细胞生长至90-100％融合度换用成骨诱导培养基。

2.诱导分化：每3天更换一次成骨诱导培养基(见表1)，诱导2-3周，根据细胞钙结节情况和钙盐结晶析出情况终止。

表1成骨诱导培养基

3.染色：按照成骨细胞矿化结节染色试剂盒(碧云天)说明书操作。

2)成脂诱导

2.诱导分化：更换成脂诱导培养基(见表2)培养3天，再更换成脂维持培养基(见表3)培养3天，3个循环左右即可。

表2成脂诱导培养基

表3成脂维持培养基

3.染色：按照油红O染色试剂盒(索莱宝)说明书操作。

3)成软骨诱导

1.接种细胞：6孔板接种1×105cell/孔，待细胞生长至90-100％融合度换用成骨诱导培养基。

2.诱导分化：每3天更换一次成软骨诱导培养基(见表4)，诱导2-3周。

染色：按照阿利新蓝染色试剂盒(索莱宝)说明书操作。

表4成软骨诱导培养基

结果显示永生化前后的细胞形态无明显变化(如图5)，通过流式细胞术证明永生化后细胞仍保留干细胞特有的表面标志物CD44和CD90(如图6)，通过三系分化诱导证明永生化后细胞仍保留干细胞多项分化的潜能(如图7)，永生化前后的细胞生长曲线结果显示永生化后细胞生长速度较永生化前细胞生长速度快(如图8)。

Claims

1.一种永生化鹿茸间充质干细胞，其特征在于可体外传代35代以上并保持干细胞特性，增殖能力强，可用于生产鹿茸间充质干细胞外泌体。

2.一种制备永生化鹿茸间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤2，将步骤1获得的慢病毒颗粒感染鹿茸间充质干细胞，抗生素筛选，获得永生化鹿茸间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中所述人肾上皮细胞系为HEK293T细胞。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中转染利用的是转染试剂lipo3000。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中的感染细胞利用的试剂是聚凝胺。

6.权利要求1所述的永生化鹿茸间充质干细胞在生产外泌体中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，获得外泌体的方法如下：将权利要求1所述的永生化鹿茸间充质干细胞，待细胞融合度达到60～80％，弃去上清，PBS洗涤，加入含10％无外泌体血清的DMEM/F12培养基，培养24-48h后，收集鹿茸间充质干细胞上清液，过滤，超速离心2h，取沉淀产物，PBS重悬，获得外泌体。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，鹿茸间充质干细胞的培养条件为37℃，5％CO₂。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，收集上清液的条件为300g 10min收集上清，2000g 30min收集上清，10000g 30min收集上清。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，浓缩的条件为120000g，2h。