CN109852637B - 一种提高腺相关病毒转染效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高腺相关病毒转染效率的方法。本发明提供的提高腺相关病毒转染效率的方法，主要通过在细胞培养时，向营养液中添加细胞贴附因子，促进细胞贴壁，在转染过程中，选择pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP，三种质粒按质量比为2：2：1的比例加入到转染混合液中，极大的提高了转染效率。利用本发明提供的腺相关病毒转染方法，转染效率可以高达80％‑90％，提高了病毒转染的成功率，而且，该方法操作简单，大大节约了实验成本。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种提高腺腺相关病毒转染效率的方法。
背景技术
大约五十年前，科学家假设，外源DNA的遗传修饰可能对遗传性人类疾病的治疗有效。基因疗法通过将遗传物质导入细胞补偿或纠正异常基因，引入的正常基因拷贝能够帮助恢复必需蛋白质的功能。这种“基因治疗”策略为后续研究提供了理论基础，即通过一次治疗就可以获得持久且有效的临床治疗。这基因治疗种技术已从构想中来到了现实，那就是重组腺相关病毒(AAV)基因治疗技术，其具有安全性、有效性、特异性等多种优势，目前作为第一个已被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市了。
目前AAV生产主要的方法为三质粒转染293T细胞方法，其操作简单、快速，但AAV包装颗粒量低产，这大大限制了AAV规模化生产。因此，开发一种提高AAV产量的生产工艺技术，是目前取得大规模AAV生产技术关键之一。而现在病毒的转染效率太低，一般不高于50％，造成了对实验材料的大量浪费。
中国专利申请CN108893493A公开了一种提升NK细胞转染效率的方法。该方法是对NK细胞进行两次慢病毒感染，第一次感染时加入包含CAR的慢病毒载体的同时加入助感染剂1，第二次感染时加入包含CAR的慢病毒载体的同时加入助感染剂2、助感染剂3和助感染剂4；所述助感染剂1为含有聚凝胺溶液；所述助感染剂2为含有IL2的溶液；所述助感染剂3为含有IL12的溶液；所述助感染剂4为含有PHA的溶液。该方法虽然将转染率提升至50％-60％，但是，这个转染效率仍然较低，而且，仅适用于慢病毒，适用范围较窄。
综上可知，现有技术中病毒的转染方法中，普遍存在转染效率低，适用范围窄，浪费材料，成本高的缺点。
发明内容
针对现有技术中存在的缺点，本发明的目的是提供一种提高腺相关病毒转染效率的方法，该方法适用于腺相关病毒的9种血清型，适用范围广，而且转染效率可以达到80％以上，大大节约了成本。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种提高腺相关病毒转染效率的方法，包括如下步骤：
S1、细胞培养：将细胞复苏至T75放瓶中，使用含8％～10％牛血清及细胞贴附因子的营养液培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，接种入10～20cm平皿进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO2培养箱的培养参数，培养20-28h，细胞汇合率达到80％～90％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15～25mL含牛血清DMEM培养基，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放在含牛血清的营养液中孵育20～28h，然后取出放在CO2培养箱中，设置好孵育的培养参数，培养20～28h，弃掉上清液，加入无血清DMEM培养液，设置孵育后的培养参数，进行孵育培养40-55h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、转染后观察：将步骤S3所得含腺相关病毒的混合液于1000-1500r/min的速度下离心1～10min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，同时使用流式细胞仪进行细胞转染率测定，即可。
进一步地，所述步骤S1中的细胞贴附因子由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按质量比3：7：4组成。
进一步地，所述步骤S1中细胞培养参数为接种密度在0.8×106～1.2×106个/mL；所述CO2培养箱的培养参数为温度35～38℃，CO2浓度为3～7％。
进一步地，所述步骤S2中所述含腺相关病毒的转染混合液中的血清类型为1～9。
进一步地，所述步骤S2含牛血清的DMEM培养基中牛血清的质量浓度为1％～50％。
进一步地，所述步骤S2中含腺相关病毒的转染混合液中包含包装腺相关病毒的三种质粒，三种质粒分别为pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP，三种质粒的总质量为10～30μg，且三者的质量比为2：2：1。
进一步地，所述步骤S2所述含腺相关病毒的转染混合液的制备方法为：将包装腺相关病毒的三种质粒、无菌水和CaCl2溶液混合并定容到624μL，将等体积2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀，并常温静止放置1～10min，即得。
进一步地，所述CaCl2溶液为CaCl2水溶液，且CaCl2水溶液的浓度为2mol/L，加入量为10μL～100μL；所述2×HBS盐溶液的pH值为6.0～7.5。
进一步地，所述步骤S3中进行孵育培养时设置的孵育参数为温度30～37℃，CO2浓度为3～7％。
进一步地，所述步骤S3中孵育后的培养参数为温度36～38℃，CO2浓度为5％。
与现有技术相比，本发明提供的提高腺相关病毒转染效率的方法，具有以下优点：
(1)本发明提供的提高腺相关病毒转染效率的方法，加入细胞贴附因子，不仅促进细胞贴壁，还可以为细胞生长提供营养物质；
(2)本发明提供的提高腺相关病毒转染效率的方法，进行了大量试验，最终将pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP三种质粒按2：2：1的比例混合，极大地提高了病毒的转染效率；
(3)本发明提供的提高腺相关病毒转染效率的方法，经过多次尝试，最终将病毒的转染效率提升至80％以上，不仅节约了大量材料，而且制备方法简单，适用范围广，极大地节约了成本。
附图说明
图1为腺相关病毒1-9型血清转染率柱状图；
图2为本发明与常规方法的转染效果对比图；
图3为本发明与常规方法的转染率对比曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
实施例1一种提高腺相关病毒转染效率的方法
所述提高腺相关病毒转染效率的方法，包括如下步骤：
S1、细胞培养：
细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含有10％牛血清，质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO3溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的DMEM培养液中，混合均匀，于1000r/min的条件下离心1min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述培养液，放入CO2细胞培养箱中，于35℃条件下静置培养；
T75细胞瓶传代培养：将T75细胞瓶用PBS缓冲液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含8％牛血清2mL及由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按质量比3：7：4组成的细胞贴附因子10g的Gibco DMEM营养液培养3代后，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，在35℃，3％的CO2浓度的培养箱中培养，重复上述操作，培养三代，细胞活率能够稳定维持在95％，用PBS溶液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含8％牛血清2mL及由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按3：7：4组成的细胞贴附因子10g的Gibco DMEM营养液，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取2.0×107个细胞，接入10cm平皿，加入含10％牛血清的DMEM培养液20mL，细胞密度为8×105个/mL，培养20h，细胞汇合率达到80％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：
含腺相关病毒的转染混合液的配制：将质粒pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP按质量比为2：2：1的比例混合成10μg，浓度2mol/L的CaCl2水溶液10μL，加无菌水定容至624μL，然后逐滴加入pH值为6.0的2×HBS盐溶液624μL，轻弹管壁，混合均匀，常温静置1～10min，即得。
将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15mL含1％的牛血清的DMEM培养基20mL，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：
将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，设置温度30℃，CO2浓度为3％的条件培养20h，弃掉10cm平皿的全部上清液，加入无血清的DMEM培养液，进行孵育培养40h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、转染后观察：将步骤S3所得含腺相关病毒的混合液于1000r/min的速度下离心1min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，使用流式细胞仪测定其转染率为83％。
实施例2一种提高腺相关病毒转染效率的方法
所述提高腺相关病毒转染效率的方法，包括如下步骤：
S1、细胞培养：
细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含有10％牛血清，质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO3溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的DMEM培养液中，混合均匀，于1500r/min的条件下离心10min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述培养液，放入CO2细胞培养箱中，于35℃条件下静置培养；
T75细胞瓶传代培养：将T75细胞瓶用PBS缓冲液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含10％牛血清2mL及由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按质量比3：7：4组成的细胞贴附因子10g的Gibco DMEM营养液培养3代后，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，在38℃，7％的CO2浓度的培养箱中培养，重复上述操作，培养三代，细胞活率能够稳定维持在100％，用PBS溶液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含10％牛血清及由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按3：7：4组成的细胞贴附因子10g的Gibco DMEM营养液，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取2.0×107个细胞，接入15cm的平皿，加入含10％牛血清的DMEM培养液至20mL，细胞密度为1.2×106个/mL，培养28h，细胞汇合率达到90％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：
含腺相关病毒的转染混合液的配制：将质粒pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP按质量比为2：2：1的比例混合成30μg，浓度为2mol/L的CaCl2水溶液100μL，加无菌水定容至624μL，然后逐滴加入pH值为7.5的2×HBS盐溶液624μL，轻弹管壁，混合均匀，常温静置10min，即得。
将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入25mL含50％的牛血清的DMEM培养基20mL，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：
将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，设置温度38℃，CO2浓度为7％的条件培养28h，弃掉15cm平皿的全部上清液，加入无血清的DMEM培养液，进行孵育培养55h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、转染后观察：将步骤S3所得含腺相关病毒的混合液于1500r/min的速度下离心10min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，，使用流式细胞仪测定其转染率达87％。
实施例3一种提高腺相关病毒转染效率的方法
所述提高腺相关病毒转染效率的方法，包括如下步骤：
S1、细胞培养：
细胞复苏：取一支来源于ATCC，可传代的冻存的293T细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，然后加入到10mL的含有10％牛血清，质量浓度为0.3g/L谷氨酰胺溶液、摩尔浓度为0.01mol/L的NaHCO3溶液及质量浓度为0.1mg/mL的硫酸卡那霉素各0.1mL，100000IU青霉素0.1g、pH值为7.0的DMEM培养液中，混合均匀，于1300r/min的条件下离心5min，去掉上清液，再加入10mL上述培养液重悬细胞，将重悬好的细胞接入T75的细胞瓶中，再补加10mL上述培养液，放入CO2细胞培养箱中，于35℃条件下静置培养；
T75细胞瓶传代培养：将T75细胞瓶用PBS缓冲液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含9％牛血清2mL及由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按3：7：4组成的细胞贴附因子10g的Gibco DMEM营养液培养3代后，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分装于三个T75规格细胞培养瓶内，在37℃，5％的CO2浓度的培养箱中培养，重复上述操作，培养三代，细胞活率能够稳定维持在95％，用PBS溶液清洗两遍，加入2.5％胰蛋白酶及0.02％的EDTA细胞消化液1mL，1min后加入含9％牛血清及由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按质量比3：7：4组成的细胞贴附因子10g的Gibco DMEM营养液，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液，分别取样进行镜检和使用细胞计数仪进行细胞计数，取2.0×107个细胞，接入12cm平皿，加入含9％牛血清的DMEM补到20mL，细胞密度为1.0×106个/mL，培养24h，细胞汇合率达到85％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：
含腺相关病毒的转染混合液的配制：将质粒pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP按质量比为2：2：1的比例混合成20μg，浓度2mol/L的CaCl2水溶液50μL，加无菌水定容至624μL，然后逐滴加入pH值为6.8的2×HBS盐溶液624μL，轻弹管壁，混合均匀，常温静置5min，即得。
将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入20mL，含25％的牛血清的DMEM培养基20mL，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：
将步骤S2所得转染混悬液放在CO2培养箱中，设置温度36℃，CO2浓度为5％的条件培养24h，弃掉12cm平皿的全部上清液，加入无血清的DMEM培养液，进行孵育培养48h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、转染后观察：将步骤S3所得含腺相关病毒的混合液于1300r/min的速度下离心5min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，使用流式细胞仪测定转染率达90％左右，腺相关病毒I-IX型血清具体的转染率见图1。
对比例1一种提高腺相关病毒转染效率的方法
所述提高腺相关病毒转染效率的方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例1中的步骤S1细胞培养时的T75细胞瓶传代培养过程中，在加营养液进行3代培养时，营养液中未添加细胞贴附因子。
对比例2一种提高腺相关病毒转染效率的方法
所述提高腺相关病毒转染效率的方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例2中的步骤S2将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞时，配制转染混合液时质粒pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP按质量比为1：1：1的比例混合成20μg。
试验例1本发明试验样品转染效率对比
1.试验样品：腺相关病毒II型血清。
2.试验方法：以实施例1-3及对比例1-2所述的提高腺相关病毒的方法转染腺相关病毒II型血清，然后利用流式细胞仪检测腺相关病毒的转染效率。
3.具体的实验结果见表1。
表1不同试验样品的转染效率对比
| 组别 | 转染效率/％ |
| 实施例1 | 82％ |
| 实施例2 | 85％ |
| 实施例3 | 90％ |
| 对比例1 | 58％ |
| 对比例2 | 63％ |
由表1可知，采用本发明实施例1-3的方法的细胞转染效率均在80％以上，尤其实施例3的转染率高达90％，因此，实施例3为本发明的最佳实施例。而用对比例1-2的方法时，转染效率仅在60％左右，显著低于采用实施例3的方法时的转染效率，这说明质粒的选择及促进细胞贴壁对转染效率有显著影响。
试验例2与常规方法的转染效率对比
1.试验样品：腺相关病毒I-IX型血清。
2.试验方法：以本发明实施例3的方法及常规稳定转染方法转染I-IX型腺相关病毒血清，转染后分别利用普通光学显微镜，荧光显微镜及扫描电子显微镜观察转染效果，并利用流式细胞仪检测转染效率。
3.试验结果：转染效果具体见图1，由图1可知，本发明实施例3的转染效果显著高于常规稳定转染方法，进一步结合转染效率(具体结果见图2、图3)，可知，9种血清中，本发明的转染效率均高于常规方法，二者的转染效率最大差值达到70％左右。
最后应当说明的是，上文中已经对本技术及具体实施方案作了详尽的描述，但是本发明并不局限于以上描述的具体实施例。因此本领域的任何技术人员在不偏离本发明精神的基础对之作一些改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、细胞培养：将细胞复苏至T75方瓶中，使用含8％～10％牛血清及细胞贴附因子的营养液培养3代后，收获细胞状态较好的293T悬浮细胞，接种入10～20cm平皿进行培养，达到规定的细胞培养参数后，放入培养箱，设置好CO2培养箱的培养参数，培养20-28h，细胞汇合率达到80％～90％，得含贴壁细胞的混合液；
S2、将腺相关病毒三质粒转染入293T细胞：去掉步骤S1所得含贴壁细胞的混合液中的上清液，贴壁缓慢加入15～25mL含牛血清的DMEM培养液，然后混匀，逐滴加入含腺相关病毒的转染混合液，轻轻摇晃混匀，得转染混悬液；
S3、293T细胞的孵育培养：将步骤S2所得转染混悬液放在含牛血清的营养液中孵育20～28h，然后取出放在CO2培养箱中，设置好孵育的培养参数，培养20～28h，弃掉上清液，加入无血清DMEM培养液，设置孵育后的培养参数，进行孵育培养40-55h，得含腺相关病毒的混合液；
S4、转染后观察：将步骤S3所得含腺相关病毒的混合液于1000-1500r/min的速度下离心1～10min，收集细胞，在荧光显微镜下观察，同时使用流式细胞仪进行细胞转染率测定，即可；
所述步骤S1中的细胞贴附因子由E-钙粘蛋白，III型胶原及多聚赖氨酸按质量比3：7：4组成；所述步骤S2中含腺相关病毒的转染混合液中包含包装腺相关病毒的三种质粒，三种质粒分别为pDeltaF6、pRep2Cap2及rAAV2EGFP，三种质粒的总质量为10～30μg，且三者的质量比为2：2：1。
2.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S1中的细胞培养参数为接种密度在0.8×106～1.2×106个/mL；所述CO2培养箱的培养参数为温度35～38℃，CO2浓度为3～7％。
3.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，步骤S2中所述含腺相关病毒的转染混合液中的血清类型可以为1~9型中的任意一种。
4.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S2含牛血清的DMEM培养基中牛血清的质量浓度为1％～50％。
5.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S2所述含腺相关病毒的转染混合液的制备方法为：将包装腺相关病毒的三种质粒、无菌水和CaCl2溶液混合并定容到624μL，将等体积2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀，并常温静止放置1～10min，即得。
6.如权利要求5所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述CaCl2溶液为CaCl2水溶液，且CaCl2水溶液的浓度为2mol/L，加入量为10μL～100μL；所述2×HBS盐溶液的pH值为6 .0～7.5。
7.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S3中进行孵育培养时设置的孵育参数为温度30～37℃，CO2浓度为3～7％。
8.如权利要求1所述的提高腺相关病毒转染效率的方法，其特征在于，所述步骤S3中孵育后的培养参数为温度36～38℃，CO2浓度为5％。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101080488A (zh) * | 2004-11-03 | 2007-11-28 | 因特罗根治疗公司 | 生产和纯化腺病毒载体的新方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002014526A2 (en) * | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Neurologix, Inc. | Replication competent aav helper functions |
| CN102618507B (zh) * | 2012-03-23 | 2015-04-22 | 首都医科大学 | 增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用 |
| CN106701691B (zh) * | 2015-11-19 | 2020-02-14 | 爱康得生物医学技术（苏州）有限公司 | 一种可高效感染免疫细胞的aav病毒及其制备方法与应用 |
| CN107142279A (zh) * | 2017-05-12 | 2017-09-08 | 山东维真生物科技有限公司 | 一种aav6型腺相关病毒体外高效感染t细胞的方法 |
| CN108300696A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-07-20 | 浙江大学 | 脑组织皮层区原代神经元培养并用腺相关病毒转染的方法 |
-
2019
- 2019-01-30 CN CN201910094162.9A patent/CN109852637B/zh active Active
Patent Citations (1)
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| CN101080488A (zh) * | 2004-11-03 | 2007-11-28 | 因特罗根治疗公司 | 生产和纯化腺病毒载体的新方法 |
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|---|---|
| CN109852637A (zh) | 2019-06-07 |
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